介绍
脊椎动物胚胎的正常发育和成年人的生存需要一个功能性的血管系统。许多信号通路，包括VEGF和TGFβ，已被证明参与血管形成，但VEGF通路是已知的唯一一条同时参与血管生成（血管母细胞形成血管）和血管生成（现有血管的萌芽和重塑）的通路（综述见(Roman和Weinstein，2000年).
flk1（飞行高度1）（也称为韩国存托凭证和血管内皮生长因子2)是血管内皮生长因子（VEGF）的内皮特异性受体。在胚胎发生期间，flk1（飞行高度1）首先在血管母细胞中检测到表达，血管母细胞是内皮细胞和血统的共同前体，在血管形成过程中在内皮细胞中保持活性。与flk1（飞行高度1）在血管形成中，小鼠胚胎缺乏flk1（飞行高度1）没有内皮细胞或造血细胞(Shalaby等人，1995年). 斑马鱼的胚胎缺乏VEGF受体的活性，flk1/kdra显示节段动脉部分缺失(Habeck等人，2002年;Covassin等人，2006年). 这种轻微的表型可能是第二种代偿效应的结果flk1（飞行高度1）同源，千德比事实上千德比变形体在血管形成方面没有表现出明显的异常，胚胎两者都缺乏flk1/kdra和千德比显示节段动脉完全丧失(Covasin等人，2006年).
的表达式flk1（飞行高度1）在内皮细胞中受到严格调控。在胚胎发生期间，flk1（飞行高度1）血管系统建立后，表达下调。在成年人中flk1（飞行高度1）表达仅见于血管生成活跃的组织，如妊娠期的乳腺。高程异常flk1（飞行高度1）表达通常与病理条件有关，例如肿瘤发生中的新血管化（有关综述，请参阅(Robinson和Stringer，2001年). 精确的调节电路，调节flk1（飞行高度1）没有被很好地理解。然而，从小鼠模型研究中获得的有限信息揭示了scl、ets和gata因子在flk1（飞行高度1）监管。在小鼠中发现这些转录因子的一致性结合序列flk1（飞行高度1）人类KDR启动子中的增强子(Patterson等人，1995年;Kappel等人，2000年)这些转录因子结合位点的突变使内皮细胞表达flk1（飞行高度1）小鼠模型中的基因(Kappel等人，2000年;Elvert等人，2003年). 之间的监管关系flk1（飞行高度1）和症状自评量表也对斑马鱼进行了研究。的过度表达症状自评量表增加flk1型在野生型胚胎中表达并能诱导flk1（飞行高度1）中的表达式钟表突变体，缺乏内皮细胞和血细胞(Liao等人，1998年;廖等，2000)，证明了这一点症状自评量表是一种重要的转录因子，调节flk1（飞行高度1）基因表达。此外，最近的一项研究表明，内皮特异性Ets-1相关蛋白Etsrp的过度表达会导致异位妊娠flk1（飞行高度1）野生型和clo（克隆）突变胚胎(Pham等人，2006年;Sumanas和Lin，2006年). 这些发现表明flk1（飞行高度1）脊椎动物中的表达可能是保守的。
FoxH1（也称为Fast1）是一种与Smad2/3结合并介导TGFβ信号传导的叉头转录因子（有关综述，请参阅(Attisano等人，2001年). 基因表达分析表明，FoxH1主要在发育早期表达。与这一发现一致，FoxH1的过度表达诱导激活素下游广泛基因的表达，并导致异常轴的形成爪蟾(渡边和惠特曼，1999年). 此外，携带FoxH1突变的小鼠和斑马鱼胚胎会出现原肠胚发育缺陷(Pogoda等人，2000年;Sirotkin等人，2000年;Hoodless等人，2001年;山本等人，2001年). FoxH1在发育后期或成人中的作用尚不明确。然而，FoxH1−/−小鼠胚胎没有流出道或右心室的研究结果表明，FoxH2在前心场的形成中发挥了作用(von Both等人，2004年). 此外，TGFβ信号转导对内皮细胞增殖、分化、迁移甚至存活的影响也有大量文献记载（有关综述，请参阅(Goumans和Mummery，2000年;Goumans等人，2003年)，提示FoxH1在内皮细胞调节中的作用。
为了进一步了解flk1（飞行高度1）斑马鱼的基因在转录水平上受到调控，我们系统地研究了flk1/kdra（以下简称flk1（飞行高度1）). 我们鉴定了斑马鱼翻译起始位点上游约6.4kb的基因组序列flk1（飞行高度1）驱动斑马鱼血管系统中GFP的表达，类似于内源性flk1（飞行高度1）表达模式。缺失分析显示，约800 bp的DNA片段位于flk1（飞行高度1）翻译启动站点足以驱动flk1（飞行高度1）内皮细胞表达。包括scl、ets和gata因子在内的转录因子结合位点的一致序列出现在这个最小800bp的序列中flk1型增强子提示从鱼类到哺乳动物的保守调控机制。此外，我们提供证据表明，FoxH1是flk1（飞行高度1）斑马鱼的基因表达。我们在斑马鱼、小鼠和人类的上游调控区域发现了多个FoxH1结合位点flk1（飞行高度1）基因。通过凝胶位移分析，我们表明FoxH1与flk1（飞行高度1）监管要素。我们进一步证明FoxH1可以抑制flk1（飞行高度1）HEK293T细胞中的最小增强子。与这一发现一致flk1（飞行高度1）在缺乏母体和合子FoxH1的斑马鱼胚胎中中度升高，Fox H1的过度表达会破坏斑马鱼血管系统的形成。此外，我们还表明flk1（飞行高度1）基因表达在smad2变体中上调，这种变化flk1（飞行高度1）FoxH1的过度表达可以抵消表达水平，这表明FoxH2对flk1基因表达的负面影响是依赖于smad2的。这些数据表明，FoxH1作为负调节剂发挥作用flk1（飞行高度1）β和VEGF信号通路之间的相互作用。
材料和方法
斑马鱼养殖和TG（flk1:GFP）la116型转基因系
本研究使用AB菌株。成鱼和胚胎按照先前描述的方式保存(韦斯特菲尔德，2000年).
斑马鱼上游的一个～6.4 kb基因组片段flk1（飞行高度1）基因（从上游的−6410到−1flk1（飞行高度1）翻译起始位点）被克隆到pKS-GM2r载体5'到绿色荧光蛋白（GFP）（林氏链球菌的馈赠）中，构建flk（−6.4）-GFP结构。将约50pg线性化flk（−6.4）-GFP DNA微量注射到斑马鱼胚胎的1细胞期。注射的胚胎被饲养到成年期，并通过种系整合筛选出创始人鱼。GFP表达模式的图像TG（flk1:GFP）la116型胚胎是使用蔡司SV-11表观荧光显微镜或配备10X物镜的奥林巴斯IX70共焦显微镜获得的。
flk（−6.4）-GFP的删除结构
使用ERASE-A-BASE系统（Promega）生成flk（−6.4）-GFP的序列缺失结构。测序分析表明，flk（−5.7）-GFP、flk（–5.0）-GPP、flkflk1（飞行高度1）翻译起始位点分别从−5680、−5016、−4353、−3565和−1503开始。使用以下引物，通过PCR扩增出与−5045~−3543、−4353~−3543和−5045 ~−4326序列相对应的DNA片段：−5044F，5′-CCGCGGTATGAAGTTTCTGTGAC-3′；−4353F，5′-ccgcggtcaccttctgctagttaaacc-3′；−4326R，5′-GCGCCGCGAATGAGGTTTAACTAGAGA-3′；−3543R，5′-GCGCCGCAATCCAAAGTATATTGATCCCCTG-3′。然后，将这些DNA片段克隆到flk（−1.5）-GFP中，以创建flk（–5.0，−3.5/−1.5。
在斑马鱼胚胎的1细胞期，将每种构建物中约50pg微量注射到斑马鱼胚中。在胚胎发育一天后，使用蔡司SV-11表观荧光显微镜对注射胚胎进行GFP瞬时表达筛选。
mRNA和吗啉注射液
编码FoxH1的mRNA（D.Meyer馈赠的礼物）(Pogoda等人，2000年)、FAST-Eng和FAST-VP16（M.Whittman的礼物）(渡边和惠特曼，1999年)使用mMESSAGE mMACHINE（Ambion）合成并注入TG（flk1:GFP）la116型胚胎处于1-4细胞期。
合成了一种特异性靶向smad2翻译起始位点smad2MO的吗啉修饰寡核苷酸（GAGTGAAAGGCAGAGGACAT）（Genetools）。将0.8 ng的smad2吗啉啉注入TG（flk1:GFP）la116型胚胎处于1-4细胞期。
对FoxH1 mRNA或smad2MO注射胚胎在18体节期和24 hpf（受精后小时）之间的血管系统进行分析。使用蔡司SV-11表面荧光显微镜和Axiocam数码相机拍摄胚胎，并通过NIH ImageJ程序量化GFP信号的强度。这个第页该值通过学生的t检验计算得出。
GST融合蛋白
斑马鱼FoxH1 cDNA（来自D.Meyer）被克隆到pGEX-2TK（GE Healthcare）的SmaI位点，以创建pGEX-2-TK-FoxH1-结构。pGEX-2TK-FoxH1和pGEX-2 TK转化为BL21（Stratagene）。使用散装GST纯化模块（GE Healthcare）纯化FoxH1-GST和GST蛋白。蛋白质浓度采用DC蛋白质测定法（Bio-Rad）测定。
凝胶阻滞实验
寡核苷酸对应于flk1（飞行高度1）合成了从−3870到−3844的上游序列。上部股序列如下：flk-FoxH1，5′-CCGAATATTGTGTATT公司CGAGAATATC-3′和flk-FoxH1-mt，5′-CCGAATATTcTGTATT公司CGAGAATATC-3′（FoxH1结合位点下划线，小写字母代表被取代的核苷酸）。在20mM Tris pH8.0、1mM EDTA pH8.0和50mM NaCl中退火寡核苷酸。
3μg纯化FoxH1-GST和GST蛋白与32在含有4%甘油、1mM MgCl的结合缓冲液中，P端标探针在室温下放置20分钟2、0.5mM EDTA、0.5mM DTT、50mM NaCl、10mM Tris-HCl（pH 7.5）和0.05mg/ml poly（dI-dC）。蛋白质-DNA复合物在6%非变性聚丙烯酰胺凝胶（37.5:1丙烯酰胺/双丙烯酰胺）上以0.5X TBE分离。使用未标记的flk-FoxH1或flk-Fox H1-mt作为竞争对手，其摩尔分数为标记探针的50、100或200倍。
荧光素酶测定
将FoxH1 cDNA亚克隆到pSG5（Stratagene）中，以创建pSG5-FoxH1表达载体和flk1（飞行高度1）用flkP-F（5′-ACTGAGCGGCCTTAGCCTGAATAAGTAGATAGC-3′）和flkP-R（5′-CGGATCCTGACTTACTTCTACTTG-3′）对含有预测TATA盒和转录起始位点的从−532到−371的序列进行PCR扩增。然后将扩增的DNA片段克隆到荧光素酶报告载体pGL3-basic（Promega）中，以创建pGL3-flkP构建体。上游序列flk1（飞行高度1）使用−5045F和−3543R引物通过PCR扩增−5045至−3543，并克隆到pGL3-flkP中以创建pGL3-flok（−5.0，−3.5）P。使用QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene）将所有三个FoxH1共识结合序列中的Gs替换为Cs，以创建pGL3-flk（−）P-mt结构。用于定点诱变的引物如下：mt1-F；5′-ATAATAAAAGAGGCGTTATATATACATCTGCCAGG-3′，mt1-R；5′-CCTGGCACAGATGTATAAAACGCCTCTTTATTATT-3′，mt2-F；5′-GCTAGCCGAATATTCTGTATTCGAAATATC-3′，mt2-R；5′-GATATTTCTCGAATACAGATATTCGGCCTAGC-3′，mt3-F；5′-CATAAATACCAATGAAGATCTGAATCTAAAATTAT-3′和mt3-R；5′-在3′处。
HEK293T细胞以每孔50000个细胞的密度被镀在24孔板上，并使用脂质体转染™和Plus™试剂（Invitrogen），含0、100或500 ng pSG5-FoxH1，10ng荧光素酶报告质粒（pGL3-flk（−5.0，−3.5）P或pGL3-flk（−5.0，–3.5）P-mt），2ng pRL-CMV和各种数量的pSG5质粒，以使每次转染的DNA总量保持在512ng。使用Dual-Luciferase®Reporter Assay System（Promega）测量荧光素酶活性，并用Renilla-Lucifferase活性对转染效率进行标准化。
定量RT-PCR
使用RNAwiz（Ambion）从未注射对照和注射100pg FoxH1 mRNA的18体节期胚胎中提取总RNA，并使用SuperScript合成第一链cDNA™RT-PCR第一链合成系统（Invitrogen）。亲属flk1（飞行高度1）用DNA引擎光学定量PCR（MJ Research）测定表达水平。β-肌动蛋白作为标准化的内部对照。所用引物：β-actin正向引物，5′-CTGCTTCCCATCCATCGTGGGTC-3′；β-actin反向引物，5′-CTCATATCCCCAGTTGACA-3′。flk1（飞行高度1）正向引物，5′-GAGAACGAACCAACAGAGATCCACGAG-3′；flk1（飞行高度1）反向引物，5′-CCCTCACAGCAACTGACTCCTTTAC-3′。
结果和讨论
内皮特异性调节元件的鉴定flk1（飞行高度1）基因
作为理解flk1（飞行高度1）在转录水平上，我们在斑马鱼翻译起始位点上游分离到一个～6.4kb的DNA片段flk1（飞行高度1）长程PCR检测基因。我们使用这个6.4kb创建了一个报告结构flk（−6.4）-GFPflk1（飞行高度1）上游DNA片段驱动GFP表达。
我们产生了一个转基因斑马鱼系TG（flk1:GFP）la116型携带种系整合flk（−6.4）-GFP转基因，并发现GFP表达模式TG公司(flk1:GFP）la116型类似于内源性flk1（飞行高度1）表达模式。GFP信号可以在TG（flk1:GFP）la116型胚胎早在6体节阶段。在8体节期，GFP信号被检测到位于TG（flk1:GFP）la116型胚胎()，类似于内生flk1（飞行高度1）表达式模式(). 内生flk1（飞行高度1）表达模式和GFP表达模式TG（flk1:GFP）la116型胚胎随着发育继续发育。受精后24小时（hpf）检测脑背主动脉、主静脉、体间血管和内皮细胞中GFP的表达，48小时（hpf）检测配对背纵吻合血管（DLAV）中GFP表达(). 在三天的发育过程中，可以通过GFP的表达清楚地检测到咽弓中的内皮细胞TG（flk1:GFP）la116型胚胎(). 这种模式与在TG（飞行：EGFP）y1个主动脉弓和形成颌骨的间质都呈GFP阳性的胚胎(劳森和温斯坦，2002年). 此外，GFP的表达模式TG（flk1:GFP）la116型胚胎与其他两个使用相同6.4kb调控元件的独立转基因系一致(克罗斯等人，2003年;Beis等人，2005年;Jin等人，2005年)，表明～6.4kbflk1（飞行高度1）上游调控元件足以驱动内皮细胞中的基因表达，并且这种内皮表达模式不是flk（−6.4）-GFP转基因整合位点的伪影。
GFP在TG（flk1:GFP）la116型胚胎。由flk（6.4）-GFP转基因驱动的（A-D）GFP信号可以在TG（flk1:GFP）la116型胚胎早在8体节期。flk1（飞行高度1）通过原位杂交在三块细胞中检测到表达（A）。类似的模式见TG（flk1:GFP）la116型胚胎（B）。侧视图显示在面板A和B中，背视图显示在面板C和D中。左前方。（E-H）GFP表达模式TG（flk1:GFP）la116型24hpf（F）的胚胎类似于flk1（飞行高度1）原位杂交（E）检测到的模式。头部和躯干的高倍图像分别显示在G和H中。（I-L）GFP表达模式TG（flk1:GFP）la116型48hpf（J）的胚胎类似于flk1（飞行高度1）原位杂交检测模式（I）。头部和躯干的高倍图像分别以K和L显示。（M） 3日龄儿童脑和肱弓内皮细胞GFP表达的共焦图像TG（flk1:GFP）la116型胚胎。（N-P）GFP在成人中的表达仍然活跃TG（flk1:GFP）la116型鱼。图像显示皮肤（N）、鳃（O）和肠道（P）内皮细胞中的GFP信号。
此外，我们发现，虽然GFP的空间表达TG（flk1:GFP）la116型类似于内源性flk1（飞行高度1）原位杂交显示的表达模式，其时间调控是不同的。在斑马鱼中flk1（飞行高度1）内皮细胞在发育3天后显著减少(Fouquet等人，1997年;廖等，1997). 然而，内皮GFP信号在TG（flk1:GFP）la116型贯穿胚胎发生并持续到成年()，表明调控序列负责下调flk1（飞行高度1）在～6.4kb中不存在或不完整flk1（飞行高度1）上游DNA片段。
最小值的标识flk1（飞行高度1）内皮增强剂
确定关键的反调节元素flk1（飞行高度1）～6.4kb范围内内皮细胞的表达flk1（飞行高度1）调控元件，我们制作了flk（−6.4）-GFP的一系列缺失变体。flk（−5.7）-GFP、flk（–5.0）-GFP、flkflk1（飞行高度1）翻译起始站点。我们在斑马鱼胚胎1细胞期将这些缺失构建物注射到斑马鱼胚中，以评估这些构建物驱动斑马鱼胎儿血管系统中GFP表达的能力。我们发现，在注射flk（−6.4）-GFP的196个胚胎中，158个（80.6%）在内皮细胞中有较强的GFP表达(). 在注射flk（−5.7）-GFP、flk（–5.0）/GFP和flk（-4.3）-GFP（分别为52.0%，n=125，52.4%，n=145和51%，n=200）的胚胎中也观察到类似的结果(、C、D）。然而，注射flk（−3.5）-GFP或flk（–1.5）-GFPs构建物的胚胎在内皮细胞中没有GFP表达（分别为181和130）(). 这些数据表明flk1（飞行高度1）内皮细胞的表达位于flk1（飞行高度1）翻译起始位点。
删除分析flk1（飞行高度1）调节区识别了内皮细胞表达所必需的高度保守的元件。（A） flk1-GFP报告基因缺失构建体的示意图。将每个构建体的线性化DNA注射到野生型斑马鱼胚胎的1细胞期。在发育1天后分析注射胚胎中GFP的表达。每个结构体引导的瞬时内皮表达由代表每个结构体的线右侧的加号（内皮表达）或减号（无可检测的内皮表达）汇总。*标记的转录起始位点flk1（飞行高度1）（B-G）注射flk（−6.4）-GFP（B）、flk（–5.0）-GFP-（C）、flk-（−4.3）-GFP（D）、flk-（−5.0，−4.3/−1.5）-GFP（E）、flk.（−5.0,−3.5/−1.5。
由于flk（−4.3）-GFP能够驱动内皮细胞中GFP的表达，而flkflk1（飞行高度1）我们在注射flk（−4.3，−3.5）-GFP构建物的胚胎中未检测到任何GFP表达，这表明仅此片段不足以驱动基因表达体内(). 一个可能的原因是这种结构缺乏功能启动子。TATA盒和预测的转录起始位点flk1（飞行高度1）位于1.5kb碎片的正上游flk1（飞行高度1）翻译起始站点。因此，我们创建了另外三个具有不同长度的构造flk1（飞行高度1）从−5kb到−3.5kb的5'序列融合到flk（−1.5）-GFP、flk（–5.0，−3.5/−1.5。我们将这些构建物注射到野生型斑马鱼胚胎的1细胞期，发现虽然注射flk（−1.5）-GFP或flk（分别为−5.0、−4.3/−1.5、n-GFP（分别为n=130和n=176）的胚胎中未检测到GFP信号，但内皮细胞中GFP的瞬时表达是由flk（–5.0、–3.5/-1.5）驱动的-GFP和flk（−4.3，−3.5/−1.5）-GFP结构（分别为68.8%，n=218和53.9%，n=293）(，E-G）。这些发现表明，−4353至−3543的DNA片段具有驱动力所需的信息flk1（飞行高度1）内皮细胞表达。
我们建立了携带种系整合flk（−5.0，−3.5/−1.5）-GFP或flk（–4.3，−3.5/−1.5-GFP）转基因的稳定转基因株系，以详细分析其GFP表达模式。我们发现，携带flk（−5.0，−3.5/−1.5）-GFP或flk（–4.3，−3.5/−1.5-GFP）转基因的胚胎中的GFP表达标志着内皮细胞，这与瞬时表达分析的结果一致，即从−4353到−3543的序列具有驱动内皮细胞基因表达的所有关键信息。然而，当仔细分析时，我们发现虽然flk（−5.0，−3.5/−1.5）-GFP转基因胚胎的GFP表达模式与TG（flk1:GFP）la116型胚胎，flk（−4.3，−3.5/−1.5）-GFP转基因胚胎除内皮细胞外，在大脑、眼睛和神经管中也有GFP表达(). 这些观察结果以及我们的发现，flk（−5.0，−4.3/−1.5）-GFP并不驱动斑马鱼胚胎中GFP的表达()，表明从−4353到−3543的DNA片段足以驱动flk1（飞行高度1）内皮细胞中的表达，需要从−5045到−4325的序列来限制flk1型内皮细胞的基因表达。
转基因分析flk1（飞行高度1）调控区识别出1.5kb的最小内皮特异性增强子。（A-B）GFP在2日龄婴儿大脑（A）和躯干（B）中的表达模式TG（flk1:GFP）la116型胚胎。携带种系整合flk（−5.0，−3.5/1.5）-GPF转基因的2日龄胚胎的（C-D）GFP表达模式类似于TG（flk1:GFP）la116型（E-F）携带种系整合flk（−4.3，−3.5/1.5）-GFP的胚胎在内皮细胞（箭头）和神经组织中均有GFP表达。箭头指向E组前脑中的GFP阳性细胞和F组神经管中的GFP-阳性细胞。
保守的监管控制flk1（飞行高度1）
为了进一步研究flk1（飞行高度1）基因表达，我们在flk1（飞行高度1）上游序列从−5045到−3543。在限制的关键区域flk1（飞行高度1）对内皮细胞的表达（−5043至−4326），我们注意到Ets和GATA因子共有结合位点，但没有确定其他在内皮基因表达中具有已知功能的转录因子的结合位点，包括FoxH1（见下文）(). 然而，在该区域发现了转录抑制因子的多个共有结合位点，包括5个雕刻位点、3个pbx和2个brn-3结合位点。有趣的是，所有这些基因都在大脑和眼睛中表达(DeCarvalho等人，2004年;埃里克森等人，2006年)，提出了它们是机械限制的一部分的可能性flk1（飞行高度1）向内皮细胞表达。关于−5045至−4326影响分子机制的进一步研究flk1（飞行高度1）基因表达，包括基因雕刻、pbx和brn-3对flk1（飞行高度1），应该提供更多关于flk1（飞行高度1）基因调控。
的交叉谱比较flk1（飞行高度1）5'-侧翼序列。（A） 的顺序flk1（飞行高度1）增强器从−3990到−3571。（B） 斑马鱼、小鼠和人类5’侧翼区域示意图flk1（飞行高度1）基因。FoxH1、scl、ets和GATA因子结合位点的一致序列分别在（A）中以绿色、红色、黄色和蓝色突出显示，并在（B）中以具有相同颜色方案的点表示。翻译起始站点用箭头标记。阴影条表示斑马鱼flk1（飞行高度1）上游序列从−5.0kb到−3.5kb，灰色条表示从−5.0 kb到-4.3 kb的区域。
这个flk1（飞行高度1）上游段从−4353到−3543对于驱动内皮细胞中GFP的表达至关重要。在这个区域，我们发现了scl、Ets和GATA因子的多个结合位点。有趣的是，这些转录结合位点也存在于小鼠体内flk1（飞行高度1）微量增强子与人类flk1/KDR发起人(Patterson等人，1995年;Kappel等人，2000年) ()，这表明flk1（飞行高度1）从鱼类到哺乳动物，基因表达是保守的。
除了scl、ets和GATA结合位点外flk1（飞行高度1）最小调节元件（−4353至−3543）(). 虽然尚未研究FoxH1在内皮细胞中的作用，但TGFβ信号转导对内皮细胞增殖、分化、迁移和通透性的影响已在动物模型和培养细胞中得到很好的证明（有关综述，请参阅(Goumans和Mummery，2000年;Goumans等人，2002年)提出了一种可能性flk1（飞行高度1）是FoxH1介导的TGFβ信号转导的靶基因。因此，我们研究了FoxH1结合位点是否也存在于小鼠和人类的调节区域flk1/KDR基因。如所示，多个FoxH1结合位点存在于人类和小鼠上游5kb区域内flk1（飞行高度1）基因，支持FoxH1是flk1（飞行高度1）从鱼类到哺乳动物都受到保护的调控机制。
FoxH1与flk1（飞行高度1）最小内皮增强剂在体外
探索FoxH1调节的可能性flk1（飞行高度1）直接进行基因表达，我们测试了FoxH1是否可以结合到flk1（飞行高度1）最低限度的监管要素。我们使用一种合成的寡核苷酸flk-FoxH1进行了凝胶移位分析，该寡核苷酸对应于flk1（飞行高度1）上游序列从−3870到−3844，由一个FoxH1结合位点组成，作为探针。如所示，FoxH1与flk-FoxH1.结合在体外这种结合被未标记探针以剂量依赖的方式竞争(). 以前的研究表明，FoxH1结合位点共识序列中的G到C取代消除了其与FoxH1的相互作用(Chen等人，1996年). 我们发现，在FoxH1结合位点的一致序列中具有相同G到C突变的flk-FoxH1-mt合成寡核苷酸没有与标记探针竞争FoxH1-相互作用()，表示FoxH1与flk1型最小内皮增强子是序列特异性的。
FoxH1调节flk1（飞行高度1）转录水平的表达。（A） 纯化FoxH1-GST融合蛋白，并用对应于flk1（飞行高度1）增强剂。未标记探针和未标记flk-FoxH1-mt，在FoxH1结合位点的一致序列中携带G到C取代的寡核苷酸被用作凝胶位移分析的竞争物，摩尔过量为50、100或200倍。给出了一个具有代表性的实验。所有分析均至少进行了三次，结果具有可比性。（B） 用指示的荧光素酶报告子和编码FoxH1的表达载体瞬时转染HEK293T细胞。数值与单独转染pGL3-flkP的细胞的荧光素酶活性有关。显示了四个独立实验的平均结果。
FoxH1抑制flk1（飞行高度1）HEK293T细胞中的基因表达
以前的研究表明FoxH1既可以作为激活剂也可以作为阻遏剂(Labbe等人，1998年;渡边和惠特曼，1999年;Osada等人，2000年;Saijoh等人，2000年;Kofron等人，2004年;Chen等人，2005年). 因此，我们探讨了FoxH1和flk1（飞行高度1）在HEK293T细胞中。pGL3-flk（−5.0，−3.5）P是使用flk1（飞行高度1）上游序列从−5045到−3543和162bpflk1（飞行高度1）基础启动子驱动荧光素酶表达。用pGL3-flk（−5.0，−3.5）P共转染pSG5-FoxH1以剂量依赖性方式抑制荧光素酶的产生(第页<0.05) ()证明FoxH1对flk1（飞行高度1）为了研究FoxH1的抑制活性是否是DNA结合依赖性的，我们创建了pGL3-flk（−5.0，−3.5）P-mt构建体，其中在最小flk1（飞行高度1）调控元件被Cs取代(Chen等人，1996年). 转染pGL3-flk（−5.0，−3.5）P-mt的HEK293T细胞与转染pGL3-flkflk1（飞行高度1）最小增强剂。此外，当FoxH1表达质粒与pGL3-flk（−5.0，−3.5）P-mt共转染时，荧光素酶活性没有观察到显著差异()表明FoxH1对flk1（飞行高度1）表达依赖于DNA结合。
FoxH1负调节斑马鱼血管形成
我们进一步探讨了FoxH1对斑马鱼胚胎血管系统形成的调节作用。我们的数据显示FoxH1抑制flk1型培养细胞中的最小内皮增强剂。如果同样的调控关系在胚胎血管形成过程中是相关的，我们可以预期flk1（飞行高度1）缺乏FoxH1功能的斑马鱼胚胎的表达水平增加。斑马鱼施马尔斯普林(表面)基因座编码FoxH1/Fast1(Pogoda等人，2000年;Sirotkin等人，2000年). 我们分析了flk1（飞行高度1）母体合子的表达水平表面纯合子（MZsur）来源于表面类型68b在保守FKH结构域中携带点突变的等位基因(Pogoda等人，2000年). 如所示，的flk1（飞行高度1）MZsur胚胎中的表达水平确实适度升高，支持FoxH1是flk1（飞行高度1）。我们进一步分析了FoxH1的强制表达对血管形成的影响体内从三个独立实验中收集的数据表明，73个实验中有44个TG（flk1:：GFP）la116型胚胎注射50pg FoxH1 mRNA（60%），282个胚胎中注射265个TG（flk1:：GFP）la116型注射100pg FoxH1 mRNA的胚胎（94%）缺少内皮细胞斑块()，表明FoxH1对斑马鱼的血管形成具有负调节作用，并且FoxH2对斑马鱼血管形成的这种负作用具有剂量依赖性。此外，我们测量了相对flk1（飞行高度1）用定量RT-PCR检测对照组和FoxH1 mRNA注射胚胎的基因表达水平。从两个独立的实验中，我们连续三次观察到flk1（飞行高度1）注射100 pg FoxH1 mRNA的胚胎的转录物是未注射胚胎的48%（标准偏差=4.2%，第页<0.001），支持FoxH1抑制flk1型基因表达。
FoxH1调节斑马鱼的血管形成。（A）flk1（飞行高度1）在32hpf胚胎的发育血管系统中表达（左）。的表达式级别flk1（飞行高度1）在MZsur胚胎中升高（右）。（B） 注射FoxH1 mRNA干扰斑马鱼血管形成。在18体节期分析胚胎。（C） 注射编码FAST-Eng嵌合蛋白的mRNA干扰血管形成（右），类似于FoxH1过度表达的表型。在23体节期分析胚胎。（D） 注射编码FAST-VP16嵌合蛋白的mRNA不会破坏TG（flk1:GFP）la116型胚胎。在18体节期分析胚胎。箭头指向FoxH1或FAST-Eng mRNA注射胚胎中缺失的内皮细胞斑块。（E） 未注射（右）、共同注射的smad2MO和FoxH1 mRNA（中）和注射的smad2MO（左）的侧视图TG（flk1:GFP）la116型24hpf的胚胎。（F） 图表表示感兴趣区域内的相对GFP强度（由面板E中的黄色和红色方框指示）。
为了进一步证实FoxH1确实对血管形成有负面影响，我们将FAST-Eng和FAST-VP16 mRNA注入TG（flk1:：GFP）la116型1细胞期的胚胎。FAST-Eng和FAST-VP16编码的蛋白质，其野生型FoxH1叉头DNA-结合域分别与Engrailed（FAST-Eng）的转录抑制域和VP16的病毒转录激活域融合(渡边和惠特曼，1999年). 注射10pg FAST-VP16 mRNA的胚胎在血管形成前死亡。因此，我们将分析重点放在低水平的FAST-VP16注射上。接受4pg FAST-VP16的130个胚胎中，没有一个出现明显的血管缺陷(). 另一方面，注射FAST-Eng mRNA的胚胎表现出与FoxH1 mRNA注射胚胎相似的表型，且这种效应具有剂量依赖性。而55人中有43人TG（flk1:：GFP）la116型注射10pg编码FAST-Eng的mRNA的胚胎内皮细胞斑块缺失，全部36个TG（flk1:：GFP）la116型注射25pg FAST Eng信使核糖核酸的胚胎有缺失的内皮细胞斑块(). 这些数据表明，FoxH1具有阻遏作用，对斑马鱼血管发育有负面影响。
中的研究爪蟾已证明FoxH1在早期胚胎发生中具有smad2依赖性和smad2诱导依赖性效应(Kofron等人，2004年). 因此，我们评估了FoxH1对flk1（飞行高度1）基因表达依赖于smad2。如果FoxH1确实对flk1（飞行高度1）表达和斑马鱼血管形成是依赖于smad2的，人们可以预期，敲低smad2活性可以抵消FoxH1过度表达的影响。我们发现了TG（flk1:：GFP）la116型注射0.8 ng Smad2MO的胚胎发育正常，内皮细胞中的GFP信号比未注射的兄弟姐妹（86%，n=112）更亮，同时注射50 pg FoxH1 mRNA和0.8 ng Smad2MO可以抑制Smad2MO-诱导的GFP升高（100%，n=102）(). 然后，我们使用NIH ImageJ软件量化了大脑和躯干中选定感兴趣区域的GFP强度。如所示而野生型胚胎和同时注射smad2MO和FoxH1 mRNA的胚胎之间的GFP信号没有显著差异（每组分析25个胚胎，第页>0.05），与野生型胚胎相比，smad2变体的头部血管GFP信号增加了2.84倍，背主动脉和主静脉GFP信号提高了1.78倍（每组n=25，第页<0.001). 这些数据支持FoxH1对斑马鱼血管系统发育的影响是依赖性的这一观点，并表明TGFβ信号在flk1（飞行高度1）基因表达。
FoxH1在早期胚胎发生中的作用已被广泛研究，但其在血管发育中的相关性尚未探索。在这份报告中，我们提供了证据，证明FoxH1直接与flk1（飞行高度1）内皮增强剂和调节flk1（飞行高度1）表达两者体内在培养细胞中。我们还表明，FoxH1对发育中的斑马鱼胚胎的血管形成有负面影响，这为FoxH1在胚胎血管系统模式中的作用提供了第一个证据。值得注意的是，TGFβ对内皮细胞具有刺激和抑制作用(《胡椒》，1997年;Piek等人，1999年). 最近的研究表明，TGFβ信号转导对内皮细胞的细胞效应取决于下游通路的选择(Goumans等人，2002年). 在该模型中，TGFβ信号通过Alk1/smad1,5,8途径诱导细胞增殖、分化和存活，而涉及FoxH1的Alk5/smad2,3途径抑制内皮细胞增殖和分化，并诱导细胞死亡（有关综述，请参阅(Goumans等人，2003年). 我们发现FoxH1负调节flk1型基因以中度和smad2依赖的方式表达，这与Alk5介导的TGFβ信号传导对内皮细胞的负面影响一致，并增加了VEGF/flk1通路是TGFβ信令的直接靶点的可能性。详细研究TGFβ/FoxH1对VEGF途径的调控将加深我们对内皮细胞中这些途径相互作用的理解。
