基因发育。2007年6月1日;21(11): 1367–1381.
自噬通过限制染色体不稳定性抑制肿瘤进展
,1,2 ,2,三 ,2,三 ,2 ,2,三 ,2,三 ,2 ,4,5和1,2,三,5,6
罗宾·马修
1美国新泽西州皮斯卡塔韦罗伯特·伍德·约翰逊医学院新泽西医学与牙科大学,邮编:08854;
2美国新泽西州皮斯卡塔韦罗格斯大学高级生物技术与医学中心,邮编:08854;
萨梅拉·孔加拉
2美国新泽西州皮斯卡塔韦罗格斯大学高级生物技术与医学中心,邮编:08854;
三美国新泽西州皮斯卡塔韦罗格斯大学分子生物学和生物化学系,邮编:08854;
布莱恩·博登
2美国新泽西州皮斯卡塔韦罗格斯大学高级生物技术与医学中心,邮编:08854;
三美国新泽西州皮斯卡塔韦罗格斯大学分子生物学和生物化学系,邮编:08854;
克里斯蒂娜·M·卡普
2美国新泽西州皮斯卡塔韦罗格斯大学高级生物技术与医学中心,邮编:08854;
凯文·布瑞
2美国新泽西州皮斯卡塔韦罗格斯大学高级生物技术与医学中心,邮编:08854;
三美国新泽西州皮斯卡塔韦罗格斯大学分子生物学和生物化学系,邮编:08854;
库尔特·德根哈特
2美国新泽西州皮斯卡塔韦罗格斯大学高级生物技术与医学中心,邮编:08854;
三美国新泽西州皮斯卡塔韦罗格斯大学分子生物学和生物化学系,邮编:08854;
陈光华
2美国新泽西州皮斯卡塔韦罗格斯大学高级生物技术与医学中心,邮编:08854;
盛侃金
4美国新泽西州皮斯卡塔韦市新泽西医学和牙科大学药理学系,邮编:08854;
5美国新泽西州新不伦瑞克新泽西癌症研究所,邮编:08903
艾琳·怀特
1美国新泽西州皮斯卡塔韦罗伯特·伍德·约翰逊医学院新泽西医学与牙科大学,邮编:08854;
2美国新泽西州皮斯卡塔韦罗格斯大学高级生物技术与医学中心,邮编:08854;
三美国新泽西州皮斯卡塔韦罗格斯大学分子生物学和生物化学系,邮编:08854;
5美国新泽西州新不伦瑞克新泽西癌症研究所,邮编:08903
1美国新泽西州皮斯卡塔韦罗伯特·伍德·约翰逊医学院新泽西医学与牙科大学,邮编:08854;
2美国新泽西州皮斯卡塔韦罗格斯大学高级生物技术与医学中心,邮编:08854;
三美国新泽西州皮斯卡塔韦罗格斯大学分子生物学和生物化学系,邮编:08854;
4美国新泽西州皮斯卡塔韦市新泽西医学和牙科大学药理学系,邮编:08854;
5美国新泽西州新不伦瑞克新泽西癌症研究所,邮编:08903
收到日期:2007年2月23日;2007年4月12日接受。
自噬是一个进化上保守的分解代谢过程,涉及通过溶酶体降解途径调节蛋白质和细胞器(如过氧化物酶体、线粒体和内质网)的周转和消除(水岛2005). 自噬过程的特点是形成双膜细胞溶质小泡,称为自噬体,对这些细胞器的溶酶体靶向至关重要。在酵母中,一些自噬相关基因(称为自动变速箱)已被鉴定为调节自噬体的形成和自噬过程(Klonsky等人,2003年). 已鉴定出这些酵母基因的几种哺乳动物同源物(莱文和克林斯基2004)其中重要的自噬基因第5天和第7天在证明自噬在哺乳动物发育中维持新陈代谢和体内平衡的作用方面信息最丰富。
自噬在低水平下具有组成性活性,在代谢应激下被强烈激活。自噬在发育中起着重要作用,因为小鼠由于完全缺乏自噬贝克林1(atg6/vps30),另一个重要的自噬基因,在胚胎发生早期死亡(Yue等人,2003年). 缺少老鼠第5天无法在新生儿饥饿期存活并在围产期死亡,表明自噬在维持能量平衡中起着重要作用(Kuma等人,2004年). 因此,自噬作为一种替代细胞能量来源,通过循环细胞质和大分子,在发育和饥饿期间维持正常代谢(金与白2007). 此外,有针对性地删除第5天和第7天在中枢神经系统中,多泛素化蛋白质的积累导致神经退行性变,揭示了自噬在调节长寿命或受损蛋白质以防止神经退行(小松等人,2005年;Hara等人,2006年). 自噬的保护作用还包括免疫相关功能,如防御病原体(Kirkegaard等人,2004年)和T淋巴细胞的发育(Pua等人,2006年). 因此,自噬在发育、生存和维持体内平衡中起着关键作用。
尽管进行性自噬作为一种生存途径发挥着主要作用,但如果允许其在持续的压力下和发育过程中继续完成,则可能导致细胞死亡。在果蝇属自噬细胞死亡在唾液腺发育中起着重要作用(Baehrecke 2003年). 在哺乳动物中,自噬蛋白Beclin1和Atg7对于caspase-8抑制剂zVAD-fmk在L929细胞和人U937细胞中诱导的自噬细胞死亡是必要的(Yu等人,2004年). 此外,抗凋亡bax(巴克斯)−/−/烘烤−/−小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)以Beclin1和Atg5依赖的方式对凋亡诱导物产生自噬细胞死亡反应(Shimizu等人,2004年). 阿尔茨海默病患者可见自噬样细胞死亡(Cataldo等人,1994年)和帕金森氏症(Anglade等人,1997年)和其他神经变性疾病(Klinsky和Emr 2000;Gomez-Santos等人,2003年). 然而,支持自噬作为细胞死亡机制的证据大多局限于体外细胞系中自噬的药理诱导,并且经常缺乏生理学方面的直接证据。此外,尚不清楚在上述情况下诱导自噬是否代表激活细胞死亡的特定途径,或仅仅是在压力下促进细胞存活的失败尝试。
自噬缺陷与其促进生存的功能相矛盾,它与肿瘤的发生有关,因为自噬基因的单倍体不充分贝克林1常见于散发的人类卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌(Aita等人,1999年)和等位基因缺失贝克林1促进小鼠散发性恶性肿瘤的发生(Qu等人,2003年;Yue等人,2003年). 此外,诸如I类磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)途径的致癌信号抑制自噬,但这是否或如何促进肿瘤发生尚不清楚。
我们已经证明,由于Bax/Bak缺乏或Bcl-2表达导致的细胞凋亡缺陷揭示了细胞对代谢应激的自噬反应,而代谢应激是细胞生存所必需的(Degenhardt等人,2006年). 等位基因缺失贝克林1损害构成性和应激诱导的自噬,导致永生化小鼠肾上皮细胞(iBMK)对代谢应激的敏感性(Degenhardt等人,2006年). 尽管自噬介导的生存受到损害,但自噬缺陷贝克林1+/−iBMK细胞比野生型细胞更有致瘤性,Bcl-2表达导致的凋亡缺陷进一步加剧了其致瘤性(Degenhardt等人,2006年). 在肿瘤中,自噬定位于代谢应激区域,这表明肿瘤细胞利用自噬生存代谢应激(Degenhardt等人,2006年). 因此,凋亡缺陷表现为自噬介导的生存途径,伴随的凋亡和自噬缺陷使细胞在促进肿瘤发生的同时易受代谢应激的影响(Nelson等人,2004年;Degenhardt等人,2006年). 然而,自噬的这两个明显矛盾的作用导致了一个悖论,即生存途径的丧失会促进肿瘤的发生。
尽管有几项研究将自噬与发育、蛋白质周转、细胞器维持和能量平衡联系起来,但对于自噬作为生存途径和肿瘤抑制机制的直观矛盾作用,还没有令人满意的解释。我们首次报道了自噬可以保护基因组。自噬缺陷,由贝克林1或缺乏第5天导致新陈代谢压力下存活率受损,DNA损伤反应增强。此外,Beclin1功能的丧失会促进基因扩增和染色体不稳定,导致非整倍体,所有这些都是癌症的标志,表明自噬在维持基因组完整性中起着重要作用。
结果
等位基因缺失贝克林1使iBMK细胞在体外对代谢应激敏感,并在体内损害自噬
为了了解等位基因缺失所导致的自噬受损的作用贝克林1在肿瘤发生过程中,从突变小鼠中永生化初级幼鼠肾上皮细胞,扩大了最初分离的独立细胞系的范围(Degenhardt等人,2006年). 然后对这些iBMK细胞的几个独立克隆进行工程设计,以表达抗凋亡蛋白Bcl-2。均表达永生化基因(E1A和p53DD),并且贝克林1+/−与贝克林1+/+iBMK细胞().
等位基因缺失贝克林1损害体外细胞存活和恢复,导致体内自噬缺陷。一个面板贝克林1+/+和贝克林1+/−对含有和不含Bcl-2的iBMK细胞进行缺血存活率测定,并用电镜分析恢复后的超微结构形态(A类)蛋白质印迹显示蛋白表达贝克林1+/+和贝克林1+/−含或不含Bcl-2的iBMK细胞。(B类)等位基因缺失贝克林1损伤体内肿瘤的自噬。贝克林1+/+和贝克林1+/−iBMK细胞被工程化以稳定表达EGFP-LC3,并被皮下注射到裸鼠中用于肿瘤形成。照片贝克林1+/+和贝克林1+/−植入后1d肿瘤切片显示野生型自噬强烈激活贝克林1+/+iBMK细胞与自噬缺陷患者的自噬受损贝克林1+/−iBMK细胞。(C类)等位基因缺失贝克林1导致对代谢应激的敏感性。的可行性贝克林1+/+和贝克林1+/−含有或不含Bcl-2的iBMK细胞的生存率降低贝克林1+/−iBMK细胞对缺血的反应。(D类)电子显微照片显示贝克林1+/−缺血应激后iBMK细胞表达Bcl-2。
以前的研究表明贝克林1iBMK细胞中自噬的严重缺陷导致凋亡缺陷细胞对代谢应激的敏感性增加(Degenhardt等人,2006年)在小组的所有细胞系中都复制了(; 见下文)。如前所述,这种对代谢应激的敏感性增强也与肿瘤发生性增强有关(Degenhardt等人,2006年). 为了测量自噬,贝克林1+/+和贝克林1+/−对稳定表达Bcl-2的细胞进行工程设计,以表达自噬标记物EGFP-LC3,并在体内监测细胞质膜易位,以指示自噬。自噬在年被强烈激活贝克林1+/+iBMK细胞过度表达Bcl-2,由于等位基因缺失贝克林1(Degenhardt等人,2006年). 表达Bcl-2的野生型iBMK细胞在肿瘤组织中大量诱导自噬,点状细胞质LC3易位表明(,红色箭头)。与之形成鲜明对比的是,自噬缺陷的肿瘤贝克林1+/−表达Bcl-2的iBMK细胞主要表现为弥漫性定位,表明自噬缺陷(). 由于移植瘤在植入的早期阶段缺乏氧气和营养,无法建立足够的血管(Nelson等人,2004年)这一观察结果表明,肿瘤细胞利用自噬途径在体内生存间歇性代谢应激。这与我们早期的观察结果一致,即细胞凋亡缺陷揭示了自噬的生存途径,并且自噬定位于肿瘤中的代谢应激区域(Degenhardt等人,2006年).
为了确认贝克林1+/−iBMK细胞自噬存活率受损,如前所述测定缺血下的存活率(Degenhardt等人,2006年)使用1%氧气混合物和不含葡萄糖的培养基模拟体外肿瘤微环境中的代谢应激条件(Nelson等人,2004年). 凋亡相关蛋白的敏感性没有显著差异贝克林1+/+和贝克林1+/−不含Bcl-2的细胞。相反,贝克林1+/−与野生型细胞相比,表达Bcl-2的细胞对缺血表现出显著的敏感性()这表明代谢应激是细胞凋亡的一个强有力的触发因素,在自噬表现出来之前,凋亡活性细胞很容易被清除。
等位基因缺失贝克林1妨碍代谢应激的恢复
为了进一步了解代谢应激导致的自噬反应受损如何影响体内平衡,贝克林1+/+和贝克林1+/−表达Bcl-2的iBMK细胞缺血7d后恢复,并通过电子显微镜监测超微结构形态。野生型贝克林1+/+缺血7d后表达Bcl-2的iBMK细胞从正常形态转变为浓缩形态()并在这些条件下保持了较高的生存能力(Degenhardt等人,2006年). 大多数野生型细胞在恢复4小时后恢复正常形态,几乎所有野生型细胞都在恢复8小时后恢复了正常形态贝克林1+/−表达Bcl-2的iBMK细胞通常表现出坏死形态增强和细胞死亡,细胞质高度空泡化,即使在恢复8小时后,也很少有恢复到正常形态的迹象(). 这些观察结果表明,自噬不仅促进生存,而且有助于从代谢应激中恢复,这表明自噬是一种适应间歇性营养消耗的特殊过程,能够高保真地恢复正常细胞功能。
自噬抑制DNA损伤以应对代谢应激
目前尚不清楚自噬缺陷如何在提高肿瘤发生率的同时降低生存率。一种可能的解释是,通过降低代谢应激下的存活率,有缺陷的自噬可能会增加DNA损伤,从而增加剩余存活细胞的突变率,促进肿瘤进展。类似地,DNA修复关键基因的突变会对DNA损伤产生敏感性,但会通过增加突变率来增强肿瘤的发生(Symington 2002年). 为了验证这一假设,我们评估了表达Bcl-2的野生型和自噬缺陷型iBMK细胞系,以检测组蛋白H2AX(γ-H2AX)的Ser 139磷酸化,表明DNA双链断裂(DSB)和代谢应激(缺血)引起的DNA损伤反应的激活。两者都有贝克林1+/+和贝克林1+/−表达Bcl-2的iBMK细胞的核γ-H2AX染色基础水平较低(). 野生型贝克林1+/+表达Bcl-2的iBMK细胞在3天的过程中逐渐对代谢应激反应显示出γ-H2AX水平的适度诱导(). 相反,自噬缺陷贝克林1+/−表达Bcl-2的iBMK细胞在代谢应激下γ-H2AX染色水平显著增加(). 通过Western blotting对γ-H2AX水平的分析提供了类似的结果,显示贝克林1+/−表达Bcl-2的细胞(). 由于自噬缺陷也可能与其他形式的应激有关,例如诱导未折叠蛋白反应(UPR),因此还检测了GRP-78的水平,这是UPR的早期标志物。然而,野生型和贝克林1这些时间点的突变细胞(). 因此贝克林1突变细胞提示自噬缺陷可能促进代谢应激诱导的DNA损伤。
等位基因缺失贝克林1促进代谢应激下的DNA损伤反应。代表贝克林1+/+(WB-A2)和贝克林1+/−表达Bcl-2的(BLNB-A4)iBMK细胞系受到缺血应激,并通过免疫荧光和蛋白质印迹通过γ-H2AX的诱导来测量DNA损伤反应。(A类)显示γ-H2AX在贝克林1+/−表达Bcl-2(BLNB-A4)的iBMK细胞系是DNA损伤的标志。(B类)γ-H2AX阳性细胞的定量贝克林1+/+(WB-A2)和贝克林1+/−表达Bcl-2的(BLNB-A4)iBMK细胞系A类将γ-H2AX阳性病灶的细胞核百分比制成表格。数据表示平均值±标准偏差。注意γ-H2AX在贝克林1+/−表达Bcl-2的iBMK细胞系(BLNB-A4)与野生型相比。(C类)Western blot时间进程显示γ-H2AX(DNA损伤标记)和GRP-78(UPR标记)贝克林1+/+(WB-A2)和贝克林1+/−(BLNB-A4)iBMK细胞系,均表达Bcl-2。
等位基因缺失贝克林1增加中心体异常的频率
在标准组织培养条件下,自噬介导的生存缺陷如何促进肿瘤的发生,这进一步通过具有异常形状细胞核的大细胞的积累来揭示,特别是在贝克林1+/−表达Bcl-2的iBMK细胞。为了描述贝克林1+/+和贝克林1+/−检测表达Bcl-2的iBMK细胞、微管网络、DNA和中心体。贝克林1+/+表达Bcl-2的iBMK细胞具有完整的自噬途径,细胞大小保持正常,微管骨架均匀,核形状,中心体数量主要正常(每个细胞一个或两个中心体)(). 相反,自噬缺陷贝克林1+/−表达Bcl-2的iBMK细胞显示出严重的微管和中心体异常,包括细胞和细胞核大小和形状的异质性()中心体异常细胞百分比增加,包括中心体数量增加(). 微管框架中的异常现象可能是由于异常大的细胞尺寸引起的,此外,多余的中心体和大核是DNA含量过剩和基因组不稳定性的特征(Nigg 2002年). 这些异常贝克林1+/−iBMK细胞表明,自噬和代谢的维持对于限制DNA损伤和维持基因组完整性至关重要。
等位基因缺失贝克林1促进细胞核、中心体和倍性异常。贝克林1+/+和贝克林1+/−用荧光显微镜分析含有和不含Bcl-2的iBMK细胞,并用流式细胞术分析DNA含量。(A类)代表性显微照片贝克林1+/+和贝克林1+/−表达Bcl-2(WB-A2和WB-D1、BLNB-A4和BLNB-C2)的iBMK细胞通过微管(抗α-微管蛋白)、DNA(DAPI)和中心体(抗γ-微管素)的间接免疫荧光染色。注意广泛的微管网络、不均匀的核大小以及中心体结构和数量异常的积累贝克林1+/−突变体(箭头所示)。(B类)中心体数的定量A类。中心体数目正常(一个或两个;蓝色条)和多个中心体(两个以上;紫色条)的细胞百分比。数据表示平均值±SD(C类)一组患者的流式细胞术分析贝克林1+/+和贝克林1+/−iBMK细胞系显示其DNA含量。A类贝克林1+/+具有二倍体DNA含量的iBMK细胞系(W4-B1)用作分析的正常对照(在每个面板中以绿色显示)。注意非整倍体DNA含量在贝克林1+/−表达Bcl-2的突变体。(D类)中的DNA含量分析摘要C类显示P(P)通过双尾Fisher精确检验得出的值。(E类)研究中使用的细胞系世系及其倍性状态,显示出独立的、基因型特异的倍性异常出现。
等位基因缺失贝克林1在凋亡缺陷背景下表现出倍性异常
研究基因组不稳定性的可能性贝克林1突变细胞,DNA含量多,独立贝克林1+/+和贝克林1+/−通过流式细胞术测定iBMK细胞系及其表达Bcl-2的对应物。细胞凋亡相容性贝克林1+/+和贝克林1+/−iBMK细胞系主要是二倍体细胞,每种细胞系中只有六分之一的细胞系表现出二倍体和非整倍体细胞的混合群体(). 因此,等位基因缺失贝克林1没有明显改变倍性,可能是由于功能性凋亡途径对非整倍体的负选择。Bcl-2表达的流式细胞术分析贝克林1+/+和贝克林1+/−然而,iBMK细胞系显示,与贝克林1不足(). 全部八个贝克林1+/−表达Bcl-2的iBMK细胞系是非整倍体,而八分之一的Bcl-2表达贝克林1+/+iBMK细胞系显示非整倍体(). 倍性异常以基因型特异的方式独立出现(). 总的来说,这些观察结果表明,自噬的损伤促进了中心体和DNA含量的异常,而这些异常是在凋亡缺陷的背景下保存的。
等位基因缺失贝克林1自噬缺陷会导致染色体数量和结构异常
中心体数量和细胞DNA含量的增加通常是由染色体数量的增加引起的。为了进一步研究等位基因丢失的作用贝克林1以及DNA含量异常积累中自噬受损,我们测定了贝克林1+/+和贝克林1+/−含或不含Bcl-2的iBMK细胞。自噬能力贝克林1+/+iBMK细胞显示出接近正常的二倍体染色体数,组平均数为38(正常小鼠染色体数为40),与Bcl-2的表达无关()和等位基因缺失贝克林1当细胞凋亡有功能时,对平均染色体数的影响不大(组平均值,42)(). 野生型贝克林1+/+表达Bcl-2的iBMK细胞也显示出接近正常的二倍体染色体数目(组平均值为38)。相反,贝克林1+/−表达Bcl-2的iBMK细胞中期染色体显著增加,平均染色体数接近三倍体(组平均56)()表明自噬抑制非整倍体。除了染色体数量异常外,贝克林1+/−表达Bcl-2的iBMK细胞也表现出显著的结构异常,包括存在双分钟染色体(,红色箭头),表明基因扩增增加的可能性(Gebhart 2005年).
贝克林1+/−iBMK细胞表现出染色体不稳定性。的面板贝克林1+/+和贝克林1+/−对含有和不含Bcl-2的iBMK细胞进行中期扩散染色体数分析,并用流式细胞术分析这些细胞系的子集在组织培养中的倍性变化。(A类)用诺卡唑(0.5μg/mL)处理细胞,制备中期染色体(布朗和巴尔的摩2000). 该面板显示了来自每个基因型的至少100个Geimsa染色有丝分裂图的代表性显微照片。二倍体贝克林1+/+iBMK细胞系W4-B1显示为每个基因型的对照。请注意贝克林1+/−表达Bcl-2的iBMK细胞,箭头指示双微小染色体。(B类)显示平均值的染色体数散点图(数据指向左边)和中位数(数据指向正确的)每个单元格行中的值。对每个细胞系的一个中期进行计分。每组平均染色体数的平均值显示为每个基因型的水平黑线。(C类)表达Bcl-2的第5代和第25代的流式细胞术分析贝克林1+/+和贝克林1+/−iBMK细胞系(红色)显示从二倍体到非整倍体状态的转变。细胞系在相同的培养条件下保持平行。二倍体贝克林1+/+iBMK细胞系W4-B1(以绿色显示)用作对照。
由于这些iBMK细胞系来源于正常的原代上皮细胞,有缺陷的自噬可能促进检查点失活(p53和pRb通路)所允许的染色体畸变的逐渐积累,并进一步表现为凋亡受损。为了确定这些倍性异常何时出现,我们检查了这两种基因的早期传代(第5段)贝克林1+/+和贝克林1+/−表达Bcl-2的iBMK细胞系DNA含量。事实上,八篇早期文章中有七篇贝克林1+/+表达Bcl-2的iBMK细胞系显示出二倍体DNA含量,并且只有一个细胞系(WB-B1)观察到非整倍体,与之前的观察结果相同。相反,八个样本中有六个样本存在明显的非整倍性贝克林1+/−早在第5代iBMK细胞就表达Bcl-2。有趣的是,八篇早期文章中的两篇贝克林1+/−表达Bcl-2(BLNB-A4和BLNB-C2)的iBMK细胞系在随后的传代数中表现出非整倍性()在第5代时为二倍体,这表明这两种细胞系在组织培养的传代过程中出现了非整倍体。然而,在体外继续繁殖导致了二倍体的转化贝克林1+/−,但不是贝克林1+/+,向非整倍体细胞表达Bcl-2的iBMK细胞(). 这表明正常组织培养构成了一种代谢应激水平,可能足以表现为自噬缺陷细胞的基因组不稳定性。因此,组成性自噬功能可以抑制培养过程中逐渐发生的染色体不稳定性,这种不稳定性可能是由于组成性代谢应激水平低所致,而细胞凋亡在这些细胞从人群中消失中起着作用。事实上,在表达Bcl-2或bax/bak(巴克斯/巴克)-iBMK细胞缺陷,通过等位基因缺失或RNA干扰减少贝克林1(Degenhardt等人,2006年).
等位基因缺失贝克林1与基因扩增和染色体的获得和丢失有关
目的:探讨染色体等位基因缺失导致染色体不稳定性增强的机制贝克林1特别是双分钟染色体的形成,我们探索了自噬抑制DNA损伤从而抑制基因扩增的可能性。基因扩增是癌基因激活和化疗耐药的主要机制,由DNA DSB引起(Little和Chartrand 2004). p53 DNA损伤检查点的失活促进了这一过程(Livingstone等人,1992年;怀特等人,1994年),氧化应激增加(特别是H2哦2) (Mondello等人,2002年)和DNA修复缺陷(Lin等人,2001年). 此外,基因扩增是已知的N-膦酰基-l-天冬氨酸(PALA)抗性机制,它通过抑制氨甲酰-P合成酶/天冬氨酰转羧酶/二氢鸟嘌呤酶(CAD)复合物阻止从头合成嘧啶,并选择计算机辅助设计基因扩增(Livingstone等人,1992年). 为了检测基因扩增倾向,我们测试了贝克林1+/+和贝克林1+/−iBMK细胞系。
自噬缺陷,贝克林1+/−iBMK细胞在PALA中的集落形成率比对照组增加了约50到1000倍贝克林1+/+iBMK细胞为PALA LD的五倍50,与凋亡缺陷无关(). 细胞凋亡抑制进一步增加了PALA抵抗的频率贝克林1+/−细胞系,但只有几倍(). 应该注意的是贝克林1+/−PALA存在时,菌落生长()这表明这是真正的耐药性,而不仅仅是自噬细胞死亡的失败。贝克林1+/+未表达Bcl-2的iBMK细胞显示出明显较低的PALA耐药频率,而Bcl-2通过凋亡阻断使PALA耐药率略有增加(). 事实上,PALA抗性克隆显示计算机辅助设计基因(). 这些数据表明,缺陷的自噬通过基因扩增促进耐药性,而缺陷的凋亡则进一步增强了耐药性。
等位基因缺失贝克林1促进PALA抗性和染色体的获得和丢失。的多个独立克隆贝克林1+/+和贝克林1+/−含有和不含Bcl-2的iBMK细胞系接受PALA选择(Livingstone等人1992)和aCGH(Kallioniemi等人,1992年). (A类)显示PALA耐药菌落(100μM)的代表性显微照片。使用LD的三倍和五倍进行PALA选择50浓度(分别为60μM和100μM)。(B类)PALA电阻频率的定量贝克林1+/+和贝克林1+/−含或不含Bcl-2的iBMK细胞。PALA抗性频率被确定为每3×10个抗性菌落的数量5细胞。(C类)抗PALA克隆显示计算机辅助设计基因扩增计算机辅助设计-特定PCR。面板显示了从未经处理(U)或PALA处理的基因组DNA中分离出的PCR反应产物(针对指定的周期数)(756 bp)(T型)贝克林1+/−iBMK细胞表达Bcl-2。(D类)aCGH的代表性全基因组DNA拷贝数图谱贝克林1+/+(W4-B1、W4-C1、WB-3、WB-A2、WB-D1)和贝克林1+/−(BLN-4-1、BLN-34-3、BLNB-13、BLNB-A4、BLNB-C2)iBMK细胞系中含有和不含有Bcl-2的细胞,其染色体的获得和丢失在贝克林1+/−突变体。绘制的是日志2从细胞系分离的基因组DNA与正常等基因小鼠肾脏基因组DNA的转化杂交比率。(E类)中特定染色体增益(蓝色条)和损耗(紫色条)的摘要贝克林1+/+和贝克林1+/−iBMK细胞系(n个=每个5)。完整或部分染色体剂量变化以频率表示。请注意贝克林1+/−iBMK细胞(双尾Fisher精确检验;P(P)= 0.003).
在贝克林1+/−iBMK细胞促使我们分析贝克林1+/+和贝克林1+/−通过基于微阵列的比较基因组杂交(aCGH)研究iBMK细胞系的随机增益和损耗(Kallioniemi等人,1992年). 自噬活性细胞中出现频率较低的随机染色体增减贝克林1+/+iBMK细胞系,与贝克林1+/−iBMK细胞系,在几乎所有染色体中都显示出广泛的染色体增益和丢失(). 由于aCGH只检测相对拷贝数的变异而不检测倍性,因此在aCGH数据中观察到的增加的染色体增益和丢失并不能解决有丝分裂扩散和DNA含量分析中明显的绝对染色体变异(,). 然而,这些数据表明贝克林1杂合性增强了基因剂量变异,这可能伴随着流式细胞术观察到的总倍性异常。
嘧啶生物合成的抑制引发自噬,从而抑制DNA损伤
基因扩增的诱导贝克林1突变细胞提出了一种有趣的可能性,即PALA和由此产生的嘧啶饥饿(其本身可能是一种代谢应激)促进了自噬诱导。因此,我们测试了自噬的相对诱导贝克林1+/+和贝克林1+/−iBMK细胞通过稳定表达细胞中EGFP-LC3的胞质-膜易位对PALA作出反应。两组的自噬水平均较低贝克林1+/+和贝克林1+/−iBMK细胞表达Bcl-2。PALA暴露48小时内(60μM),野生型贝克林1+/+表达Bcl-2的iBMK细胞表现出显著的自噬诱导作用(50%),并且这种自噬的诱导作用在突变株中显著降低(9%)贝克林1+/−表达Bcl-2的iBMK细胞(). 这表明嘧啶的药物消耗会触发自噬。
PALA诱导的自噬受损,导致DNA损伤反应的积累贝克林1+/−单元格,而不是贝克林1+/+细胞。等位基因缺失贝克林1与相应的野生型细胞系相比,PALA治疗导致自噬受损,DNA损伤反应增强。(A类)代表性显微照片贝克林1+/+(WB-13 LC3)和贝克林1+/−(BLNB-13 LC3)iBMK细胞系稳定表达EGFP-LC3,表明EGFP-LC3在细胞中缺乏定位贝克林1+/−(BLNB-13 LC3)iBMK细胞系表明PALA治疗后自噬受损(60μM)。(B类)EGFP-LC3易位百分率的定量显示自噬A类如前所述(Degenhardt等人,2006年). 数据表示平均值±标准偏差。注意,自噬诱导贝克林1+/−即使在PALA处理48小时后,其细胞数仍约为野生型细胞的五倍。(C类)γ-H2AX免疫染色的代表性显微照片贝克林1+/+iBMK细胞表达Bcl-2(WB-13 LC3)和贝克林1+/−在PALA治疗后表达Bcl-2(BLNB-13 LC3)的iBMK细胞显示增强的DNA损伤反应贝克林1+/−与野生型细胞相比,iBMK细胞表达Bcl-2。(D类)γ-H2AX阳性细胞百分比的定量如所示C类数据表示平均值±SD(E类)Western blot显示γ-H2AX和GRP-78水平贝克林1+/+(WB-A2)和贝克林1+/−(BLNB-A4)iBMK细胞,均表达Bcl-2。
PALA耗尽嘧啶核苷酸(dNTP)池,在检查点不足的细胞中,这可能导致复制应激和DNA损伤。自噬缺陷细胞可能特别容易受到这种高度特异性的代谢应激,这可能会加剧复制应激和DNA损伤。因此,我们测试了两者在PALA暴露后的DNA损伤反应贝克林1+/+和贝克林1+/−iBMK细胞通过评估γ-H2AX(DSB的早期标记物)的积累。在两组中均观察到低水平的基础DNA损伤贝克林1+/+和贝克林1+/−表达Bcl-2的iBMK细胞(,). 突变株中PALA暴露后,γ-H2AX染色显著增加贝克林1+/−iBMK细胞表达Bcl-2,而在野生型细胞中,这种增加显著减少(). 事实上,Western blot分析证实γ-H2AX在贝克林1+/−iBMK细胞(). 此外,未观察到表明UPR的GRP-78诱导().
以下方面的不足第5天易受代谢压力影响
为了确定对代谢应激和基因组不稳定的敏感性是否是由于自噬缺陷,而不限于贝克林1,永生化iBMK细胞系来源于缺乏必需自噬基因的小鼠第5天(Kuma等人,2004年). 多个独立的iBMK细胞系来源于第5天+/+,第5天+/−、和第5天−/−小鼠和Western blot分析证实ATG5蛋白在第5天−/−()并且在第5天+/−(未显示数据)与第5天+/+iBMK细胞系(). 所有iBMK细胞株均按预期表达E1A和p53DD(). 为了证实在代谢应激下ATG5的丢失会损害自噬,暂时表达LC3-EGFP的野生型、杂合型和缺陷型ATG5 iBMK细胞(6.1、5.1和7.1)受到代谢应激,并测定表明自噬的膜移位百分比。在正常生长条件下,所有细胞系的EGFP-LC3易位水平均较低,而代谢应激诱导细胞自噬的显著上调第5天+/+在第5天+/−而在第5天−/−iBMK细胞系(,自噬百分比显示在面板右上角)。为了测试ATG5缺失导致的自噬缺陷是否也会影响代谢应激下的存活率,这些细胞系通过长期计算机视频延时显微镜(CVTL)进行监测。第5天+/+iBMK细胞系在24小时受到的影响最小,如预期的那样,在代谢应激48小时时,细胞凋亡的形态学迹象变得明显(). 与第5天+/+同时,细胞凋亡在第5天+/−在第5天−/−iBMK细胞系(). 因此,ATG5缺乏会影响代谢应激中的自噬和生存,同样,ATG6等位基因丢失也会影响贝克林1(;Degenhardt等人,2006年),但在更大程度上如此。这表明癌症细胞对代谢应激的存活率受损与先前报道的自噬失活方式无关(Degenhardt等人,2006年).
ATG5缺乏会降低生存率,并促进代谢应激下的DNA损伤反应。(A类)蛋白质印迹显示亲代的蛋白质表达水平第5天+/+和第5天−/−iBMK细胞系。(B类)二维延时视频的帧第5天+/+(6.1),第5天+/−(5.1),以及第5天−/−(7.1)如前所述执行的电池(Degenhardt等人,2006年)显示在指定时间点缺血下的不同存活率。数字表示总共300个细胞中LC3-EGFP易位的细胞百分比,表明在指定的时间点发生自噬。(C类)显示γ-H2AX诱导的典型显微照片第5天+/+和第5天−/−亲代iBMK细胞系(6.1和7.1)对48小时缺血治疗的反应(D类)γ-H2AX阳性细胞的定量第5天+/+(6.1)和第5天−/−(7.1)iBMK细胞系C类数据表示平均值±SD(E类)Western blot显示两个独立的第5天+/+和第5天−/−表达Bcl-2(分别为6.1B2、6.1B3、7.1B4和7.1B5)的iBMK细胞系和相应的载体对照(6.1V1、6.1V2、7.1V1和7.1V2)。(F类)代表性显微照片第5天+/+和第5天−/−表达Bcl-2的iBMK细胞显示DAPI染色的未经处理的细胞核(左边)或接受代谢应激治疗(正确的)持续10天,然后恢复2天。注意核大小和形状的明显异常第5天−/−单元格(黄色箭头)。(G公司)原子核大小的量化第5天+/+和第5天−/−表达Bcl-2的iBMK细胞系,如F类数据表示平均值±SD(H(H))相对克隆存活率第5天+/+和第5天−/−缺血10天和恢复2天后表达Bcl-2(6.1B2和7.1B4)的iBMK细胞系。数据表示平均值±标准偏差(我)显示γ-H2AX诱导的典型显微照片第5天+/+和第5天−/−表达Bcl-2(6.1B2和7.1B4)的iBMK细胞系。(J型)Bcl-2表达中γ-H2AX阳性核百分比的定量第5天+/+和atg5−/−iBMK细胞如所示我数据表示平均值±SD。
ATG5缺乏促进DNA损伤反应的激活
确定ATG5缺乏引起的代谢应激敏感性增强是否也导致DNA损伤反应增强,如观察到的等位基因丢失贝克林1在正常和应激条件下监测γ-H2AX核染色的外观。自噬缺陷,第5天−/−在正常生长条件下,细胞的γ-H2AX染色水平略高,与野生型相比,代谢应激显著增加第5天+/+单元格().
为了测试依赖ATG5的自噬是否能在代谢应激下进一步激活凋亡缺陷细胞的活性并抑制DNA损伤,Beclin1也是如此,第5天+/+和第5天−/−iBMK细胞系与载体对照一起被工程化表达Bcl-2(). 当受到代谢应激10 d后恢复2 d时,Bcl-2表达第5天−/−iBMK细胞系表现出明显的核形态异常(增大的大小和不规则的形状表明染色体不稳定)()与表达Bcl-2的克隆形成存活率相比,与显著受损相关第5天+/+iBMK细胞(). 尽管第5天即使存在凋亡阻滞(数据未显示),缺乏也会降低代谢应激下的存活率,正如观察到的贝克林1(;Degenhardt等人,2006年),营养和氧气的补充大大加剧了这种生存缺陷(). 代谢应激后,在表达Bcl-2的小鼠中也观察到恢复受损贝克林1+/−iBMK细胞(). 这表明,自噬缺陷导致应激条件下基因组损伤增加,当细胞恢复正常生长状态时,这种损伤更为明显。为了测试这一点,Bcl-2-表达第5天+/+和第5天−/−监测iBMK细胞系在应激和恢复条件下的γ-H2AX阳性细胞核。表达Bcl-2第5天+/+iBMK细胞显示出很少的γ-H2AX阳性细胞核,正如预期的那样,应激会适度增加γ-H2AX阳性细胞核的出现(). 相反,Bcl-2表达第5天−/−iBMK细胞在应激和恢复期间γ-H2AX阳性核显著增加(). 因此,自噬的失活是由于贝克林1或缺乏第5天增强细胞对DNA损伤的反应,增加对代谢应激的敏感性。这支持了自噬途径在抑制基因组损伤和使癌细胞在饥饿条件下存活方面的作用。细胞周期检查点的失活和癌细胞的凋亡可能会进一步显示自噬缺陷导致的基因组损伤,从而导致肿瘤的进展。
讨论
本文所述的结果表明,自噬具有限制DNA损伤和染色体不稳定的功能,这可能解释了其抑瘤活性。因此,我们的研究提供了代谢调节和基因组完整性之间的第一个机制联系。我们在此报告,自噬受损导致贝克林1+/−和第5天−/−体外培养的iBMK细胞易受代谢应激的影响。然而,自噬缺陷细胞的存活率受损被突变率增加和染色体不稳定所克服,导致非整倍体加速发展,这是癌症的标志,这就解释了为什么这种生存途径的丧失可以抑制肿瘤发生。我们发现自噬缺陷细胞的这些异常也伴随着DNA损伤反应的增加。有趣的是,嘧啶饥饿引发了自噬,自噬缺陷足以促进DNA损伤反应和自噬不足细胞的基因扩增。因此,我们的数据表明,构成性和应激诱导的自噬功能可以限制DNA损伤并保持基因组完整性,从而确定了缺陷自噬在促进肿瘤发生中的新作用,但不一定是唯一作用。
自噬、代谢缺陷和染色体不稳定性
我们早些时候已经证明,凋亡缺陷通过自噬使代谢应激存活,同时凋亡和自噬途径的损伤导致坏死细胞死亡,作为一种非细胞自主机制促进肿瘤发生(Degenhardt等人,2006年). 我们目前的研究结果表明,自噬通过维持基因组完整性在抑制肿瘤发生方面也有更直接的作用。代谢应激是人体实体瘤中常见的现象(Folkman 2003年)它能有效触发细胞凋亡(Nelson等人,2004年). 因此,自噬作为能量生产的替代手段可能有助于肿瘤细胞缓解代谢应激。在正常发育过程中第5天−/−在新生儿饥饿期间,小鼠会损害心脏组织的存活,导致早期死亡(Kuma等人,2004年). 然而,尽管自噬缺陷会阻碍生存,但自噬的缺陷会促进肿瘤的发生贝克林1+/−iBMK细胞比具有自噬能力的细胞更有致瘤性贝克林1+/+iBMK细胞(Degenhardt等人,2006年). 因此,在突变体中观察到增强的基因扩增和染色体不稳定性贝克林1+/−表达Bcl-2的细胞可以通过增加突变率来促进肿瘤的发生,从而使细胞克服生存缺陷。这一观察结果类似于DNA修复缺陷细胞的致瘤性增加,这种缺陷细胞对DNA损伤剂和电离辐射敏感,同时促进致癌突变的积累(Symington 2002年).
代谢应激、基因扩增和肿瘤发生
我们的证据表明,肿瘤的发生源于突变的积累,而这些突变是由自噬缺陷导致的代谢缺陷所促成的。自噬缺陷第5天−/−新生儿会导致致命的能量消耗,血浆和组织中的氨基酸浓度低,从而损害正常的心脏功能(Kuma等人,2004年). 对于重要的细胞过程,如自噬缺陷细胞中的DNA复制或修复,ATP生成不足可能会导致复制叉停滞和断裂-融合-桥接循环,从而导致基因扩增和肿瘤发生(Hellman等人,2002年;Narayanan等人,2006年;金与白2007). 此外,自噬的基本内务管理功能是蛋白质质量控制和体内平衡所必需的,因为自噬受损的神经细胞会积累多泛素化蛋白质(Hara等人,2006年;小松等人,2006年). 根据这一发现,我们观察到自噬缺陷贝克林1+/−和第5天−/−含有Bcl-2的细胞从缺血应激中恢复也很差,胞浆和其他细胞聚集物呈空泡状。在自噬缺陷的细胞中,控制有丝分裂或中心体功能的关键细胞蛋白的损伤可能是染色体不稳定的一个原因。此外,由于对受损线粒体的无效清除而导致活性氧的过度生成是另一种可能的机制,自噬缺陷可促进DNA损伤和肿瘤发生(金2006). 这些机制中的任何一种或全部是否与自噬缺陷细胞的基因组改变有关尚待确定。
基因扩增是DSB允许水平的结果,是实体肿瘤中癌基因激活的主要机制,例如myc公司,表皮生长因子受体、和erbB2(Shen等人,1986年;轩尼诗等,2005年;阿尔伯森2006). 基因扩增还导致无着丝粒的染色体外片段,称为双分钟,这是人类实体瘤中常见的染色体畸变(Albertson等人,2003年). 此外,大多数人类肿瘤以接近三倍体DNA含量的形式表现出非整倍性(Barlogie等人,1982年),但实现这一点的机制尚不清楚。通过抑制应激下的DNA损伤,自噬可能作为一种肿瘤抑制机制抑制非整倍体的进展。
总之,我们的数据表明,自噬减少会促进DNA损伤、基因扩增、染色体不稳定和非整倍体,所有这些在临床上都与肿瘤进展和不良预后有关。类似的发现与等位基因缺失贝克林1在永生化的乳腺上皮细胞(V.Karantza Wadsworth,pers.com.)和永生化的自噬缺陷细胞中第5天−/−小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)(S.Jin,pers.comm.)表明,这些观察结果与组织类型无关。类似于哺乳动物中枢神经系统,靶向删除第5天或atg7型通过预防多泛素化蛋白的积累和神经退行性变,揭示了构成性自噬的保护作用(Hara等人,2006年;小松等人,2006年)在肿瘤细胞中,通过自噬防止基因组损伤可能是肿瘤抑制的一种重要的细胞自主机制。
自噬缺陷、基因组不稳定性和新的治疗策略
对自噬在限制染色体不稳定性中的新作用的鉴定为我们理解自噬如何调节基因组完整性和影响肿瘤发生提供了新的见解。此外,自噬功能限制染色体不稳定性的发现可能对合理的化疗和化疗预防有意义。由于肿瘤细胞经常获得自噬缺陷,自噬的药理激活可能有助于限制基因组损伤和肿瘤发生。或者,在已确立的具有凋亡缺陷的侵袭性癌症中,抑制自噬生存途径可被用于治疗,以促进其他模式的细胞死亡,如代谢突变,将细胞重定向至急性坏死细胞死亡(金与白2007).
材料和方法
稳定细胞系的产生
原代上皮细胞分离自贝克林1+/+和贝克林1+/−小鼠(由纽约州纽约市西奈山医学院岳振宇博士慷慨提供)通过视网膜母细胞瘤(Rb)和p53通路失活而永生(Degenhardt等人,2002年,2006),每个的四个独立克隆被转染载体(W4-A1、W4-B1、W4-C1、W4-E1和BLN-A3、BLN-B2、BLN-C3、BLN-D1)或被工程表达Bcl-2(WB-A2、WB-B1、WB-D1、WB-D3和BLNB-A4、BLNB-B1、BLNB-C2、BLNB-D1),扩大了原始细胞系库(Degenhardt等人,2006年)从12到28。原代上皮细胞分离自第5天+/+,第5天+/−、和第5天−/−新生小鼠(由日本东京都医学科学院水岛Noboru博士善意提供),并如前所述永生(Degenhardt等人,2002年)生成第5天+/+(6.1),第5天+/−(5.1),以及第5天−/−(7.1)iBMK细胞系。野生型第5天(6.1)和第5天−/−(7.1)然后用载体(6.1V2,6.1V3)转染iBMK细胞,或通过工程表达Bcl-2(6.1B4,6.1B5)。
蛋白质印迹、免疫荧光和电子显微镜
如前所述进行蛋白质印迹、免疫荧光和EM(Nelson等人,2004年;Degenhardt等人,2006年). 使用以下抗体进行蛋白质印迹和免疫荧光:抗Beclin1、抗Bcl-2(Santa Cruz Biotechnology);抗p53(Ab-1)、抗E1A和抗肌动蛋白(癌基因);抗α-微管蛋白(钙生物化学);DNA(DAPI,Sigma);抗γ-微管蛋白(Axel);抗γH2AX(S139)(Upstate Biotechnology);抗ATG5(水岛等人,2001年).
DAPI染色和核大小定量
细胞核的DAPI染色如前所述进行(Nelson等人,2004年). 使用Image-Pro Plus软件计算相对核尺寸。简单地说,拍摄了具有代表性的显微照片(600×),并使用基于直方图的分割确定了核边界,计算了面积,并将相对核大小表示为μ2.
PALA抗性克隆频率的测量
LD公司50PALA的贝克林1+/+和贝克林1+/−iBMK细胞(105/10 cm培养皿),通过将不同浓度的PALA(0–100μM)(国家癌症研究所药物合成与化学分所)处理细胞3 d,并通过台盼蓝排除法测定细胞活力。PALA抗性频率被确定为每3×10形成的PALA抗性克隆数5用3×LD处理后的细胞50和5×LD50将PALA浓度(分别为60μM和100μM)维持10–14天。每3-4天更换一次含有PALA的培养基。菌落固定在甲醇中,用Geimsa染色并拍照。
PCR用于计算机辅助设计基因扩增
基因组DNA是从多个独立的PALA耐药(100μM)菌落中分离出来的贝克林1+/−表达Bcl-2的iBMK细胞。一个756碱基对(bp)片段,位于两个外显子两侧,对应于小肌肉CAD使用以下引物组:4-fwd(5′-GGAGTGGAGCTC-CGACGG-3′)和4-rev(5′-CTAATGAACAGGAAGATCCGGTATC-3′),通过PCR从小鼠5号染色体(登录号AC_109608)的基因组DNA中扩增基因(登录号NM_023525)。
对指定的周期数进行PCR反应(图6C),以比较线性范围内的相对扩增。
aCGH公司
如前所述进行aCGH(Kallioniemi等人,1994年). 简言之,基因组DNA来自贝克林1+/+和贝克林1+/−分离iBMK细胞和正常小鼠组织,用荧光标记,并与BAC阵列杂交(Snijders等人,2001年)一式三份。对于每个细胞系,数据按基因组顺序绘制为平均对数2三重斑点的比率。平均日志2大于±0.5的比率被视为损失或收益。