哺乳动物耳蜗的规格取决于声波刺猬

Shh是沿着背腹轴形成耳囊泡所必需的

由于晚期Shh突变胚胎中完全没有卷曲的耳蜗，我们决定在耳泡发育阶段解决这些缺陷的分子性质。耳泡的腹侧细胞注定会产生耳蜗管，并以同源异形盒基因的重叠表达为标志其他x1和其他2(Morsli等人，1999年).其他x1表达也沿着耳囊的外侧壁向后延伸，在那里有助于形成外侧半规管和壶腹(Morsli等人，1999年). 为了解决耳泡腹侧细胞是否需要Shh信号，我们检测了Otx公司基因嘘^−/−胚胎。有趣的是其他2在嘘^−/−胚胎在10.5 dpc下开始发育时或其后的任何时间（图。​（图2a、e；2a、 e；数据未显示）。此外其他x1表达减少到一个小的腹侧斑（图。​（图2b、c、f、g）。2b、 c、f、g）。

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图2

嘘调节标记物沿耳囊背腹轴的表达。野生型耳泡的横切面和整体视图(一–d、 我–l、 q、s、u、w)和嘘^−/−(e（电子）–h、 米–p、 r、t、v、x)通过RNA原位杂交分析胚胎的基因表达。(a、 e（电子）)其他2腹侧耳蜗上皮缺失嘘^−/−胚胎；(b、 c、f、g)其他x1表达式减少为嘘^−/−胚胎。红色箭头在克指向的简化域其他x1表达式。(d、 小时)深x 5在没有Shh的情况下腹部扩张。括号表示腹面极限之间的距离深x 5耳泡的表达和腹侧范围。(i、 米)Fgf3型. (j、 k、n、o)Lfng公司，腹侧移位Lfng公司中的表达式嘘^−/−胚胎(o个)由红色箭头标记。(l、 第页)英国标准普尔4; 红色箭头指向英国标准普尔4腹侧移位的表达域嘘^−/−胚胎。(q、 第页)胶质细胞1和(s、 t吨)私人投资公司在野生型的耳上皮和耳周间质中检测到嘘^−/−胚胎。箭头输入q个和秒指向模糊的表达胶质细胞1和私人投资公司在耳周间质和耳泡内侧壁。The semblance of expression of胶质细胞1在里面第页是捕获而非特异性染色的结果。(u、 v（v）)Tbx1型; 在野生型和嘘^−/−胚胎。然而，耳周间质的表达Tbx1型中缺少（括号）嘘^−/−突变体。(w、 x个)溴化氢; 冷凝间质（支架）中的表达缺失嘘^−/−胚胎在10.5dpc。星号输入x个标志着鳃弓的表达Brn4、，在中不受影响嘘^−/−胚胎。所有切片均来自10.5 dpc的胚胎，除了d日和小时来自9.5dpc的胚胎。M、 内侧；五十、 横向；D、 背侧；五、 腹部。

The altered expression of其他x1和其他2在里面嘘^−/−胚胎可能表明Shh信号调节Otx公司基因，或Shh是腹侧耳囊泡细胞表达所必需的Otx公司基因或两者。为了区分这些可能性，我们评估了定位于耳囊背腹轴的额外标记的表达。如果耳泡的腹壁细胞在嘘^−/−胚胎，那么一个可能的结果可能是背部标记物的腹侧扩张，这让人想起在嘘^−/−胚胎(Chiang等人，1996年). 同源异形盒基因深x 5它标志着耳囊的背半部，在嘘^−/−胚胎，表明嘘信号通常会对抗深x 5表达式（图。​（图2d，h）。2d、 h）。这并不是所有背耳标志物的一般特征重量2b和长x1b在缺乏Shh的胚胎中没有腹部扩张（图。​（图3k、l；三k、 l；数据未显示）。

腹侧扩张深x 5在耳泡中的表达嘘^−/−胚胎不包括腹肌细胞。为了确定这些细胞的身份，我们调查了在耳囊中间区域表达的其他标记物的表达。在耳泡的前腹外侧室，成纤维细胞生长因子-3(Fgf3型)以及高水平的疯子边缘(Lfng公司)共表达于一个感觉感受区，cvg的一部分可能会在这里形成胞囊斑（图。​（图2i、j、k）。2i、 j、k）。低水平Lfng公司也可以在耳上皮的腹侧部发现（图。​（图2j）。2j） ●●●●。细胞直接背向高处Lfng公司和Fgf3型耳侧小泡中的结构域表达骨形态发生蛋白-4(英国标准普尔4; 图。​图2l）。2l） ●●●●。在嘘^−/−胚胎Fgf3、Lfng、和英国标准普尔4每个人都会腹部移位Fgf3型以及高水平的Lfng公司占据耳囊腹侧部（图。​（图2m–p）。2m–p）。低水平Lfng公司通常占据耳泡腹侧区域的嘘^−/−胚胎（图。​（图2n）。2n） ●●●●。尽管没有嘘声，英国标准普尔4-表达细胞与Fgf3型和Lfng公司，立即躺在背部。从这些结果中，我们得出结论，Shh信号是耳蜗导管出现处耳蜗囊泡腹侧细胞的规范所必需的。在没有Shh的情况下，一些背侧内耳标记物扩张，一些侧耳细胞命运标记物的定位发生改变。

Shh信号直接作用于耳上皮和耳周间质

刺猬（Hedgehog，Hh）信号的影响可以在短距离或长距离内检测到。长程Hh信号可以通过一种未解决的机制直接作用，该机制通过Hh在多个细胞直径上的脂质连接进行转运，也可以通过二级信号转导间接作用(英格姆和麦克马洪2001). 这就提出了一个问题，即Shh是否直接或间接地作用于耳上皮。在这方面，我们评估了Shh信号的两个转录靶点的表达，即含有锌指的转录因子胶质细胞1和Shh受体已修补(私人投资公司)，两者都用作通路激活的分子读数(Goodrich等人，1996年). 9.5至10.5 dpc之间，胶质细胞1和私人投资公司转录物在耳上皮和腹侧耳周间充质中广泛表达（图。​（图2q，s；2q、 s；数据未显示）。缺少胶质细胞1和私人投资公司这些组织的表达嘘^−/−胚胎（图。​（图2r，t）2r、 t）排除了刺猬家族其他成员在这些阶段可能向耳泡发出信号的可能性，支持Shh在内耳发育中的直接作用。

观察到Shh信号在耳周间质中是活跃的，我们接下来确定该组织是否在嘘^−/−胚胎。转录因子Tbx1型和溴化氢分别是耳周间质和冷凝间质的标记物（图。​（图2u，w）。2u、 w）。间充质的凝结开始于紧邻腹侧耳上皮的耳周细胞亚群内，随后，间充质将包围内耳，形成骨迷路。在Shh缺席的情况下Tbx1型也不是溴化氢在10.5 dpc的间充质中检测到（图。​（图2v，x）。2v、 x）。相反，Tbx1型在没有Shh的情况下，耳泡侧壁的表达保持不变，这表明两个内耳区域Tbx1型表达是独立调节的（图。​（图2u，v）。2u、 v）。15.5 dpc，溴化氢在中检测到转录本嘘^−/−胚胎，表明存在一条替代途径溴化氢激活（未显示数据）。我们的发现表明Shh信号直接影响耳上皮和耳周间质Tbx1型和溴化氢作为内耳发育中Shh信号通路的两个潜在靶点。

Pax2表达的维持依赖于Shh

配对盒基因帕克斯2是耳命运的早期标记，最初在整个耳板表达，后来在耳泡内侧的细胞内表达(Nornes等人，1990年;Puschel等人，1992年;Groves and Bronner-Fraser 2000年). 据报道帕克斯2^−/−我们推断胚胎缺少耳蜗导管帕克斯2缺乏Shh的小鼠内耳的表达可能会改变(Favor等人，1996年;Torres等人，1996年).帕克斯2在耳杯状阶段表达嘘^−/−胚胎从耳囊内壁脱落9.5dpc（图。​（图3a、b、f、g）。三a、 b、f、g）。未能维护帕克斯2在缺乏Shh的情况下的表达不太可能是耳小泡中缺乏腹侧细胞的唯一原因嘘^−/−胚胎，因为其他2也是耳蜗发育所必需的嘘^−/−突变体（图。​（图2a、e；2a、 e；Morsli等人，1999年). 因此，我们得出结论，耳蜗导管的缺失导致嘘^−/−胚胎很可能是由一系列缺陷造成的，即未能维持帕克斯2表达与腹侧耳蜗细胞缺乏特异性相关。

除了促进耳蜗管的生长外，Pax2还被认为参与了耳囊泡内内侧-外侧轴背侧交界处的隔室边界的建立(Brigande等人，2000年). 同源盒和T盒转录因子嗯x3和Tbx1型分别沿着耳泡侧壁在细胞内标记提议边界的互补侧（图。​（图3c、d）。三c、 d）。建立这样一个边界的建议目的是在内淋巴管出现的位置，即内外轴和前后轴之间的背部交叉点(Brigande等人，2000年). 如果需要Pax2来维持耳囊内的内侧-外侧边界，那么在没有Pax2的情况下嗯x3和Tbx1型应改变其表达，抑制内淋巴管的生长。有趣的是，在嘘^−/−胚胎嗯x3和Tbx1型保持固定（图。​（图3c、d、h、i）。三c、 d、h、i）。此外，内淋巴管生长的初始阶段通常发生在嘘^−/−胚胎的背侧表达重量2b（图。​（图3k，l）。三k、 l）。未能维持内淋巴管生长嘘^−/−胚胎可能更多地与Gbx2在10.5dpc时，与可能改变隔室边界的情况相比（图。​（图3m，n）。三m、 n）。耳囊内中外侧边界的持续存在嘘^−/−胚胎的部分原因可能是帕克8在缺乏Shh的胚胎中，其沿着耳囊背内侧壁保持表达（图。​（图3e、j）。三e、 j）。鉴于Pax8不能修复耳蜗任一区域的耳蜗导管缺陷，因此它不能补偿耳蜗囊肿所有区域的Pax2嘘^−/−或帕克斯2^−/−胚胎。这些发现表明，Pax2功能对于耳囊内侧-外侧边界的形成是不必要的。

在Shh未能形成cvg^−/− 胚胎

cvg来源于耳泡的前腹侧区域。一旦确定，这些神经元前体从耳上皮分层，向腹侧迁移，并聚集在耳囊底部形成cvg。cvg后来分离到耳蜗和前庭神经中，这两种神经的功能是支配各自结构的数千个感觉毛细胞。Shh在确定腹侧耳细胞命运方面的需求使cvg的神经元前体成为Shh信号的潜在靶点。

神经元前体在从耳上皮分层之前表达bHLH转录因子Ngn1型和神经元D(Ma等人，1998年).Ngn1型是最早在cvg祖细胞中表达的神经元决定因子，E9.0。然后神经元DE9.5处。的级别和域Ngn1型和神经元D耳泡中的转录物明显减少嘘^−/−胚胎与年龄匹配的野生型同卵双胞胎相比（图。​（图4a–d），4a–d），推断Shh通过调节Ngn1型转录。

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图4

嘘cvg前体的规格和分层要求。野生型耳泡前部横切面(a、 c、e、g)和嘘^−/−(b、 d、f、h)胚胎。神经元D(a、 b条)和Ngn1型(c、 d日)cvg前体中的表达下调嘘^−/−9.5dpc的胚胎。神经元D(e、 （f）)和Fgf10型(g、 小时)cvg和膝状神经节内的表达减少嘘^−/−胚胎在10.5dpc。红线输入e（电子）和（f）强调神经元D在突变体与野生型耳上皮中。用探测相邻部分Lfng公司(i、 我),英国标准普尔4(j、 米)、和Myo十五(k、 n个)野生型和嘘^−/−内耳15.5 dpc。箭头指向正方向Lfng公司和Myo十五为负的域英国标准普尔4各代表性图表中显示了各部分的级别。ca，壶腹嵴；gg，膝状神经节；lc，侧嵴；mu，椭圆斑；pc，后嵴。棒材，100μm。

为了进一步研究Shh对内耳神经命运规范的依赖性，我们在稍晚的阶段观察了神经节本身。到10.5 dpc时，许多野生型成神经细胞表达神经元D从耳上皮分层，向腹侧迁移，并聚集形成致密神经节（图。​（图4e）。4e） ●●●●。这与嘘^−/−胚胎，其中较小比例的神经元D-表达前体分散在耳泡下方，大多数仍局限于耳上皮（图。​（图4f）。4f） ●●●●。评估第二个cvg标记，Fgf10型，与此结果一致（图。​（图4g，h）。4g、 h）。此外，在14.5 dpc时，几乎没有神经元参与耳蜗神经节，也没有神经元参与前庭神经节（数据未显示）。耳蜗上皮细胞分层的减少嘘^−/−胚胎与神经元D^−/−胚胎，表明神经D活性可能受Shh的调节(Liu等人，2000年;Kim等人，2001年).

由于神经原区域被认为与内耳的感觉感受区部分重叠，我们研究了内耳感觉斑的发育嘘^−/−利用已建立的感觉器官标记，胚胎在15.5dpc时发育。在野生型耳朵中，所有感觉斑片都表达Lfng公司由13dpc和只有三嵴表达英国标准普尔4（图。​（图4i、j；4i、 j；Morsli等人，1998年). 在嘘^−/−内耳，宽大的Lfng公司-在膜腔内侧观察到阳性区域（图。​（图4l）。4l） ●●●●。这个Lfng公司人们认为这种表达会导致胞囊和球囊的黄斑以及皮质器官，但这些感觉结构在嘘突变体。然而，检测到Bmp4阳性的嵴状结构（图。​（图4m）4m） 正如早期毛细胞标记物肌球蛋白十五（图。​（图4k，n）。4k、 n）。因此，Shh需要指定内耳中的大多数神经源性但非感觉性谱系。

Pax2是负责耳蜗导管生长的Shh信号的介导者

耳蜗导管的失效嘘^−/−胚胎很可能是由缺乏Pax2，Ot1、和其他2，基因先前被认为在这个过程中具有必要的作用(Favor等人，1996年;Torres等人，1996年;Morsli等人，1999年). 此外，我们观察到Shh对于表达帕克斯2沿着耳泡内侧壁，Pax2可能是耳囊中Shh信号的下游效应器（图。​（图7）。7). 关于帕克斯2通过Shh在内耳发育中类似于帕克斯2Shh形成另一个由板状物衍生的感觉器官，眼睛。在产生视杯近轴时，来自腹侧前脑的Shh信号促进帕克斯2-表达近端命运（视裂、视柄）第6页-表达远端命运（前瞻性视网膜、色素上皮和晶状体；Ekker等人，1995年;麦克唐纳等人，1995年;Chiang等人，1996年;张和杨2001). 为了维持近端和远端血统之间的边界，Pax2和Pax6通过相互转录抑制相互对抗(Schwarz等人，2000年). 回应的共性圣像牌Hh信号传导的基因可以扩大到包括Pax1型在腹侧体节和第6页在腹侧神经管中(Fan和Tessier-Lavigne 1994;约翰逊等人，1994年;Ericson等人，1997年;Zhang等人，2001年). 在这两种情况下，具有相反功能的帕克斯家族成员在Pax1和Pax6活性位点附近表达(Fan和Tessier-Lavigne 1994;约翰逊等人，1994年;Ericson等人，1996年). 这不是一般规则，因为圣像牌基因表达与帕克斯2在内耳中，尽管其他转录因子可能在该组织中发挥拮抗作用(Brigande等人，2000年). 因此，我们的观察增加了Pax转录因子在介导细胞对Shh信号传导的反应中的功能列表(Mansouri等人，1996年).

Shh信号通路在耳发育中的Pax2依赖性功能

下调帕克斯2在缺乏Shh功能的胚胎中，这种表达可能导致耳蜗管生长失败。然而，侧半规管、内淋巴管和cvg的缺失嘘^−/−胚胎，存在于帕克斯2^−/−胚胎，揭示出Shh的作用比单纯的调节更为复杂帕克斯2表达式(Favor等人，1996年;Torres等人，1996年). 缺乏外侧半规管嘘^−/−胚胎的部分原因可能是：其他x1，形成这种结构所需的基因(Acampora等人，1996年;Morsli等人，1999年). 然而，由于侧管的原基，即水平前哨，仍然存在于嘘^−/−胚胎，在没有Shh的情况下，Otx1功能不太可能完全受损。或者，侧耳道形成的中断可能源于腹侧耳细胞的不规则生长嘘^−/−胚胎。腹面在12.5 dpc后出现过度生长嘘^−/−突变体可能会干扰中间结构的发育，例如侧管。类似的推理不太可能解释维持内淋巴管生长的失败嘘^−/−然而，胚胎，因为在腹侧囊肿出现之前，这种背向衍生结构在10.5dpc时停止。有趣的是，内淋巴管发育受阻是伴随着内淋巴管的下调而来的Gbx2在组织中表达。是否维护Gbx2这种表达是对Shh信号的直接反应，而内淋巴管生长是否需要Gbx2是有待解决的两个问题。

下调表达Tbx1型和溴化氢在耳周间质中嘘^−/−10.5dpc的胚胎表明该组织也对Shh信号有反应。此外，由于Tbx1型和溴化氢在中受到上调第1页胚胎中，这两个基因很可能是Shh途径的转录靶点。有趣的是，Tbx1型也被证明依赖于咽弓中的Shh(Garg等人，2001年). 虽然来自耳周间质的信号在耳廓上皮形成模式中的作用尚不清楚，但Brn4参与了内耳周围成熟骨迷路的形成(Phippard等人，1999年). 的表达式溴化氢在里面嘘^−/−晚期胚胎和软骨囊的存在表明，在缺乏Shh的情况下，代偿途径起到促进软骨生成的作用（数据未显示）。

cvg的成神经细胞前体依赖于Shh信号传导

颅骨感觉神经节的神经元前体被指定的机制依赖于由碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子介导的遗传级联。就cvg而言，Ngn1处于指导一群幼稚耳上皮细胞接受神经元前体命运所需的遗传层次的顶端(Ma等人，1998年). NeuroD的激活时间比Ngn1晚半天，它是神经母细胞从耳上皮分层以及在分化过程中存活所必需的(Ma等人，1998年;Liu等人，2000年;Kim等人，2001年). 尽管在许多情况下，神经决定途径中的原神经基因的激活受Notch-Delta信号调节，但越来越多的证据表明，cvg前体的最初选择是由其他机制控制的(Ma等人，1998年).

我们的研究表明Ngn1型cvg中的前体部分由Shh信号通路建立。Ngn1型在cvg前体中被下调嘘^−/−胚胎和在扩大的成神经细胞池中上调第1页体外表达的转基因小鼠嘘（图。​（图7）。7). 其他独立于Shh作用的分泌因子可能负责某些cvg前体的规范，因为Ngn1型-表达成神经细胞持续存在嘘^−/−胚胎。中规定的cvg前体嘘^−/−胚胎，目前尚不清楚为什么大多数未能从耳上皮中形成可能较小的神经节。答案可能再次指向Ngn1的函数。的结果Ngn1型下调嘘^−/−突变体是指神经元D表达式。考虑到NeuroD在促进成神经细胞从耳上皮分层方面的需求神经元D中的表达式嘘^−/−突变体阻止了来自耳上皮的cvg前体的出现。相对于Shh的细胞存活作用，我们支持这种解释，因为在检测的神经母细胞分层阶段（9.5到10.5 dpc），与野生型和野生型相比，死亡细胞的数量没有明显增加嘘^−/−胚胎（数据未显示）。在以下分析中得出了类似的结论神经元D^−/−胚胎(Liu等人，2000年).

Shh和类视黄醇在耳泡模式中的重叠作用

维甲酸（RA）信号在耳膜囊泡的形成中起着积极作用(Dupe等人，1999年;Niederrer等人，2000年;Pasqualetti等人，2001年). 有趣的是嘘^−/−胚胎与缺乏拉尔德2，一种催化RA形成的基因(Niederreither等人，2000年). 在两个突变体的耳囊中，帕克斯2表达式未维护，并且嗯x3表达在腹侧扩大（本研究；Niederreither等人，2000年). 不幸的是，由于早期的致命性，无法进行进一步的比较拉尔德2^−/−胚胎。RA也可以拯救霍克萨1^−/−内耳表型，模仿嘘^−/−胚胎包括耳蜗导管发育不足(Pasqualetti等人，2001年). 有许多例子支持Shh和RA在胚胎发育的相同或平行途径中的作用(Riddle等人，1993年;Ogura等人，1996年;Pierani等人，1999年;Schneider等人，2001年). 因此，存在Shh和RA信号传导可能在耳囊泡的模式中汇合的可能性。

自从在拉尔德2和霍克萨1突变体被归因于后脑模式缺陷，而不是对耳泡本身的主要影响，这就提出了一个问题：嘘^−/−耳道表型可以通过后脑模式基因表达的改变来解释(Niederreither等人，2000年;Pasqualetti等人，2001年). 后脑表达克雷斯勒和Fgf3型在菱形突变体中，5和6在许多具有内耳表型的小鼠突变体中发生改变，包括拉尔德2^−/−,霍克萨1^−/−,克雷斯勒^−/−、和Fgf3型^−/−胚胎(Mansour等人，1993年;McKay等人，1996年;Niederreither等人，2000年;Pasqualetti等人，2001年). 然而克雷斯勒和Fgf3型后脑的表达不受影响嘘^−/−胚胎，表明嘘^−/−耳表型并非由这些后脑基因的错误调控引起（数据未显示）。很有意思的是要确定嘘^−/−,拉尔德2^−/−、和霍克萨1^−/−胚胎起源于Shh和RA通路在其他连接点之间的串扰，或来自相互独立的机制。

涂料填充研究

用于颜料填充分析的小鼠胚胎在PBS中收获，并在室温下放置在Bodian固定剂中过夜。随后用乙醇将标本脱水，并用水杨酸甲酯清除。使用微操作器将0.1%水杨酸甲酯乳胶漆溶液注入膜迷路的内腔(Martin和Swanson 1993年;Morsli等人，1998年).

原位杂交和全β-半乳糖苷酶染色

整体安装RNA原位杂交基本上如所述进行(Matise等人，1998年)使用地高辛UTP标记的核糖探针。每个探针分析每个基因型的三到五个胚胎。在全山染色后，将代表性胚胎在4%多聚甲醛中固定，在PBS中冲洗，嵌入4%琼脂糖中，并在50–75μm的振动切片上切片。β-半乳糖苷酶活性的评估私人投资公司^lacZ公司/+胚胎以X-gal（GIBCO-BRL）为底物进行组织化学染色(爱泼斯坦等人，2000年).

我们感谢以下人员的调查：D.Anderson、B.Crenshaw、C-M.Fan、M.Frohman、P.Gruss、B.Hogan、R.Johnson、A.Joyner、T.Lufkin、A.McMahon、B.Morrow、J.Rubenstein、P-X.Xu和T.Yamaguchi。D.J.E.感谢Alex Joyner在生成第1页鼠标线。肯尼斯·坎贝尔（Kenneth Campbell）和马贾·布坎（Maja Bucan）对手稿发表了有益的评论。D.J.E.实验室对该项目的资助得到了NINDS的NIH拨款R01 NS39421、March of Dimes的Basil O'Conner初级学者研究奖和Pew生物医学科学学者奖的支持。

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