小鼠和大鼠BDNF基因结构和表达的再研究

RNA分离、cDNA合成、RT-PCR

按照制造商的建议，通过RNAwiz（Ambion，Austin，TX）纯化发育期和成年期小鼠和大鼠大脑和大脑区域以及非神经组织的总RNA。根据制造商的说明，使用Turbo DNA-Free试剂盒（Ambion）对总RNA进行DNA酶处理。使用寡核苷酸（dT）和SuperScript III第一链合成系统（Invitrogen，Carlsbad，CA）将来自不同组织的5微克总RNA用于第一链合成。为了分析BDNF转录物的表达，使用了针对3′BDNF编码外显子的反向引物和针对5′非编码外显体的正向引物。为了在小鼠和大鼠中鉴定人反义BDNF外显子的同源物，设计了与小鼠和大鼠BDNF基因组区域相对应的引物，这些区域与人外显子显示出显著的同源性。总RNA归一化为普遍表达的HPRT基因的表达。研究中使用的所有引物如下所示，其中m表示小鼠、r、大鼠；h、 人；for，向前；转速，反向；阿拉伯数字BDNF外显子如下：mrBDNFI，GTGTGACCTGAGGAGTGGCAAAGA；BDNFII先生，GGAAGTGGAAAAACCGTCTAGAGCA；mBDNFIII、GCTTTCTATCCCCTCCCCGAGT；rBDNFIII、CCTTTCTATTTCCCTCCCCGAGAGT；BDNFIV先生，CTCTGCCTAGATCAAATGGTTC；BDNFV先生，CTCTGTGTAGTTTCATTGTGTTTC；mBDNFVI、GCTGGCTGTCGCACGGTTCCATT；rBDNFVI、GCTGGCTGTCGCACGGTCCCCATT；BDNFVII先生，CCTGAAAGGGTCTCGGAACTCCA；BDNFVIII先生，GTGTGTCTCTGCCTCAGTGA；mBDNFIXA、CCCAAAGCTGCTAAAGCGAGGAAGAGAGAG、；rBDNFIXA、CCAGAGCTAAAGTGGGAGAAG；hmrHPRT用于，GATGAGAACCGTTATGAC；hmrHPRTrev，GTCCTTTTCACCAGAGCTTG；和BDNFrev先生，GAAGTGTACAAGTCCGTCTTA。

为了分析小鼠和大鼠外显子I–IV、外显子VI和外显子IXA特异性转录物的表达，使用HotFire聚合酶系统（爱沙尼亚Solis BioDyne）以总体积25μl和35个PCR周期扩增cDNA。所有引物组合均采用60°C的退火温度。由于含有外显子V、VII和VIII的BNDF mRNAs的表达水平相对较低，因此使用一个更健壮的HotStartTaq Master Mix试剂盒（加利福尼亚州查茨沃斯市齐根）进行40–45个PCR周期的cDNA扩增。所有RT-PCR反应均一式三份。PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶中溶解，并用溴化乙锭染色进行可视化。随后从凝胶中切下PCR片段，使用pCRII-TOPO克隆系统（Invitrogen）进行克隆，并进行序列分析。

转录起始位点的5′RACE分析

为了确定新BDNF转录物的转录起始位点，根据制造商的说明，使用GeneRacer试剂盒（Invitrogen）进行cDNA末端5′快速扩增（RACE）。用HotStartTaq Master Mix试剂盒（Qiagen）和GeneRacer 5′正向引物和反向引物对外显子III、V、VII、VIII和IXA进行PCR扩增。然后，通过使用GeneRacer 5′嵌套引物和针对外显子III、V、VII、VIII和IXA的嵌套引物，进行巢式PCR以提高RACE的特异性和敏感性。RACE产物在2%凝胶中进行分析，并克隆到pCRII-Topo载体（Invitrogen）中进行序列分析。用于RACE分析的引物如下：rBDNFIIIRACE、TCAATGAAGCATCCAGCCGGCA；rBDNFIII嵌套，CGGAACTCTCGGGGAGGA AATA；rBDNFVRACE、GAACACAAAATGAAACTACACAGAG；rBDNFVIIRACE，CTAAAGAGGTGCTGCTGGATGAGAGAGAG；rBDNFVIN测试，GGACCTGGAGTTCCGCAGACCTTT；rBDNF VIIIRACE，CCATTTCAGCATCGTGTTTCAGC；rBDNFVIII嵌套，GAGACACACACCACAGCCTTCTC；rBDNFIXARACE、GAGTAAACGGTTTTCTAAGCAA GTG；和rBDNFIXAN测试，CTTCCTCCCACTTAGCAGCTCTG。

小鼠和大鼠BDNF转录物的表达分析

包含外显子I、II、IV（前III）和VI（前IV）的大鼠BDNF转录本及其组织特异性表达谱已在之前描述过(Timmusk等人，1993年)，然而没有关于新的大鼠BDNF外显子V、VII、VIII和IXA的表达的数据，关于大鼠外显子III的表达模式只有有限的数据可用(Bishop等人，1994年). 此外，尽管已经描述了小鼠BDNF外显子I和II上游的启动子区域(Hayes等人，1997年)，没有数据可用于包含外显子I–IXA的小鼠BDNF转录物的表达。在本研究中，对发育中和成年大脑以及小鼠和大鼠的外周组织中所有BDNF转录物的表达谱进行了RT-PCR分析(图2).

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图2

小鼠和大鼠BDNF mRNA的表达分析。小鼠组织特异性表达的半定量RT-PCR分析(A类)和老鼠(B类)BDNF转录物和对照HPRT mRNA在发育中和成年大脑以及外周器官中进行。E、 胚胎日；P、 产后一天。

大鼠外显子I BDNF mRNA的表达，以前被描述为脑特异性转录物(Timmusk等人，1993年)在包括睾丸、肺、胸腺、肝脏和脾脏在内的几种非神经组织中也观察到低水平(图2B). 除大脑外，仅在胸腺中检测到小鼠外显子I转录物的表达(图2A). 在成年小鼠和大鼠大脑中，BDNF外显子I mRNA在所有研究区域均有表达，小脑中表达最低。在发育中的小鼠和大鼠大脑中，BDNF外显子I转录物的低水平在胚胎第13天和第15天表达，表达水平在小鼠出生后第1天和大鼠胚胎第21天达到峰值，在出生后发育期间略有下降(图2A、B). BDNF第二外显子mRNA剪接变异体A、B和C在小鼠和大鼠的大脑中显示出不同的表达模式，在外周组织中未检测到它们的表达。在小脑中，外显子IIA转录物最丰富；在海马体中，所有三个外显子II剪接变异体的表达水平相似。小鼠和大鼠新型BDNF外显子III转录物的总体脑特异性表达模式与BDNF第二外显子类似(图2A、B). 在小鼠非神经组织中，仅在脾脏和肾脏中检测到低水平的外显子III转录物，在大鼠胸腺中检测到外显子II转录物。BDNF外显子IV和外显子VI mRNAs（以前的外显子III和IV，Timmusk等人，1993年)在研究的最早发育阶段E13，小鼠和大鼠大脑发育中已观察到显著水平。在小鼠和大鼠中，BDNF第四外显子和第六外显子的mRNA水平在胚胎和出生后发育期间逐渐升高，而在成人大脑中略有下降。在成年大脑中，在小鼠和大鼠的所有分析大脑区域都检测到了外显子IV和外显子VI转录物。外显子IV和外显子VI转录物在小鼠和大鼠非神经组织中表现出广泛的表达模式，在心脏和肺中的表达水平最高(图2A、B).

在小鼠和大鼠中，BDNF新的外显子V、VII和VIII在大脑发育期间的表达水平相对较低，广泛存在于成人外周组织中，而在成人大脑区域中的表达水平不同(图2A、B). 尽管已将同一转录物中包含外显子VII和VIII的小鼠BDNF mRNA提交给NCBI GenBank（AY231132），但我们在所研究的任何小鼠或大鼠组织中均未检测到类似的mRNA。

在啮齿类动物胚胎发育期间以及成年期的大脑中检测到新的BDNF外显子IXA转录物的表达。在小鼠成年大脑中，包含外显子IXA的转录物在所有大脑区域的表达水平相似(图2A)然而，在成年大鼠大脑中，外显子IXA在海马、嗅球、丘和小脑中高水平表达，在皮层和脑桥中低水平表达(图2B). 在啮齿动物的非神经组织中，心脏和肺中观察到较高水平的外显子IXA转录物。

大鼠BDNF新外显子III、V、VII和VIII转录起始位点的鉴定

大鼠BDNF外显子I、II、IV和VI的转录起始位点已在早期确定(Timmusk等人，1993年). 为了确定新的BDNF转录物的转录起始位点，利用特异于外显子III、V、VII、VII和IXA的反义引物，从大鼠海马RNA中快速扩增cDNA末端（5′RACE）。对不同RACE克隆的测序分析表明，外显子III的主要转录起始位点位于152bp和230bp，外显子V的主要转录起始位点位于81bp，外显子VIII的主要转录起始位点位于相应外显子3′端上游的277bp和286bp，外显子IXA的主要转录起始位点位于该外显子主要剪接位点上游的476bp和363bp(图3). 已鉴定的5′外显子均不包含上游开放阅读框，因此使用这些5′UTR显然不会影响蛋白质产物的氨基酸组成。由于表达水平很低，我们未能绘制啮齿动物BDNF外显子VII的转录起始位点。然而，对人类啮齿动物外显子VII同源物的5′RACE分析表明，该外显子的转录起始位点位于其3′端上游285 bp处（Kazantseva等人，未发表）。这些数据有力地表明，类似于BDNF外显子I、II、IV和VI的mRNA(Timmusk等人，1993年)新的外显子III、V、VII、VIII和IXA mRNA也从不同的启动子转录。

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图3

大鼠BDNF新外显子III、V、VII、VIII和IXA mRNA转录起始位点的鉴定。进行5′cDNA末端快速扩增（5′RACE）以确定新BDNF转录物的转录起始位点。主要转录起始位点（短箭头）位于外显子III的152 bp和230 bp（箭头标记为A和B）、外显子V的81 bp和外显子VIII的277 bp和286 bp外显子IXA编码外显子（星号）的主要剪接受体位点上游476 bp和363 bp。对于外显子VII，最长EST的5′端被显示为假定的转录起始位点，因为由于外显子VII转录物的水平非常低，5′RACE没有产生任何特定的产物。外显子序列以粗体显示；内含子序列是小写字母。5′RACE中使用的引物的位置用长箭头表示。

DNA甲基化和组蛋白脱乙酰化对BDNF表达的差异调节

假设基因组中CpG二核苷酸中胞嘧啶残基的甲基化和核小体中组蛋白的翻译后修饰为不同组织（包括神经系统）的基因调控建立了表观遗传密码(谢和盖奇，2004年;巴拉斯和曼德尔，2005年)，我们研究了染色质结构对BDNF启动子转录活性的潜在作用。通过用DNA甲基转移酶抑制剂5AzadC或组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂TSA处理大鼠C6胶质瘤细胞和小鼠神经2A成神经细胞瘤细胞48小时，我们分别检测了DNA甲基化和组蛋白乙酰化在调节BDNF基因表达中的作用。

我们观察到，经5AzadC治疗后，大鼠C6胶质瘤细胞中BDNF外显子I和IV以及新的外显子V、VIII和IXA转录物的表达强烈激活(图4). 通过抑制DNA甲基化适度诱导C6细胞外显子III和VI的表达。5AzadC处理后，神经2A细胞中BDNF外显子I和外显子III转录物的表达显著诱导，而其他BDNF mRNA的水平没有变化(图4). 在Neuro2A细胞中，TSA治疗未能缓解任何BDNF启动子的抑制。然而，在C6细胞中，TSA对组蛋白脱乙酰化的抑制增加了BDNF外显子III、外显子VII和外显子IXA转录物的水平。毒蕈碱型乙酰胆碱受体基因M4被用作参考，因为其在除C6和Neuro2A以外的各种细胞系中的表达被5AzadC以细胞类型特异性的方式调节(Lunyak等人，2002年;Wood等人，2003年). 我们的发现表明，DNA甲基化和组蛋白去乙酰化可能在C6和Neuro2A细胞中以启动子和细胞特异的方式沉默BDNF基因中发挥作用。

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图4

通过DNA甲基化和组蛋白去乙酰化对BDNF基因表达的差异调节。用1μM 5-氮杂脱氧胞苷（5AzadC）处理大鼠C6胶质瘤和小鼠Neuro2A神经母细胞瘤细胞48小时，研究DNA甲基化在BDNF启动子转录活性中的作用。毒蕈碱型乙酰胆碱受体M4基因和组成性次黄嘌呤磷酸转移酶（HPRT）基因被用作参考基因。

海人酸诱发癫痫对大鼠海马BDNF外显子特异性mRNA的活性依赖性调节

谷氨酸类似物海人酸诱导细胞内Ca升高²⁺成年大鼠大脑海马和大脑皮层中四种先前特征BDNF启动子的水平和差异激活(Timmusk等人，1993年). 我们检测了含有新5′外显子的BDNF mRNA的表达是否在给药后1、3、6、12和24小时受到红藻氨酸的调节。结果揭示了BDNF转录物的不同调控模式。BDNF外显子I和IV转录物（根据Timmusk等人，1993年)以前被认为是对红藻氨酸处理反应最高度诱导的BDNF mRNA。值得注意的是，在我们的实验中，不仅这些BDNF转录物是由红藻氨酸诱导的，而且新的外显子V、VII、VIII和IXA mRNAs的水平在治疗后3-6小时达到上调峰值，随后迅速下调至基本水平(图5). 外显子IV转录物水平在治疗后3–24小时保持升高。含有外显子IIA、IIB和IIC的BDNF转录物在红藻氨酸处理下表现出不同的表达谱。外显子IIC转录水平在红藻氨酸治疗后3小时显著升高，6小时达到峰值，12–24小时下降。外显子2A和外显子2B转录物的表达水平在治疗后3小时适度增加，6小时下降，24小时达到基本水平(图5). 相反，BDNF外显子III和外显子VI mRNA的表达水平在研究的任何时间点都没有变化(图5). 这些结果与之前关于大鼠BDNF mRNA对红藻氨酸诱导癫痫反应的转录特异性调节的报告一致(Timmusk等人，1993年;Sathanoori等人，2004年)并首次证明新的BDNF mRNA受海人酸的差异调节。我们的数据强烈表明，BDNF基因中尚未探索的调节元件有助于BDNF mRNA表达的活性依赖性调节。

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图5

红藻氨酸诱导的癫痫发作对大鼠海马BDNF外显子特异性mRNA的活性依赖性调节。研究了红藻氨酸诱导的癫痫发作对成年大鼠脑海马不同BDNF转录物表达的影响。成年大鼠皮下注射红藻氨酸（8mg/kg体重），并在治疗后1、3、6、12和24小时处死。提取总RNA，进行半定量RT-PCR。未经处理的大鼠海马RNA作为对照。

我们感谢Kaur Jaanson和Epp Väli提供的技术援助，并感谢Priit Pruunsild激发的讨论和建议。