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美国国家科学院院刊。2003年8月19日；100(17): 9861–9866.
2003年7月28日在线发布。 数字对象标识：10.1073/pnas.1633363100
预防性维修识别码：项目经理187866
PMID：12886015

膜蛋白BAP29/BAP31的高分子量复合物是参与膜结合IgD在内质中的滞留网状物

沃尔夫冈·沙梅尔,* 斯蒂芬·库皮格,* 伯恩德·贝克尔,*† 科尔斯汀·金博恩,* 汉斯·佩特·豪里,‡和迈克尔·雷思*§
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摘要

B细胞抗原受体（BCR）是一种多聚跨膜蛋白由膜结合免疫球蛋白（mIg）和Ig-α/Ig-β异二聚体。在大多数情况下，mIg从细胞表面的内质网（ER）需要与Ig-α/Ig-β亚单位。除Ig-α/Ig-β外，mIg这些分子还结合两种ER受体膜蛋白BAP29和BAP31，以及伴侣重链结合蛋白（BiP）。在本文中，我们展示了Ig-α/Ig-β、BAP29/BAP31和BiP都不能同时与相同的mIgD分子。Blue native PAGE显示只有一小部分细胞内mIgD的表达与高分子量BAP29/BAP31相关复合物。BAP与mIgs的结合与内质网的保留有关嵌合mIgD分子。关于高级表达果蝇属黑腹食肉动物细胞表面检测到S2细胞、mIgD分子在不存在Ig-α/Ig-β的情况下。这种异常运输被阻止了BAP29和BAP31共表达。因此，BAP复合物有助于ER保留不与Ig-α/Ig-β结合的mIg复合物。此外，BAP31和mIgD的ER滞留机制并非通过后ER隔间检索，但真正的ER保留。在结论BAP29和BAP31可能是长期寻找的保留蛋白和/或作用于各种蛋白质跨膜区域的伴侣。

B细胞上的抗原受体（BCR）是一种多蛋白复合物，包括一个膜结合Ig（mIg）分子和一个Ig-α/Ig-β异二聚体(1,2). 一个mIg分子(图5A类)包含两个相同的膜结合重链（属于五种中的一种重链等型，例如mIgD中的δm）和两个相同的轻链（λ或κ）。Ig-α（CD79a）和Ig-β（CD79b）是相关的跨膜（TM）蛋白质，每个都具有细胞外Ig结构域、TM区域和携带免疫受体酪氨酸基激活基序（ITAM）(三). 关于业务连续性审查，ITAM的酪氨酸残基被磷酸化并有助于信号分子的激活(4,5).

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scδm分子在细胞表面的表达。(A类)图像显示了scδm、scδmMHCTM和mIgD分子。沉重的链式衍生序列为深灰色，浅色链式衍生层序为浅色灰色，MHCI的TM区域为白色。(B类)未转染S2细胞(文学士和Bd公司)orscδm(b条)和scδmMHCTM(e（电子）)转染剂，以及BAP29/BAP31/scδm(c（c）)和BAP29/BAP31/scδmMHCTM共转染物(（f）)，先被染色在细胞表面（藻红蛋白），然后在细胞内（FITC）用抗sc抗体。细胞分析如图所示图4.

膜近端Ig结构域以及mIg的TM区域在通过调解与Ig-α/Ig-β。mIg重链的TM区域很可能跨越膜为α螺旋，包含25个氨基酸残基具有极性侧链。其TMα-螺旋的一侧是不同mIg同工酶型之间保守(1,6). 在mIgM的情况下已证明该侧与Ig-α/Ig-β结合(7–10).此外，mIg TMα-螺旋的另一侧含有类特异性氨基酸，参与BCR的齐聚(11). 细胞的细胞质部分mIgM和mIgD是相同的，仅由三个氨基酸组成。

结果表明，mIg与Ig-α/Ig-β的结合是必要的用于将mIgM、mIgA和mIgE从内质网（ER）运输到细胞表面(12,13). 相比之下mIgG的表面转运不需要Ig-α/Ig-β某些情况下，mIgD分子(13–18).长期以来，已知mIg的TM区域内的极性残基在如果Ig-α和/或Ig-β缺失。我们目前对这一现象的了解很多来自于对mIgM的研究，其中实验性地替代了极性TM疏水性氨基酸的残基导致ER保留受损（综述于裁判。6). 虽然目前还不清楚潜在的保留机制，它显然涉及普遍存在的因素，因为mIgM可以有效地保留在非淋巴样细胞类型，如垂体细胞或NIH成纤维细胞(13,19).

我们之前报道了两种相关的TM蛋白与mIgD和（在较小程度上）mIgM分子。这些蛋白质被称为29 kDa（BAP29）和31 kDa的BCR-相关蛋白（BAP31）(20,21). mIgD的TM区域是足以与BAP蛋白结合，这种相互作用涉及极性mIgD TM区内的氨基酸(22). BAP31和BAP29分别为普遍表达的多面体膜蛋白，其特征是具有三个假定TM区域和一个包含预测线圈区域的C末端细胞质尾部(20,22,23). BAP31和BAP29具有C末端双赖氨酸基序（KKXX），已知其将蛋白质定位于急诊室(24). 的确，ER已报道BAP31在非B细胞系中的定位(23,25).

BAP31进一步与多面体TM蛋白囊性纤维化TM相互作用调节器（CFTR）和cellubrevin(25,26). 发现BAP31为参与保留CFTR的ER和从ER出口cellubrevin。

最初的铜提纯实验使我们得出结论，BAP蛋白是IgD–BCR复合物的一部分，这种相互作用有助于IgM-和IgD-BCR之间的信号差异。在本文中，我们展示了BAP29和BAP31都不是IgD–BCR复合物的亚单位，但它们与ER中相对较少的mIgD分子相互作用。我们进一步表明这些高-M（M）第页BAP29/BAP31复合物参与在没有Ig-α/Ig-β的情况下，mIg分子的ER保留。

材料和方法

DNA构建。的表达式向量果蝇属黑腹食肉动物S2细胞基于质粒pRmHa-3，该质粒含有金属硫蛋白启动子(27).Clonings包含在支持文本，发布为PNAS网站上的支持信息，网址：www.pnas.org.

细胞培养。小鼠B细胞系J558L及其转染体[J558Lδm/Ig-α(20)获得和培养J558Lδm克隆9W](22). 维持S2细胞并按说明转染(28)，例外情况为将1μg质粒DNA转染（1μg表达载体用于使用脂蛋白（生命）添加BAP29和BAP31纽约州格兰德岛科技公司）。为了诱导金属硫蛋白启动子，1 mM将CuSO4添加到细胞培养中24 h。中国仓鼠卵巢（CHO）和按照所述培养并转染Cos-7细胞(29)并符合标准程序。

流式细胞术。对于FACScan（Becton Dickinson）分析，细胞依次用抗CD4抗血清（圣克鲁斯生物技术公司）和藻红蛋白标记的抗兔IgG抗血清。或者，单克隆抗体Ac146公司(30)，它承认单链（sc）δm分子和藻红蛋白标记的抗小鼠使用IgG抗血清。表面染色后，细胞被渗透0.1%皂苷，用相同的一级抗体染色，FITC-标记二次抗血清。用FACScan（Becton）对细胞进行清洗和分析狄金森），和104活细胞被绘制在双对数刻度。

亲和纯化和Western印迹。刺激J558L转染子，2×107用50μM培养细胞如前所述，渗透汽化3分钟(31)并在1 ml中溶解裂解缓冲液(22)包含1%Triton®声波风廓线仪X-100。磷酸化蛋白用抗磷酸酪氨酸琼脂糖（PT66，Sigma）。或者，mIg是用NP（4-羟基-3-硝基苯乙酸）共轭物纯化亲和力琼脂糖凝胶，随后用0.5mM NIP帽洗脱（5-碘-4-羟基-3-硝基苯乙酸酯NP与ε-氨基己酸偶联）在裂解缓冲液中。对于免疫沉淀，我们使用了抗CD4（Dianova，德国汉堡），或anti-δ和anti-λ（南部生物技术）抗体和蛋白G-偶联Sepharose。还原SDS/PAGE描述了蛋白质印迹(22). Western blots为用以下抗体开发：抗磷酸酪氨酸（4G10，Upstate生物技术）；抗Ig-β(32); 抗BAP29和抗BAP31(22);抗Ig-α；抗hCD4（圣克鲁斯生物技术）；防重链结合蛋白（BiP）（抗GRP78，亚历克西斯生物化学公司，圣地亚哥）；或辣根过氧化物酶结合抗δ和抗λ抗血清。如前所述使用次级抗体(20,22).

免疫荧光显微镜。CHO和Cos-7细胞生长在玻璃盖在37°C时滑动。为了改变温度，细胞被培养在15°C的水浴中放置3 h。细胞在PBS中清洗两次并固定并用甲醇（-20°C）和丙酮渗透5分钟（-20°C）持续5秒。按照说明进行抗体染色(25,33). 抗BAP和抗sc对同一样品同时进行染色。微观的照片是用徕卡共焦显微镜记录下来的。控制进行了实验以确定抗体的特异性反应。

结果

BAP29的独占绑定/BAP31或免疫球蛋白-α/免疫球蛋白-β异二聚体到mIgD。铜净化作用发现mIgD与BAP29/BAP31和Ig-α/Ig-β结合(20). 在这里，我们寻求确定BAP蛋白和Ig-α/Ig-β是否同时与相同的mIgD分子，或者它们在mIgD-结合中是否相互排斥。收件人区分这些可能性，两步纯化方法是通过使用表达完整针对半抗原NP的IgD-BCR。用磷酸酶处理细胞渗透酸抑制剂可使多种蛋白酪氨酸激酶磷酸化底物包括Ig-α和Ig-β(31). 因为BAP和mIg蛋白质不是激酶底物，它们在这些底物下保持非磷酸化条件。过钒酸盐处理过的细胞在Triton X-100洗涤剂中进行溶解适用于将Ig-α/Ig-β和BAP复合物与mIgD进行铜纯化分子(34). 首先，我们抗磷酸酪氨酸免疫纯化磷酸化蛋白抗体。随后，上清液中残留的mIgD分子用NP-Sepharose纯化亲和力。蛋白质通过SDS/PAGE和受到西方印迹的影响。蛋白质检测采用抗磷酸酪氨酸(图。1A类)随后使用抗δ、抗Ig-β，抗BAP29和抗BAP31抗体(图。1B类). Ig-α/Ig-β被磷酸化，允许IgD·Ig-α/Ig-β复合物的纯化抗磷酸酪氨酸Sepharose(图1A类，车道1）。BAP蛋白无法在这些中检测到沉淀物(图1B类,车道1）。从剩余上清液中纯化的mIgD分子与BAP蛋白，但不是Ig-α/Ig-β(图1B类，车道2）。A类更高-M（M）第页δm的形式用铜净化Ig-α/Ig-β(图。1B类 顶部，车道1），并表现出对内切糖苷酶H（EndoH）处理（数据未显示）。相反，mIgD用NP-Sepharose纯化(图。1B类 顶部，车道2）包含的δm链较低-M（M）第页对EndoH敏感（数据未显示）。因此，mIgD·Ig-α/Ig-β复合物（BCR）主要是含有成熟的表面形式，而mIgD·BAP复合物含有δm重链的未成熟ER形式。这些结果表明BAP29/BAP31和Ig-α/Ig-β不会同时与相同的mIgD分子。因此BAP蛋白不是BCR的一部分复杂。

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Triton X-100可溶性mIgD复合物仅含有Ig-α/Ig-β或BAP29/BAP31。含有磷酸酪氨酸的蛋白质从刺激的J558Lδm/Ig-α细胞（1道）和mIgD中纯化用NP-Sepharose（lanes）纯化保留在上清液中的复合物2). 蛋白质通过SDS/PAGE分离并用抗磷酸酪氨酸检测抗体(A类)以及抗δ、抗Ig-β和抗BAP29和抗BAP31抗体(B类).

只有一小部分细胞内mIgD与BAP29型/BAP31。接下来我们研究了所有细胞内mIgD这些分子与BAP蛋白相关。来自a的mIgD复合物J558Lδm/Ig-α裂解物首先用NP-Sepharose亲和纯化(图2，车道1），然后用游离半抗原NIP-cap从清洗的珠子中洗脱。BAP蛋白存在于洗脱液中的被反复免疫沉淀抗BAP31（通道2和3）或抗BAP29抗血清（通道5和6）。随后，剩余的mIgD分子从缺失的BAP中纯化用抗δ抗血清洗脱（通道4和7）。对蛋白质进行了分析通过SDS/PAGE和蛋白质印迹。尽管此分析中的所有BAP蛋白用NP-Sepharose与mIgD共纯化(图2，车道1），仅次要mIgD的量（δm和λ）与抗BAP31（lane2） 或抗BAP29（5通道）抗血清。NP中的大多数mIgD分子洗脱液不与BAP蛋白结合（通道4和7）。除了高-（Ig-α/Ig-β相关）M（M）第页的形式δm，这些mIgD分子含有-M（M）第页形式δm（车道4和7）。因此，大多数细胞内mIgD分子不与BAP结合。排除反BAP的可能性抗体具有破坏mIgD·BAP29/BAP31复合物的能力，J558Lδm/Ig-α裂解物与抗BAP抗体孵育，然后用NP-Sepharose-bound进行铜提纯观察到mIgD·BAP29/BAP31（数据未显示）。

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只有少量mIgD与BAP29/BAP31相关。mIgD从J558Lδm/Ig-α裂解物中纯化复合物NP-Sepharose（lane1），用游离半抗原洗脱，用抗BAP31抗血清（2和3道）或抗BAP29抗血清（5和3道6). 随后，剩余在上清液中的mIgD分子为用抗δ抗血清纯化（第4和第7道）。蛋白质是用SDS/PAGE分离并用抗δ、抗λ、，抗BAP29和抗BAP31抗血清。

因此，在B细胞中可以区分三类mIgD分子：一个大的免费mIgD池、一个小的BAP相关mIgD池和一个Ig-α/Ig-β相关mIgD。所有与mIgD相关的BAP31蛋白均为与抗BAP29抗血清（第5和7道）共纯化，表明BAP29和BAP31同时与相同的mIgD分子结合。在NIP洗脱液中J558Lδm/Ig-α裂解物、BAP29和BAP31大致存在于等摩尔量(20).因此，BAP-相关的mIgD分子中的每一个似乎都与高-M（M）第页由多个BAP29/BAP31组成的BAP复合物异二聚体。在支持文本我们通过使用蓝色本机页面显示mIgD分子的细胞内池存在于高-M（M）第页BAP结合的络合物（见图7，即作为支持信息发布在PNAS网站上）。

BAP29的主要部分/BAP31异二聚体池绑定至mIgD。J558Lδm/Ig-α细胞用于分析与mIgD相关的BAP29和BAP31。首先用NP-Sepharose去除所有含mIgD的复合物，然后去除蛋白质通过SDS/PAGE和Western blotting分析上清液中的剩余物(图3A类，车道3和4). 作为对照，对mIgD阴性的J558L细胞进行了相同的分析（车道1和2）。在mIgD耗尽之前，J558Lδm/Ig-α细胞裂解物含有δm、BAP29和BAP31，而δm在NP-Sepharose纯化(图。三A类，泳道3和4）。有趣的是，BAP29的量，但BAP31在mIgD缺失后显著降低(下部). 在J558L对照细胞中，BAP29的数量没有减少或观察到BAP31（车道1和2）。接下来，我们纯化了mIgD·BAP抗λ或抗δ免疫沉淀复合物。使用SDS/PAGE和Western blotting，我们分析了沉淀(图。三B类，车道1和2），并将其与总细胞裂解物（3号通道）。在裂解物中，更多的BAP31（相对于BAP29）比在纯化的BAP复合物中发现的多。BAP29的相同编号BAP31与mIgD结合(20).因此，我们得出结论，细胞裂解液中BAP31的含量高于BAP29，并且与大多数BAP31不同，大多数BAP29/BAP31杂低聚物与免疫球蛋白D(图3A类).

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BAP31出现在同源BAP31和异二聚体BAP29/BAP31池中；只有后者与mIgD相关。(A类)蛋白质印迹分析δm（米）(上部)和BAP29/BAP31(下部)细胞内裂解物J558L（1号和2号车道）和J558L-δm/Ig-α细胞（3号和4号车道）。这个裂解物未经处理（1号和3号通道）或与NP-Sepharose一起孵育从裂解液中除去mIgD（通道2和4）。(B类)mIgD复合物从带有抗λ抗体的J558Lδm/Ig-α裂解物中纯化（车道1）或抗δ（lane 2）抗血清。蛋白质通过SDS/PAGE和用抗BAP29、抗BAP31和抗λ抗血清检测。对于相比之下，使用了细胞裂解液（3号通道）。(C类)从刺激物中纯化含磷酸酪氨酸的蛋白质J558Lδm/Ig-α细胞（通道1）和mIgD复合物留在上清液用NP-Sepharose纯化（第2道）。分离蛋白质通过SDS/PAGE进行检测，如图所示。(D类)mIgD复合物用NP-Sepharose从J558Lδm裂解物中纯化，用游离半抗原洗脱（通道1），并用抗BAP29抗血清沉淀三次（通道2，3和4）。随后，上清液中残留的mIgD分子为用抗λ抗血清纯化（第5道）。蛋白质通过SDS/PAGE并用抗λ、抗BAP29和抗BiP检测抗血清。

BiP公司(35)绑定到ER定位的可溶性Ig分子的第一Ig结构域。因此，我们调查BiP是否也与ER-localized膜结合Ig结合。这个采用与所述相同的实验方法图1事实上，BiP没有绑定到BCR复合体(图。三C类，通道1），但它确实与mIgD的ERform结合（车道2）。接下来，我们询问BiP和BAP是否同时存在与mIgD复合。实验方法如所示图2通过使用细胞系J558Lδm。该细胞系不表达Ig-α，因此，在细胞表面既不包含BCR也不表达mIgD（数据不如图所示）。这一发现使我们能够专门调查mIg的ER-pool。所使用的纯化策略表明，mIgD·BAP复合物(图3D类，车道2和3） 不含BiP，而（至少）一些剩余的mIgD分子与BiP（车道5）相关。因此，少数BAP相关的mIgD分子不优先绑定到BiP。

mIgD的TM区域足以与BAP29型/BAP31和保留。基于CD4的嵌合蛋白分子(图4A类)用于确定δm的TM区域必要的(22)，但也足以进行BAP绑定。在CD4δm中，TM和细胞质区域CD4被δm的相应部分取代。CD4/19K含有CD4的外结构域和TM区域，而其细胞质尾部来源于E3/19K，一种包含C末端KKXX基序的蛋白质，定位于将相应的表达载体转染到D。黑腹食肉动物S2细胞，以及编码小鼠BAP29和BAP31.用抗CD4抗体从细胞裂解物中免疫纯化蛋白质并通过SDS/PAGE和Western blotting进行分析(图4B类 上部). 作为对照，分析细胞总裂解物的BAP表达式(下部). 没有用CD4纯化BAP29/BAP31蛋白和CD4/19K（通道2和4），尽管BAP29/BAP31蛋白存在于裂解物(下部); 然而，BAP29/BAP31蛋白与CD4δm(图4B类,车道3）。该结果表明mIgD的TM部分是必要的足以与BAP29/BAP31相互作用。

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野生型和嵌合型CD4蛋白与BAP29/BAP31结合的分析保留。(A类)显示CD4、CD4δm和CD4/19K的图像。这个CD4衍生序列为白色，δm TM区域为灰色，E3/19K细胞质尾部为黑色。(B类)SDS/PAGE和Western blot分析抗CD4免疫沉淀物中的蛋白质(上部)和总裂解物(下部)未转染细胞（1区）和共转染S2细胞带有BAP29/BAP31和CD4（车道2）、CD4δm（车道3）或CD4/19K（车道4）。用抗CD4、抗BAP29和抗BAP31进行Western blot检测抗血清。(C类)未被改造(一)或CD4转染(b条–d日)S2细胞用抗CD4抗体染色（藻红蛋白），随后在细胞内渗透后抗CD4抗体（FITC）。用流式细胞仪分析细胞结果以双对数标度绘制。

在没有Ig-α/Ig-β的情况下，大多数mIgD分子被保留S2电池内（见下文）。调查是否存在δm TM区域足以用于荧光激活的保留细胞对表达不同CD4的S2细胞进行分类（FACS）分析嵌合蛋白(图。4C类). 野生型CD4转染子表达CD4细胞内和细胞表面，表明CD4从急诊室(图4抄送). 在与CD4相反，大多数CD4δm分子在细胞上不表达表面(图4复写的副本),表明δm的TM区域足以保留嵌合分子。CD4/19K作为对照。正如预期的那样这种蛋白质的大部分是在细胞内表达的，而不是在细胞表面(图4镉).

mIgD的TM区对保留是必要的。因为TMmIgD区域是BAP结合所必需的(20,22)，我们接下来进行了调查是否也有必要在ER中保留mIgD在S2细胞中的mIgD样分子，我们为scδm分子(图。5A类). 在这个嵌合体中，δm的VH和CH1结构域被来自NP结合抗体B1–8。scδm表达载体为将BAP29和BAP31载体转染或不转染S2细胞。流量细胞分析显示75%的细胞内阳性细胞表面为负值，表明在这些细胞中scδm没有被运输到细胞表面(图。5Bb公司). 有趣的是，在25%的scδ米-表达细胞后，分子确实出现在表面。这一结果主要见于表达高水平scδm的细胞，建议保留机制在以下情况下不起作用scδm分子太大。如果BAP29和BAP31的表达载体与编码scδm的质粒共转染高表达细胞中scδm被阻止(图5密件抄送). 我们还使用嵌合scδmMHCTM分子(图5A类)，确实如此不与BAP蛋白结合（数据未显示）。在scδmMHCTM中δm被主要的疏水TM部分取代组织相容性复合体I（MHC I，H2-KK（K）). FACScan分析转染的S2细胞显示，scδmMHCTM分子量BAP29/BAP31共表达后细胞表面没有改变(图5Be公司和Bf公司). 因此，BAP29/BAP31对scδm不是因为普遍抑制胞吐。

BAP31和scδm保留在ER中，没有检索。用表达载体转染Cos-7细胞scδm，与antisc和anti-BAP31同时固定和染色抗体，并通过免疫荧光显微镜进行分析(图6A类). 两者都有蛋白质共定位并显示ER-like分布（包括染色核膜）。该结果证实了scδm（并且可能mIgD）在没有Ig-α/Ig-β的情况下保留在ER中。

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BAP31和scδm保留在ER中，而不从后ER隔间。(A类)瞬时转染Cos-7细胞带有scδm的表达载体，固定并同时染色带有抗c抗体(左侧)和抗BAP31抗血清(赖特). 这些图像是用共焦显微镜拍摄的。(B类)用表达载体瞬时转染CHO细胞scδm在37°C下生长(上部)，或在包括15°C(下部). 细胞固定并用抗ERGIC53抗体(赖特)或同时使用防腐蚀剂抗体和抗BAP31抗血清(左侧和居中).

接下来，scδm和BAP31的保留机制是通过15°C温度变化实验进行研究(33). 在15°C时，向前仍然发生从ER到中间隔室的运输，而逆行运输（到ER的中间隔室）被阻断。因此，通过从ER后提取保留在ER中的蛋白质隔室积聚在中间隔室中。永远不会让ER在15°C时不要改变其定位。我们暂时用编码scδm的质粒转染CHO细胞并培养37°C时(图6B类 上部)或包括15°C孵育3小时(图6B类 下部). 细胞被固定，用抗c、抗BAP31或抗ERGIC53抗体，并用荧光显微镜进行分析。两者都不是15°C时，BAP31和scδm在ER外积聚(图6B类 下部)表明它们确实保留在ER中对照组中，ERGIC53确实在大点中积累，主要在高尔基/中间隔间区域(图。6B类)如前所述(33).

讨论

从B细胞裂解物中亲和纯化mIgD导致Ig-α/Ig-β和BAP29/BAP31的铜提纯异二聚体，这使我们相信BAP蛋白是BCR复合体的组件(20). 这里我们只显示了一个细胞内少量mIgD与BAP蛋白结合，而Ig-α/Ig-β与mIgD的表面形式有关(图1). 因此，BAP29/BAP31为不是BCR的一部分。这一发现与BAP31至急诊室(23,25)以及最近的分析(11)表明BCR仅包含Ig-α、Ig-β和mIg分子。如果BAP29和BAP31用mIgD进行铜纯化，这三种蛋白质以≈1:1:1的比例存在比率，表明大多数mIgD与BAP蛋白相关(20). 这种解释是不正确，我们现在知道这个比率是由于两个不同的mIgD细胞内池，一个大的游离mIgG池分子，以及与高-M（M）第页包含多个BAP29/BAP31的BAP复合体异二聚体。

mIg分子在ER中合成、折叠和组装内质网管腔中控制可溶性Ig折叠和组装的伴侣重链和轻链是众所周知的(36–41).像BAP蛋白一样，这些ER伴侣普遍存在、丰富，并且进化上高度保守的蛋白质。一个例子是BiP，它绑定到新合成可溶性Ig重链(38)，但仍然没有与轻链配对或正确折叠。这里，我们证明BiP也结合ER-localized mIg分子，但不是BCR的一部分(图3). 类似于可溶抗体，我们建议在这种情况下BiP也控制重链轻链。另一个例子是膜结合，ER-localized伴侣蛋白calnexin，参与正确折叠和mIg分子的瞬时结合(18); 然而，抑制mIg和calnexin之间的关联并没有导致突变型mIgD分子(18).因此，游离mIg分子的保留机制用Ig-α/Ig-β组装仍然是个谜。然而，众所周知，mIgTM区域的极性氨基酸残基对游离mIg的保留（参考文献。6).

我们发现mIgD的TM区足以保留嵌合ER中的CD4分子(图4)表示该区域携带自主ER保持信号。此外，mIgD的TM区域是必要的(22)且足以用于BAP绑定(图4). 因此，在CD4中在scδm嵌合分子中，BAP结合与mIg的保留。

为了确定BAP蛋白是否直接参与mIg保留，我们将编码这些分子的质粒转染到黑腹果蝇S2细胞。潜在的保留机制在进化上是保守的，因为单位为scδ米-转染S2细胞的低/中度表达水平scδm没有被转运到细胞表面。D。黑腹食肉动物确实表达一个BAP同源物（S.K.，未发表结果）。在表达大量scδm，表示涉及限制因素，该限制因素被覆盖在这种情况下。scδm与小鼠BAP29/BAP31共表达抑制scδm向地表的传输。这个结果直接表明BAP蛋白在保留游离mIg分子方面发挥作用。BAP共表达没有非特异性地抑制内质网输出，因为scδmMHCTM是嵌合体具有不与BAP29/BAP31相互作用的疏水TM区域正常导出(图5).因此，高-M（M）第页BAP29/BAP31低聚物是ER的一部分质量控制系统，确保只有正确组装的BCR才能达到细胞表面。

BAP31反义抑制增加细胞CFTR的表达表面(26). 同样，BAP31表达增加导致细胞表面局部表达减少CFTR，表明BAP31是CFTR的保留/回收蛋白。此外，BAP31促进了cellubrevin的出口(25). 这一发现似乎与mIg和CFTR的保留功能不一致。然而，TM据报道，cellubrevin区域与BAP31复合物结合，这些可能与BAP29/BAP31异二聚体具有不同的细胞功能。

BiP和BAP结合到mIgD的不同区域，但它们不结合同时对同一mIgD分子(图3). 因此，他们可能控制独立的过程，即用轻链组装(38)和程序集分别为Ig-α/Ig-β。我们认为BAP蛋白主要与在管腔部分正确折叠的mIgD分子结合用轻链组装，但未绑定到Ig-α/Ig-β。

BAP蛋白可以作为保留蛋白或检索蛋白用于毫克。因为大多数ER标记的mIgD与BAP蛋白无关(图2)，前一个案例似乎不太可能。在后一种情况下，BAP蛋白将与逃逸的mIgD结合后ER隔间中的分子，通过涉及BAP的KKXX-retrieval基序的逆行转运。在ER中mIg分子会从BAP中释放出来，因此大多数mIg不会BAP关联。转染CHO细胞的15°C温移分析然而，表明BAP31和scδm都不能离开ER(图6). 因此，这不太可能通过检索保留。这些数据与我们之前的数据一致数据(33)表明BAP31是一种从不离开内质网的内质网标志蛋白BAP31必须包含一个在没有检索。事实上，缺乏KKXX-retrieval基序的BAP31突变体仍然存在本地化到ER（未显示数据）。关于单元格之间的差异行，我们不能排除在S2或B细胞中可能的检索。

另外，BAP蛋白可能对mIg保留有间接影响通过在mIg TM区域的正确折叠/组装中发挥作用。这个mIgTM区的亲水氨基酸参与mIg的保留(7–10,42–45).氢键部分对定位有强烈的能量偏见在膜中，因此被屏蔽在规定的结构内。因此，部分亲水TM区域存在错误折叠的危险(46). BAP蛋白可能是伴侣帮助TM片段的折叠和组装。BAP29和BAP31每个都有三个TM区域，含有亲水性和带电氨基酸。因为这些TM区域显示出最高程度的保守性，即脂质膜可能是它们发挥功能的环境。事实上BAP–mIg相互作用发生在脂质双层内。在mIgD中TM区域折叠错误，TM保持信号可能不再工作。这个这可能是S2细胞表面携带scδm的原因。在在这个模型中，小鼠BAP蛋白的共表达阻止了scδm至电池表面(图。5)，因为它们减少了错误折叠的mIgD-TM区域的数量。scδmMHCTM分子被导出(图5)，因为它可能不会由于BAP的TM区域完全疏水，因此需要BAP才能正确折叠。有趣的是，禁止蛋白（BAP32）和BAP37这两种TM蛋白形成了高-M（M）第页复合物可能具有伴侣活性TM蛋白复合物的组装(47).

BAP31还作为凋亡程序。它与Bcl-2和procaspase 8结合，可以裂解BAP31的细胞溶质尾(23,48). BAP31可能会保持促凋亡复合物以某种构象存在，因此在卵裂后其尾部结构改变，诱导细胞凋亡。

补充材料

支持信息：

致谢

我们感谢K.Karjalainen提供的pSP6-T4，T.Nilsson提供的pCMUIV-CD4/19K质粒，J.Jongstra用于Ig-α抗血清，G.Sher用于临界阅读手稿。这项工作得到了德意志银行的支持Forschungsgemeinschaft通过SFB 388、莱布尼茨奖（授予M.R.）和德意志大学埃米·诺特项目（W.W.A.S.）。

笔记

缩写：BCR，B细胞抗原受体；BiP，重链捆扎蛋白质；内质网；TM，跨膜；BAP、BCR相关蛋白质；CFTR，囊性纤维化TM调节因子；CHO，中国仓鼠卵巢；δm，mIgD类的Ig重链同种型；λ、 Ig轻链mIgD类的同型；NP，4-羟基-3-硝基苯乙酸；毫克，膜结合免疫球蛋白；sc，单链。

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