美国国家科学院院刊。2000年11月7日；97(23): 12519–12523.
CCAAT的顺序抑制和激活脂肪生成过程中增强子结合蛋白-α（C/EBPα）基因
约翰霍普金斯大学生物化学系医学院，马里兰州巴尔的摩21205
*重印请求的收件人：约翰·霍普金斯大学医学院生物化学，北沃尔夫街725号伍德基础科学大厦512室，马里兰州巴尔的摩，邮编21205。电子邮件：ude.imhj@enald. 作者：M.Daniel Lane
摘要
CCAAT增强子结合蛋白-α（C/EBPα）作为脂肪细胞基因的多效性转录激活物脂肪生成。核因子C/EBP未分化蛋白（CUP），一种激活蛋白-2α（AP-2α）的同型，与抑制性C/EBPα基因启动子中的元件，使基因沉默直至晚期在差异化计划中。CUP监管元素与启动子中的Sp（GT-box）元件，Sp3（或Sp1）可以与之结合。Sp3或Sp1与CUP/AP2-α的结合是互斥的。Sp3是一个C/EBPα基因启动子的强转录激活子3T3-L1前脂肪细胞和施耐德细胞，这种激活是被CUP/AP-2α抑制。Sp3贯穿始终分化，而CUP/AP-2α仅表达于前脂肪细胞在分化过程中下调，与C/EBPα基因的转录。因此，CUP/AP-2α延迟了访问将Sp3转移到Sp调节元件，防止C/EBPα，从而受到C/EBP抗有丝分裂），有丝分裂克隆扩增，是差异化计划。
关键词：3T3-L1脂肪细胞，CEBPα未分化蛋白质、AP-2、Sp1、Sp3
脂肪细胞期间分化，CCAAT增强子结合蛋白-α（C/EBPα）协同激活导致脂肪细胞表型(1–三). C/EBPα基因本身是在这些基因表达之前被转录激活(4). C/EBPα基因转录调控的研究在分化过程中近端启动子中的顺调控元件(5)和核能与这些元素相互作用的因素(6–8). 站点定向C/EBPα基因启动子的突变表明这些元素具有抑制作用并结合核蛋白，即C/EBP未分化蛋白（CUP）通过前脂肪细胞，但不通过脂肪细胞(9,10). 胰蛋白酶的测序从纯化的CUP中提取的肽表明它是转录因子激活蛋白-2α（AP-2α）(7). 一致在抑制作用下，AP-2α下调的动力学蛋白质和CUP结合活性与C/EBPα基因的转录激活(6,7).此外，与3T3-L1脂肪细胞的共转染实验表达C/EBPα，确定CUP/AP-2α抑制C/EBPα启动子转录-报告转基因。这些研究结果表明CUP/AP-2α是一种功能性阻遏物早期脂肪细胞分化计划预防早产C/EBPα基因的表达。因为C/EBPα抗有丝分裂，其表达必须延迟到有丝分裂克隆后来在差异化计划中出现了扩张。它应该强调有丝分裂克隆扩增是脂肪细胞分化(1,2,11,12).
我们现在报告C/EBPα基因与功能性Sp（GT-box）结合位点重叠。有证据表明，在脂肪细胞的早期阶段CUP/AP-2α的分化、表达延迟了Sp3的进入（或Sp1）到Sp结合位点，从而转录C/EBPα基因的激活。
实验程序
人重组AP-2α和Sp1来自Promega。兔子抗人AP-2（抗hAP-2）、抗Sp1和抗Sp3抗体，以及Sp1[（胸苷激酶（tk）]共有、AP-2共有和AP-2突变寡核苷酸来自Santa Cruz Biotechnology。巨细胞病毒（CMV）-hAP-2α（PCMX-L1-hAP-2α）由R提供。Buettner（德国雷根斯堡大学）和CMV-Sp3G.Suske（马尔堡菲利普斯大学，德国）。通过以下方法从质粒pCMX-L1-hAP-2α制备PCR-hAP-2α用5′-TGATCAGAATCCATCCGTTCACGCCGATCCATG-3′和5′-TGATCTCGAGAGCAGCAGTAGCAG-3′引物。PCR-扩增hAP-2αcDNA克隆到pCR2.1（Invitrogen）中。构建了PacUhAP-2α通过亚克隆hAP-2α插入物（通过消化pCR-hAP-2αBcl公司我和Xho公司一） 到pPacU（通过消化从PacUSp3中提取巴姆HI和Xho公司一） ，昆虫细胞表达载体，包含黑腹果蝇肌动蛋白5C启动子和5′端超胸椎前导序列(13).
细胞培养和分化。
3T3-L1前脂肪细胞在含有10%（vol/vol）小牛血清。两天后（指定日期0）诱导细胞分化(14)含10%DMEM（vol/vol）FBS，每毫升1μg胰岛素，1μM地塞米松，和0.5 mM 3α-异丁基-1-甲基黄嘌呤直到第2天。当时的细胞喂食补充10%FBS和1μg/ml胰岛素的DMEM 2天，之后每隔一天用含有10%FBS.脂肪细胞基因的表达和获取脂肪细胞表型从第3天开始，到第8天达到最大。D。黑腹食肉动物施耐德SL2细胞在室温下生长补充10%的施耐德昆虫培养基（GIBCO）热失活FCS。
电泳迁移分析（EMSA）。
EMSA的执行如前所述(10). 为了竞争实验表明，未标记竞争物寡核苷酸的含量超过50倍在添加标记的寡核苷酸之前添加。DNA–蛋白质开始进行复杂的解离实验（在先前形成之后蛋白质标记的寡核苷酸复合物）未标记的寡核苷酸。序列（斜线表示小鼠EF位点寡核苷酸的定界连接序列C/EBPα启动子是5′-关贸总协定/−256CAGC公司GCCGCC公司GGG公司GTGGG公司GCTGA公司−234-3′（粗体表示CUP绑定位置，并在GT-box下划线）。EF-MC结合位点寡核苷酸（5′-GATC/CAGCGTTTAAA公司GGGTGGGCTGA-3′）包含突变的CUP结合位点；EF-MG结合位点寡核苷酸（5′-GATC/CAGCGCCGGATGCAT公司GCTGA-3′）包含突变的Sp-GT-box结合位点。共识的顺序野生型（wt）和突变型AP-2结合位点寡核苷酸5′-GATCGAACTGACCGCCCGCGGCCCCGT-3′和5′-GATCGAACTGCGCTT公司GCGGCCCCGT-3′。序列Sp-tk共识结合位点的寡核苷酸是5′-ATTCGATCGGGGCGGGGCGAG-3′。核提取物由如前所述修改NUN协议(10). 蛋白质复合物通过荧光成像仪（富士胶片）在线性响应范围。
转染和荧光素酶检测。
50%融合的3T3-L1前脂肪细胞是暂时的共转染（磷酸钙沉淀法；参考15)带0.5含343bp的5′-侧翼启动子-报告子结构μg序列和整个5′-非翻译区（UTR）pGL3-BA萤光素酶中的C/EBPα基因或无启动子向量(10)，与CMV-hAP-2α表达载体一起表达式向量(16)或缺少插入的控制矢量。之后培养48小时后，制备细胞提取物并对其进行分析荧光素酶活性。果蝇属SL2细胞被镀入密度为1×10的6厘米盘子6细胞/培养皿转染前一天。D。黑腹食肉动物将PacUSp1瞬时转染SL2细胞，使用磷酸钙的PacUSp3、PacUAP2和PacU所述共沉淀法(16,17). 细胞被刮除转染后48小时培养皿，沉淀5分钟500 ×克，在5 ml冷PBS中清洗，以及重新离心。将细胞颗粒重新悬浮在0.5 ml裂解缓冲液中。离心后，测定上清液中的荧光素酶活性。
结果
中重叠的Sp和CUP/AP-2结合位点C/EBPα基因启动子。
以前(5)，我们观察到3T3-L1的核提取物前脂肪细胞在核苷酸−252和C/EBPα启动子中的核苷酸−239。核因素负责足迹（简称CUP）的人员被确定为转录因子AP-2α(7). 如DNase I保护所示（图。 赖特)该地区AP-2α的足迹与相邻的GT-box重叠（核苷酸−246至−239）。其他人的研究(18,19)显示了转录因子的Sp家族与某些GT-boxes结合。那重组Sp1定位于C/EBPα启动子中的GT-box（核苷酸−246至−234）在图中得到验证。 左侧.此外，很明显，该足迹与rAP-2α重叠。这些发现预测AP-2α结合将干扰由Sp家族成员绑定。
C/EBPα启动子与rSp1和rAP2.A 204-bpSma公司我-史蒂I片段C/EBPα启动子(5)用指定量的rSp1或rAP-2α，然后用DNase I消化右侧表示足迹序列。
含有重叠AP-2α和Sp结合位点。
描述与相邻GT盒结合的核因子对于启动子中的CUP/AP-2α调节元件，EMSA是用寡核苷酸探针（称为EF）进行检测包含GT-box和AP-2α结合位点。EF是使用3T3-L1前脂肪细胞的核提取物进行EMSA，或脂肪细胞。三种蛋白质-寡核苷酸复合物，即S1，用前脂肪细胞核检测S2和CUP/AP-2提取物（第0天），其中两种，即S1和S2，在分化为脂肪细胞（第8天）（图。A类). 与之前一致调查结果(6,7)，CUP/AP2-DNA复合物的形成是在分化过程中下调。为了验证结合，两个其他寡核苷酸与突变的CUP结合位点（EF-MC）或突变的GT-box（EF-MG）也受到EMSA的影响前脂肪细胞的核提取物。只有S1和S2复合体用EF-MC检测到（图。B类，泳道3）。这个CUP/AP-2复合物仅与EF-MG（寡核苷酸）形成带有突变GT-box（图。B类，车道1）。
含有CUP的wt和突变寡核苷酸的EMSA-和/或Sp-（GT-box）与前脂肪细胞和脂肪细胞的结合位点核提取物。(A类)32P端标记EF含有CUP-和Sp-（GT-box）结合位点的寡核苷酸C/EBPα基因启动子（核苷酸−258到−234）为用10μg 3T3-L1前脂肪细胞核提取物培养（第0天）或脂肪细胞（第8天）。(B类)重量32P末端标记的EF寡核苷酸（EF）CUP结合位点（EF-MC）突变或EF寡核苷酸突变在GT-box中与10μg来自3T3-L1前脂肪细胞。(C类)wt和突变体的影响竞争性寡核苷酸和抗AP2、-Sp1和/或-Sp3带有前脂肪细胞核提取物的EMSA抗体。Pi表示免疫前血清。EMSA使用32P端标记EF探查。箭头（←←）表示超换档的位置DNA-蛋白质复合物。
用未标记的寡核苷酸进行竞争实验对应于wt和突变的AP2共识序列以及tk大多数Sp家族成员绑定的Sp共识序列(18,19). 作为（图。 A类和B类)，核提取物前脂肪细胞产生三种蛋白质-DNA复合物，S1、S2和带EF-寡核苷酸探针的CUP/AP-2（图。C类,车道1）。竞争的是CUP/AP-2复合物，而不是S1或S2通过与AP-2一致序列对应的寡核苷酸清除寡核苷酸（图。C类，车道2），但不是由变异的AP-2（AP2 M）寡核苷酸（图。C类，车道3）。S1和S2被tk-Sp一致序列寡核苷酸竞争（图。C类，车道4）。
抗AP-2α抗体完全消除（超转移）CUP/AP-2蛋白-寡核苷酸复合物（图。C类,通道6），而针对Sp1的抗体去除了大部分S1蛋白质-寡核苷酸复合物，表明S1主要是由于至Sp1（图。C类，车道8）。S2，对应于由Sp3的“短形式”形成的复合物(20)，仅被废除通过抗Sp3抗体（图。C类，泳道7和9）；S1，其中对应于Sp3的“长形式”，而Sp1仅通过抗Sp3抗体部分去除（图。C类，车道7）。同时，抗Sp1、Sp3和AP-2α的抗体完全熄灭所有三个复合物（图。C类，车道9）。
因为C/EBPα基因中的Sp和AP-2结合位点启动子重叠（图。)，似乎AP-2α和Sp家族的成员，尤其是Sp3和Sp1，将相互排斥。因为EMSA（如上）是用“过量”的寡核苷酸进行的探针，CUP/AP-2α与Sp3或Sp1之间的竞争不会已检测到。因此，EMSA也使用标记EF探针的“极限”浓度。要确定AP-2α是否干扰Sp1的结合，rAP-2α的影响通过EMSA评估rSp1与EF探针的结合。增加的rAP-2α的浓度降低了rSp1的结合（图。A类). 因为rSp3是不可用，Sp3在Schneider细胞（SL2）中过度表达不表达Sp3、Sp1或AP-2α(16,21,22),和核能这些细胞的提取物被用作Sp3的来源。增加的rAP-2α的浓度降低了Sp3的结合（图。B类). 因为完全分化的脂肪细胞表达也使用了脂肪细胞核提取物Sp1和Sp3，但不使用AP-2α作为Sp1和Sp3的来源。如图所示。C类，车道3，rAP-2α竞争Sp1和Sp3。
rAP2对rSp1和Sp3与寡核苷酸结合的影响（EF）包含重叠的CUP/AP2-和Sp-（GT-box）结合地点。EMSA通过使用32P端标记EF含有CUP-和Sp-（GT-box）结合位点的寡核苷酸C/EBPα基因启动子（核苷酸−258至−234）。(A类)rSp1与rAP2水平增加一起孵育。(B类)施耐德细胞核提取物（SL2-NE）含有Sp3孵育时rAP2水平增加。（C） 3T3-L1脂肪细胞核提取物（Ad-NE）在存在或不存在rAP2.快速移动的AP-2–寡核苷酸复合物是由于rAP-2蛋白水解产物(7).
很明显，AP-2α与EF结合非常紧密寡核苷酸，甚至很难与复合物竞争Sp1或Sp3水平较高（结果未显示）。这个观察结果与这些因素来自各自的EF复合物。这些的比较EMSA的“表观”速率是可能的，因为其EF复合物中的AP-2α非常缓慢。如图所示。，Sp3或标记EF复合物中的Sp3和Sp1相对于CUP/AP-2α的位移非常缓慢。它应该认识到这些分离率代表低估，特别是对于Sp，因为Sp的大量分离EMSA期间发生。然而，很明显，Sp3和Sp1与AP-2α相比，与EF探针分离的速度更快。这个这些利率的差异与更严格的约束是一致的AP-2α比Sp。鉴于CUP/AP-2α的紧密性绑定时，Sp3和/或Sp1可能可以访问GT-box只有在表达CUP/AP-2α在分化后期下调程序。
AP-2α、Sp3、，和Sp1来自含有CUP/AP2-和Sp-binding站点。(A类)32P端标记EF含有CUP/AP2-和Sp-（GT-box）结合的寡核苷酸C/EBPα基因启动子的位点（核苷酸−258到−234）在4°C下与10μg 3T3-L1前脂肪细胞孵育15分钟核提取物，然后在指定的时间内，使用MIN（分钟）之前50倍的未标记EF寡核苷酸EMSA。凝胶通过荧光成像进行分析。破折号（–）表示32P-end标记的EF，无未标记的竞争对手寡核苷酸；EF表示添加了50倍的未标记EF前寡核苷酸32P末端标记的EF寡核苷酸。(B类)定量磷光成像的图形表示结果来自A类以上。
Sp3和Sp1对C/EBPα启动子的反激活作用被AP-2α阻断。
确定Sp3或Sp1与AP-2α之间的竞争可以完整地观察到CUP和Sp位点的结合细胞,我们研究了Sps和AP-2α对3T3-L1中C/EBPα启动子介导的转录前脂肪细胞和in果蝇属施耐德细胞（SL2）。A类468-bp C/EBPα启动子荧光素酶报告基因(10)同时含有GT-box和CUP结合位点的基因被转染到3T3-L1前脂肪细胞和SL2细胞以及Sp3和/或AP-2α表达载体。在3T3-L1前脂肪细胞中，Sp3反式激活报告基因表达约为4倍，而AP-2α无影响（图。A类). 然而，当与AP-2α共转染后，Sp3的反式激活被完全激活废除的。两种转录因子对无启动子载体。
Sp3和Sp3对C/EBPα启动子报告基因的反激活AP-2α。细胞与C/EBPα共转染带有或不带有Sp3的启动子报告基因或无启动子基因和/或AP-2α表达载体。制备细胞裂解物转染48h后检测荧光素酶活性。(A类)转染3T3-L1前脂肪细胞或(B类)转染Schneider SL2
因为包括3T3-L1前脂肪细胞在内的大多数脊椎动物细胞类型，表达一些Sp1、Sp3和AP-2α，检测转染这些转录因子受到影响。果蝇属SL2细胞缺乏这些因子(16,21,22),被用来规避这个问题。如图所示。B类,在SL2细胞中，Sp3的反式激活（约16倍）要高得多3T3-L1前脂肪细胞（图。A类). 鉴于C/EBPα启动子介导的反式激活与无论是Sp3还是Sp1，Sp3的转录激活都大大大于由Sp1提供。与3T3-L1细胞的情况一样，AP-2α显著增加被Sp3或Sp1抑制的转录激活。这些结果是与上述结合研究一致（图。)和显示AP-2α通过抑制完整细胞中C/EBPα启动子的反式激活。
期间Sp3、AP-2α和C/EBPα的表达动力学脂肪细胞分化。
被认为与C/EBPα基因的抑制/去抑制激活在分化过程中进行比较。CUP/AP-2α，一种阻遏物C/EBPα基因(7)，在有丝分裂克隆扩增，即在第0天和第2天之间(11)的微分程序（图。). 作为AP-2α在第2天开始下降，C/EBPα的表达已激活。而Sp3（和Sp1，未显示）的表达在这个关键时期（第2-6天）没有显著变化Sp3/AP-2α表达比率偏移（图。). 想必，在CUP站点腾空之前，Sp3（或Sp1）不会激活通过AP-2α，因为Sp3或Sp1不能与AP-2α。然而，随着[AP-2α]的下降第2天，Sp3/AP-2α表达比率从≈0.5–1.0转变为>第6天10点。这一变化与转录本一致C/EBPα基因的激活。
CUP/AP2、C/EBPα和Sp3表达动力学诱导脂肪细胞分化后。3T3-L1前脂肪细胞根据区分方案。核提取物在指定时间制备，并用针对其中一种的抗体(A类)C/EBPα，(B类)AP-2α，或(C类)Sp3（西班牙语）。以前的发布的数据显示在A类和B类用于比较C/EBPα和AP-2α分别与Sp3的(C类). [A类使用中的权限修改裁判。10（版权所有1997，美国国家科学院）；B类经ref许可修改。7（版权所有1998年，美国国家科学院）]。
讨论
脂肪细胞分化程序中事件的时间安排至关重要。有丝分裂克隆扩增，这是微分程序，必须在C/EBPα是产生脂肪细胞表型的基因(1,2). 表达式C/EBPα的表达必须延迟到有丝分裂克隆后膨胀，因为C/EBPα是抗有丝分裂的(23). 早期工作我们的实验室(7)表明C/EBPα的转录基因在有丝分裂克隆扩增过程中被抑制CUP/AP-2α，与近端启动子特异结合基因。当有丝分裂克隆扩增完成时，CUP/AP-2α下调C/EBPα基因被激活。两种机制似乎是负责延迟C/EBPα基因的转录直到克隆扩展完成：(我)延迟的通过C/EBP-β和-δ获得DNA结合活性是C/EBPα基因必需的反式激活子(11)和，作为在这里报告(ii（ii）)顺序抑制和激活分别通过CUP/AP-2α和Sp3。
C/EBPα基因启动子具有功能性C/EBP结合位点(5)通过C/EBP-β和-δ. C/EBP-β和-δ迅速增加（几小时内）诱导分化后表达。然而，这些转录因子缺乏DNA结合活性，直到很久以后差异化程序(11). C/EBP-β和-δ结合DNA似乎是由于形成了无活性的CHOP-10异二聚体（C/EBP同源蛋白10；参考文献。24)，一个C/EBP的主要负抑制剂(25). 滞后后，CHOP-10下调，释放C/EBP-β和-δ约束，然后可以绑定到C/EBP监管元素在C/EBPα启动子和反式私有化基因。
本文件中的证据暗示有额外的拖延行动涉及CUP/AP-2α和Sp家族成员，即Sp3和Sp1。C/EBPα基因启动子具有一个CUP/AP-2α与Sp调节元件重叠的调节元件（GT-box，图。). 而Sp3（和Sp1在较小程度上；图。B类)是一个C/EBPα基因的强反式激活子该基因不能在有丝分裂克隆扩增期间出现，因为Sp结合位点被CUP/AP-2α阻断。有丝分裂克隆然而，扩张停止，CUP/AP-2α的表达为下调，使Sp3可以访问Sp/GT-box基因的转录激活。因此，有两种抑制机制确保C/EBPα基因在有丝分裂后保持沉默克隆扩增发生，首先是DNA的延迟获得C/EBP-β和C/EBP--δ的结合活性以及CUP/AP-2α对基因的第二次抑制。
致谢
我们感谢R.Buettner博士（雷根斯堡大学，德国）提供AP-2α表达载体和G.Suske博士（德国马尔堡菲利普斯大学）提供Sp3和Sp1表达载体。这项工作得到了来自美国国立卫生研究院消化和肾脏疾病）。
缩写
| C/EBPα | CCAAT增强子结合蛋白质-α |
| AP-2α | 激活蛋白-2α |
| 古巴比索 | C/EBP公司未分化蛋白 |
| EMSA公司 | 电泳迁移率变化分析 |
| 重量 | 野生型 |
| tk公司 | 胸苷激酶 |
脚注
印刷前在线发布的文章：程序。国家。阿卡德。科学。美国,10.1073/pnas.220426097。
文章和出版日期见www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.220426097
工具书类
1Cornelius P、MacDougald O A、Lane M D。年收入螺母。1994;14:99–129.[公共医学][谷歌学者] 2麦克唐纳·奥阿，M·D巷。生物化学年度收益。1995;64：345–373。[公共医学][谷歌学者] 三。Hwang C、Loftus T、Mandrup S、Lane M。年收入细胞生物开发生物。1997;13:231–259.[公共医学][谷歌学者] 4Lane M D、Jiang M S、Tang Q-Q In：彭宁顿营养系列：营养、遗传学和肥胖。Bray G，Ryan D，编辑。路易斯安那州巴吞鲁日：路易斯安那州立大学出版社；1999年，第459–476页。[谷歌学者] 5Christy R J、Kaestner K H、Geiman D E、Lane M D。美国国家科学院程序。1991;88:2593–2597. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 7Jiang M S、Tang Q Q、McLenithan J、Geiman D、Shillinglaw W、Henzel W J、Lane M D。美国国家科学院程序。1998;95:3467–3471. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 9Vasseur-Cognet M，车道M D。当前操作基因开发。1993;三:238–245.[公共医学][谷歌学者] 12Patel Y M，车道M D。生物化学杂志。2000;275:17653–17660.[公共医学][谷歌学者] 14学生A K、Hsu R Y、Lane M D。生物化学杂志。1980;255:4745–4750.[公共医学][谷歌学者] 15Hwang C-S、Mandrup S、MacDougald O M、Geiman D E、Lane M D。美国国家科学院程序。1996;93:873–877. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 16Hagen G、Muller S、Beato M、Suske G。EMBO J。1994;13:3843–3851. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 17苏斯克·G。方法摩尔生物学。2000;130:175–187.[公共医学][谷歌学者] 18Hagen G、Muller S、Beato M、Suske G。核酸研究。1992;20：5519–5525。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 20Kennett S B、Udvania A J、Horowitz J M。核酸研究。1997;25:3110–3117. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 21Hagen G、Dennig J、Preiss A、Beato M、Suske G。生物化学杂志。1995;270:24989–24994.[公共医学][谷歌学者] 22Birnbaum M J、van Wijnen A J、Odgren P R、Last T J、Suske G、Stein G S、Stein J L。生物化学。1995;34:16503–16508.[公共医学][谷歌学者] 23Umek R M、Friedman A D、McKnight S L。科学。1991;251:288–292.[公共医学][谷歌学者] 24Tang，Q.Q.&Lane，M.D.（2000）程序。国家。阿卡德。科学。美国97,新闻界。
25罗恩·D、哈伯纳·J·F。基因发育。1992;6:439–453.[公共医学][谷歌学者] 
