DNA依赖性蛋白激酶催化亚单位的自磷酸化是DNA双链断裂重新连接所必需的

摘要

基因组中DNA双链断裂（DSB）的修复对于电离辐射（IR；van Gent等人，2001年). 同源重组（HR）和非同源末端连接（NHEJ）是真核生物中调节DNA双链断裂修复的两条主要途径。HR需要存在同源染色体或姐妹染色单体，并由酿酒酵母RAD52在其他真核细胞中上位性群或其同源物(哈伯2000)，但NHEJ不依赖同源DNA序列的存在，并且需要DNA-依赖性蛋白激酶复合物（DNA-PK）和XRCC4/DNA连接酶IV复合物(克里奇洛和杰克逊1998).

DNA-PK由Ku异二聚体（由Ku70和Ku80亚基组成）和催化亚基（DNA-PKcs；史密斯和杰克逊1999). DNA PKcs是磷脂酰肌醇-3（PI-3）样激酶家族的成员，该家族包括ATM（共济失调毛细血管扩张突变）和ATR（ATM-Rad3-相关；Durocher和Jackson 2001). Ku以非常高的亲和力与DNA末端结合，被认为是刺激DNA-PKcs激酶活性的DNA-结合和调节亚单位(戈特利布和杰克逊1993;Dynan和Yoo 1998). 虽然DNA-PK的生化特性已在体外进行了广泛的研究，但在NHEJ的环境下，其在体内如何发挥作用尚不清楚。DNA-PKcs缺陷的仓鼠细胞系（V3）与野生型人类的互补催化亚单位cDNA拯救了它的辐射敏感性，恢复了它的DSB再结合能力。然而，一种激酶死亡形式的DNA-PKcs未能修复这两种缺陷，因此表明DNA-PK的激酶活性是NHEJ途径修复DSB所必需的(Kurimasa等人，1999年).

DNA-PK因DNA损伤而激活的机制及其生理靶点尚不清楚。DNA-PK的可能靶点包括Wrn解旋酶(Yannone等人，2001年)和DNA-PKcs本身(Chan和Lees-Miller，1996年)，但这些假定靶点磷酸化的意义尚不清楚。在这里，我们报告了DNA-PKcs受Thr2609对IR的自磷酸化调节的证据。通过与γ-H2AX和53BP1的共定位，我们表明磷酸化的DNA-PKc定位于DNA DSB的位点。此外，细胞研究表明，2609位的丙氨酸替换显著降低了DSB重新连接和细胞存活率。因此，Thr2609处DNA-PKcs的自磷酸化是NHEJ途径修复DSB的重要事件。

结果和讨论

我们之前表明，DNA-PK能够在体外自动磷酸化Ku70、Ku80和DNA-PKcs。DNA PKcs的自身磷酸化导致Ku的解离和激酶活性的丧失，因此被认为是一种重要的调节机制(Chan和Lees-Miller，1996年). 为了研究DNA-PKcs自磷酸化的生物学意义，我们首先通过质谱鉴定了体外自磷酸化位点(Zhang等人，1998). 高纯度DNA-PKcs和Ku在剪切的小牛胸腺DNA和低浓度ATP（50μM）存在下培养，以允许最优选位点的自磷酸化。磷酸化的DNA-PKcs通过质谱分析，Thr2609被明确鉴定为自磷酸化位点（图。​（图1a）。1a） ●●●●。Thr2609位于DNA-PKcs的一个区域，在PI-3激酶家族的各个成员中不保守。然而，Thr2609在所有已知的DNA-PKcs同源物中都是保守的（图。​（图1b），1b） 这表明DNA-PKcs在该残基的磷酸化可能在进化上是保守的。我们设计了一个13-残基肽，该肽与该保守序列相对应，但在2609位含有一个磷酸三氢嘌呤，用它来制备兔多克隆抗体，然后亲和纯化识别磷酸化Thr2609（pT2609Ab）的抗体。为了证实pT2609Ab的特异性，我们表达并纯化了GST DNA-PKcs片段，这些片段跨越2500–2700个残基，包含野生型序列或在2609位带有Ala点突变。用纯化的DNA-PK对GST片段进行体外磷酸化，并用pT2609Ab进行Western blotting分析（图。​（图2a，2a、 顶部）或针对GST（图。​（图2a，2a、 底部）。pT2609Ab与磷酸化的野生型GST片段发生交叉反应，但与含有T2609A突变的片段无交叉反应（图。​（图2a，2a、 顶部）。此外，用pT2609Ab对100倍摩尔过量（相对于容易检测到的磷酸化DNA-PKcs的数量）的未磷酸化DNA-PKcs进行免疫印迹，并没有产生任何可检测的信号（图。​（图2b，2b、 参见车道2和9）。

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图1

Thr2609的DNA-PKcs磷酸化。(一)质谱（MS）鉴定DNA-PKcs体外自磷酸化位点。鉴定的胰蛋白酶磷酸肽的质谱；下划线的T对应于Thr2609，是磷酸化位点。(b条)人类DNA-PKcs Thr2609与国家生物技术信息中心数据库中提供的DNA-PKcs序列的比对。

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图2

Thr2609磷酸化的表征。(一)pT2609Ab的特异性。含有野生型DNA-PKcs序列或T2609A点突变的跨越2500–2700氨基酸的GST片段在体外用纯化的DNA-PK磷酸化，并用pT2609Ab进行分析(顶部)和反GST(底部)以显示相等的负载。(b条)pT2609Ab不识别未磷酸化的DNA-PKcs。pT2609Ab蛋白印迹(顶部)和25-4 DNA PKcs单克隆抗体(底部)带有模拟或自磷酸化DNA-PKcs（车道1和2分别）和纯化的、未磷酸化的DNA-PKcs（车道三–9)在相对于泳道中蛋白质量的指示摩尔比下1,2. (c（c）)体内Thr2609磷酸化动力学。对HeLa细胞进行模拟处理或用10Gy照射，并允许其恢复指定的时间。用pT2609Ab对核提取物进行Western blot(顶部)，然后剥离印迹并用25-4 DNA-PKcs单克隆抗体重制(底部). (d日)Thr2609磷酸化的剂量依赖性。用指示剂量的电离辐射照射HeLa细胞，使其恢复30分钟。核提取物首先用pT2609Ab进行Western blot分析(顶部)然后用25-4单克隆抗体显示等负荷(底部).

用IR处理指数生长的HeLa细胞，并用pT2609Ab进行分析，以研究体内Thr2609磷酸化（图。​（图2c、d）。2c、 d）。Thr2609的磷酸化可由IR诱导，用10 Gy处理后10分钟即可检测到（图。​（图2c）。2c） 。在此剂量下，Thr2609的磷酸化在30分钟后达到最大值，并持续4小时，在IR后6小时检测不到（图。​（图2c）。2c） 。先前已经表明，DNA-PK在DSBs双相修复的初始快速阶段发挥作用，因此在损伤后的第一个小时内，约80%的DSBs以DNA PK依赖的方式重新连接(DiBiase等人，2000年). 我们观察到的Thr2609磷酸化动力学（图。​（图2c）2c） 与DiBiase等人（2000年）并提示该位点的磷酸化对DNA损伤的反应可能与DSB的重新连接有关。Thr2609的磷酸化也依赖于剂量，可以用2 Gy诱导；在10 Gy时，pT2609Ab的检测达到饱和（图。​（图2d）。2d） ●●●●。因为在低至2 Gy的剂量下可以观察到Thr2609的磷酸化，这些结果表明DNA-PKcs的磷酸化对基因组中DSB的存在非常敏感。我们还观察到Thr2609在淋巴母细胞系（Jurkat）、胶质瘤细胞系（M059K）和原代人成纤维细胞（数据未显示）中对IR的反应中磷酸化，因此，这似乎是一种非细胞类型特异性的普遍现象。

包括DNA-PK在内的PI-3激酶家族成员的活性可被沃特曼抑制(Sarkaria等人，1998年). 用20μM沃特曼素处理HeLa细胞并没有改变DNA-PKcs蛋白水平（图。​（图3a，三a、 底部）；然而，在10 Gy IR后，沃特曼处理导致Thr2609的磷酸化显著降低（图。​（图3a，三a、 top），表明Thr2609对DNA损伤的反应是由PI-3激酶介导的。以前的研究表明，20μM沃特曼宁抑制DNA-PK介导的DNA双链断裂修复，并增加辐射敏感性(Chernikova等人，1999年;DiBiase等人，2000年). 然而，在这个浓度下，它也可以抑制ATM，这是另一种也被电离辐射激活的PI-3激酶(Banin等人，1998年;Canman等人，1998年). 为了区分这些可能性，用载体补充人类a-T细胞系（图。​（图3b，三b、 车道1、2）或全长野生型ATM cDNA（图。​（图3b，三b、 通道3,4）用10 Gy IR处理，并使用pT2609Ab进行分析（图。​（图3b，三b、 顶部）和抗DNA-PKcs单克隆抗体（图。​（图3b，三b、 底部）。在两种细胞系中都观察到IR诱导的Thr2609处DNA-PKcs磷酸化（图。​（图3b），三b） 尽管在载体补充的细胞中磷酸化程度有所降低。这一结果证实了响应损伤的DNA PKcs在Thr2609处的磷酸化不需要ATM，因此DNA PKcs的Thr2609不太可能是ATM激酶的直接靶标。然而，不能排除ATM依赖信号的间接作用。

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图3

体内Thr2609磷酸化的表征。(一)沃特曼素对Thr2609磷酸化的抑制作用。HeLa细胞与二甲基亚砜预孵育(d日我米乙基秒超低频o（o）氧化物；车道1,2)或20μM沃特曼（车道三)在使用10 Gy电离辐射（IR；通道）治疗前30分钟2,3). IR后30分钟制备核提取物，随后分析Thr2609磷酸化(顶部)和25-4单克隆抗体(底部). (b条)Thr2609的磷酸化与ATM无关。辅助向量（车道）的A-T细胞（FT169）1,2)或全长野生型ATM cDNA（车道3, 4)用10 Gy的IR处理。对核提取物进行Thr2609磷酸化分析(顶部)和DNA-PKcs水平(底部). (c（c）)Thr2609的磷酸化依赖于Ku。HeLa细胞被模拟转染（车道1,2)或转染短干扰Ku80 RNA（lane三)在用10Gy的IR照射前96小时。用所指示的抗体通过蛋白质印迹分析核提取物。(d日)Ku80 Western信号的量化c。报告的值与车道中观察到的信号有关1并被赋予任意值1。(电子)pT2609Ab信号的量化c（c）。报告的值与车道中观察到的信号有关1.

体外，Ku刺激DNA-PKcs的激酶活性(Dvir等人，1992年;戈特利布和杰克逊1993). 然而，Ku在体内激活DNA-PKcs的作用尚不清楚。几项研究表明，DNA-PKcs本身能够与DNA末端结合(Cary等人，1997年;Yaneva等人，1997年)在缺乏Ku的情况下具有激酶活性(Yaneva等人，1997年;哈马斯腾和楚1998). 为了解决Thr2609处DNA-PKcs磷酸化对Ku的需求问题，我们使用短干扰RNA（siRNA）来降低HeLa细胞中Ku的水平(Elbashir等人，2001年). 用Ku80特异的21-bp siRNA瞬时转染HeLa细胞，将Ku80蛋白水平降至模拟转染细胞中Ku80蛋白的～50%（图。​（图3c、d）三c、 d）不影响DNA-PKcs蛋白水平（图。​（图3c）。三c） 。引人注目的是，这些Ku80敲除细胞在10 Gy的IR作用下，DNA-PKcs Thr2609磷酸化降低了约80%（图。​（图3c、e）。三c、 e）。Ku80蛋白的减少对DNA损伤反应途径没有总体影响，因为Ser966处染色体蛋白1（SMC1）结构维持的磷酸化，该位点在IR反应中被ATM磷酸化(Kim等人，2002年;Yazdi等人，2002年)，在Ku80敲除细胞中是正常的（图。​（图3c）。三c） 。这些结果支持体内激活DNA-PKcs激酶对Ku的需求。考虑到Thr2609最初被确定为体外DNA-PKcs自动磷酸化的靶点，以及在体内其磷酸化对沃特曼敏感但不需要ATM，DNA-PKc中Thr2608的磷酸化很可能是由DNA-PKcss本身介导的。

NHEJ中DNA-PK功能的当前模型表明，它必须位于DSB现场(史密斯和杰克逊1999)尽管由于哺乳动物细胞中DNA-PK的高水平，很难直接显示这一点。然而，如果IR-诱导的DNA-PKcs磷酸化具有功能意义，则磷酸化的DNA-PKcs应定位于DSB位点。为了验证这一预测，我们用免疫荧光显微镜检查了DNA-PKcs在细胞中的定位。正如预期的那样，用特异性单克隆抗体（25-4）对人原代成纤维细胞中的DNA-PKcs进行免疫染色，在未受辐射和受辐射细胞的整个细胞核内都产生了非常强烈的信号（图。​（图4a，4a、 红色）。相反，pT2609Ab免疫染色显示，暴露于5Gy IR后，信号增强，病灶形成（图。​（图4a，4a、 绿色），证实Thr2609的磷酸化可由DNA损伤诱导。我们还检测了两种不同DNA-PKcs状态的人脑胶质瘤细胞系中两种抗体的免疫染色(Lees-Miller等人，1995年). 在DNA-PKcs缺陷的M059J细胞中，暴露于5 Gy IR后30分钟，两种抗体均未检测到信号（图。​（图4b），4b） ，证实该细胞系中缺乏DNA-PKcs蛋白。相反，在DNA-PKcs产生的M059K细胞系中用25-4单克隆抗体进行免疫染色，在细胞核内产生强烈的信号。更重要的是，pT2609Ab染色再次清楚地显示出DNA损伤引起的病灶形成（图。​（图4b）。4b） 。M059J细胞中缺乏可检测的病灶证实了pT2609Ab的特异性，并表明在DNA-PKcs产生细胞中用该抗体观察到的病灶确实与DNA-PKc的磷酸化形式相对应。

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图4

DNA-PKcs对电离辐射（IR）形成病灶。(一)DNA损伤诱导的pT2609病灶。将原代人成纤维细胞进行模拟处理或用5 Gy的IR照射（如图所示），使其恢复30分钟，然后用25-4单克隆DNA PKcs（红色）和pT2609Ab（绿色）进行固定和染色。(b条)pT2609病灶在DNA-PKcs缺陷的细胞中不存在。用5 Gy照射DNA-PKcs-deficient（M059J）和DNA-PKcs producient（M 059K）细胞株，使其恢复30 min，然后用25-4单克隆（红色）和pT2609Ab（绿色）抗体进行免疫染色。(c（c）)磷酸化DNA-PKcs与γ-H2AX的配体化。用1Gy照射人原代成纤维细胞，IR后30min固定，用pT2609Ab（绿色）和抗组蛋白H2AX磷酸化Ser139单克隆抗体（红色；Upstate Biotech）染色。将这两个图像合并，pT2609和γ-H2AX病灶的共定位显示为黄色。(d日)磷酸化DNA-PKcs与53BP1的配体化。实验按如下方式进行c（c）但使用53BP1单克隆（红色）。

为了解决IR后磷酸化DNA-PKcs是否与DSB相关，我们检测了其与磷酸化组蛋白H2AX（γ-H2AX）和p53结合蛋白1（53BP1）的可能共定位。此前已经证明，γ-H2AX病灶几乎在暴露于IR后立即形成，并定位于DNA链断裂部位(Rogakou等人，1999年;Paull等人，2000年). 53BP1还通过与γ-H2AX共定位而被证明定位于损伤部位，并被认为在ATM介导的DNA损伤信号通路中发挥重要作用(Rappold等人，2001年). 用IR处理原代人成纤维细胞，IR后孵育30分钟，然后用pT2609Ab和γ-H2AX抗体固定并染色（图。​（图4c）4c） 或53BP1（图。​（图4d）。4d） ●●●●。所有三种抗体都显示了IR诱导的病灶的形成，并且合并的图像显示了Thr2609磷酸化的DNA-PKcs与γ-H2AX和53BP1的强共定位（图。​（图4c4c和d）。这些结果提供了第一个证据，证明DNA-PKcs确实定位于细胞中DSB的位点，因此位于正确的位置，在DSB修复中发挥直接作用。

为了直接研究Thr2609处DNA-PKcs磷酸化与DSB重新连接的生物学意义，我们在DNA-PKc缺陷的V3 CHO细胞系中表达野生型或突变型（T2609A）DNA-PKcs(Kurimasa等人，1999年). 分离表达野生型（V3-F18）或T2609A突变蛋白（V3-T2609A1）的稳定V3细胞系。单独转染载体（V3-JM）的V3细胞株含有检测不到的DNA-PKcs蛋白水平，而V3-F18和突变的V3-T2609A1细胞显示出类似的DNA-PKcs蛋白表达水平（图。​（图5a）。5a） ●●●●。研究了这些稳定转染细胞的辐射敏感性和DNA DSB重接能力。

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图5

双链断裂（DSB）修复需要Thr2609的磷酸化。(一)V3互补细胞中的蛋白质表达水平。对单独转染载体（V3-JM）、全长野生型DNA-PKcs（V3-F18）或含有T2609A点突变（V3-T2609A1）的DNA-PKc制备的V3核提取物进行DNA-PKcs-蛋白表达水平分析(顶部). 对仓鼠沃纳蛋白进行分析，以显示样品装载量相等(底部). (b条)通过集落形成实验比较三种转染的V3细胞系的辐射敏感性。以指定剂量照射V3-JM、V3-F18和V3-T2609A1，并对其进行平板处理，以分析存活率和抗集落形成能力。(c（c）)FAR公司(（f）的提取一活动第页eleased）测定法测定DNA DSBs的存在。以指示剂量照射V3-JM、V3-F18和V3-T2609A1细胞系和亲代CHO细胞系（AA8），并通过FAR分析DSB的存在。DNA保留百分比越大，DSB保留的数量越少。

通过在IR后检测其克隆形成能力来检测这些细胞系的辐射敏感性。如我们之前所示，通过表达野生型人类DNA-PKcs来补充V3细胞大大增加了它们的放射抗性（图。​（图5b），5b） 导致存活水平与野生型CHO细胞相当(Kurimasa等人，1999年). 相反，尽管T2609A突变蛋白的表达提高了V3-T2609A1细胞系的存活率，但其显著低于V3-F18细胞系。V3-JM、V3-T2609A1和V3-F18细胞系10%存活所需的IR剂量分别为1.2 Gy、2.4 Gy和5 Gy（图。​（图5b）。5b） 。因此，D₁₀与V3-JM未补体细胞相比，V3-F18的值大约高出四倍（即5 Gy/12 Gy），而V3-T2609A1细胞在10%存活水平下的阻力仅增加了两倍（5 Gy/2.4 Gy）。因此，Thr2609的磷酸化对IR反应中的细胞存活至关重要(（f）的提取一活动第页用释放）法评估三种细胞系中每一种细胞重新加入IR诱导的DSB的能力。FAR分析使用脉冲场凝胶电泳，通过量化IR暴露后立即释放的DNA数量（作为剂量的函数），或在孵育一段时间后允许在给定剂量后修复，间接测量琼脂糖塞温和溶解后细胞中DNA的完整性(Story等人，1994年). V3-F18和亲本AA8 CHO细胞系显示出可比较的DSB再结合能力（图。​（图5c，5c、 分别为开环和闭环）。相反，V3-JM和V3-T2609A1细胞在照射后4小时DNA DSBs的重新结合方面明显更具缺陷（图。​（图5c），5c） 与我们之前的观察结果一致(Kurimasa等人，1999年)假设DNA-PKcs在DSB修复中起重要作用。总之，这些结果提供了令人信服的证据，证明Thr2609处DNA-PKcs的磷酸化对于DSB的重新连接和对IR引起的DNA损伤的细胞生存非常重要。

总之，我们已将Thr2609鉴定为DNA损伤诱导的磷酸化位点。我们已经证明，磷酸化的DNA-PKcs在DNA DSB修复中发挥着重要作用，因为它定位于损伤部位，并且因为表达含有T2609A点突变的DNA-PKcs蛋白的细胞显示出辐射敏感性增加和重新加入DNA DSB的能力受损。很可能Thr2609不是DNA-PKcs上唯一的（自动）磷酸化位点，因为体内标记有³²P表明存在磷酸苏氨酸和磷酸丝氨酸残基（D.W.Chan和D.J.Chen，未解释）。额外DNA-PKcs磷酸化位点的存在可以解释为什么V3-T2609A1细胞的辐射敏感性仅显示出大约两倍的增加（在10 Gy时；图。​图5b）。5b） 。我们推测，为了应对DNA损伤，可能需要多个位点的磷酸化来实现适当的DNA-PK功能，因此，Thr2609的突变只会使辐射敏感性增加两倍。

三种大的PI-3-样蛋白激酶-ATM、ATR和DNA-PKc在维持人类基因组中起着重要作用(克里奇洛和杰克逊1998). ATM和ATR已被牢固确立为通过磷酸化将DNA损伤信号传递给下游效应器的检查点通路激活的中心参与者(周和Elledge 2000). 这些途径的许多组成部分已被阐明。相反，DNA PKcs活性似乎不在检查点途径中发挥作用，而是在修复过程本身发挥作用。与ATM和ATR相比，对于DNA-PK对DNA损伤的反应机制知之甚少。我们的研究结果表明，DNA-PKcs在Thr2609对IR的自磷酸化作用确立了其在DSB修复中的作用。此外，确定在IR后10分钟内可检测到磷酸化，以及在IR后早期发现磷酸化蛋白与细胞DSB附近的γ-H2AX和53BP1蛋白相关，为该机制提供了重要线索。虽然Thr2609磷酸化的确切作用尚不清楚，但可能包括调节DNA-PKcs的激酶活性或调节蛋白-蛋白质相互作用，以招募其他修复因子，协调NHEJ对DSB的重新连接。这两个假设与我们之前在体外研究中的观察结果一致，即DNA-PKcs磷酸化导致其与Ku分离并失去其激酶活性(Chan和Lees-Miller，1996年). 未来的研究将有助于阐明DNA-PK依赖性NHEJ通路的分子机制，以确定DNA-PKcs中可能存在的其他磷酸化位点、其他DNA-PK-底物以及与DNA-PKc相互作用以应对DNA损伤的蛋白质。

材料和方法

致谢

脚注

工具书类