《美国病理学杂志》。2003年10月；163(4): 1261–1273.
转化生长因子β依赖和非依赖途径诱导β6肾小管间质纤维化−/−老鼠
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马立军
病理科的，*田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学中心；研究服务，†田纳西州纳什维尔退伍军人管理医疗中心；和肺生物中心，‡加利福尼亚大学旧金山分校
杨海春
病理科的，*田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学中心；研究服务，†田纳西州纳什维尔退伍军人管理医疗中心；和肺生物中心，‡加利福尼亚大学旧金山分校
阿里亚娜·加斯佩特
病理科的，*田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学中心；研究服务，†田纳西州纳什维尔退伍军人管理医疗中心；和肺生物中心，‡加利福尼亚大学旧金山分校
吉安卢卡·卡莱索
病理科的，*田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学中心；研究服务，†田纳西州纳什维尔退伍军人管理医疗中心；和肺生物中心，‡加利福尼亚大学旧金山分校
梅丽莎·巴蒂
病理科的，*田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学中心；研究服务，†田纳西州纳什维尔退伍军人管理医疗中心；和肺生物中心，‡加利福尼亚大学旧金山分校
杰弗里·戴维森
病理科的，*田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学中心；研究服务，†田纳西州纳什维尔退伍军人管理医疗中心；和肺生物中心，‡加利福尼亚大学旧金山分校
迪安·谢泼德
病理科的，*田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学中心；研究服务，†田纳西州纳什维尔退伍军人管理医疗中心；和肺生物中心，‡加利福尼亚大学旧金山分校
阿格尼斯·福戈
病理科的，*田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学中心；研究服务，†田纳西州纳什维尔退伍军人管理医疗中心；和肺生物中心，‡加利福尼亚大学旧金山分校
病理科的，*田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学中心；研究服务，†田纳西州纳什维尔退伍军人管理医疗中心；和肺生物中心，‡加利福尼亚大学旧金山分校
摘要
转化生长因子-β1（TGF-β1）和肾素-血管紧张素-醛固酮系统是肾纤维化的关键介质。整合素αvβ6是一种在上皮细胞中表达的异二聚体基质受体，结合并激活潜在的TGF-β1。我们使用β6整合素缺失小鼠（β6−/−)在单侧输尿管梗阻（UUO）模型中，确定局部TGF-β1激活在肾纤维化中的作用。β6导致肾脏阻塞−/−与野生型（WT）小鼠阻塞性肾脏相比，小鼠表现出更少的损伤，这与I型胶原、III型胶原、纤溶酶原激活物抑制剂（PAI-1）和TGF-β1 mRNA水平较低以及胶原蛋白含量较低有关。输注血管紧张素II（Ang II）或醛固酮（Aldo）或β6组合−/−UUO小鼠的胶原蛋白含量显著增加，与相同处理的WT小鼠相当。β6中TGF-β蛋白的活性表达−/−与匹配的WT小鼠相比，注射或不注射Ang II的UUO小鼠肾脏中的Ang II含量较少。β6中激活的Smad 2水平−/−阻塞的肾脏低于WT-UUO小鼠，并且在β6诱导纤维化时不会增加−/−通过Ang II输注的UUO小鼠。抗TGF-β抗体只能部分降低AngⅡ刺激的β6纤维化−/−UUO肾脏。现场杂交和免疫染色显示β6肾小管上皮PAI-1 mRNA和蛋白的低表达−/−UUO肾脏，对Ang II、Aldo或两者的反应中PAI-1表达增加。我们的结果表明，阻断αvβ6介导的TGF-β1激活可以保护肾小管间质纤维化。此外，在梗阻性β6中激活的Smad2水平没有增加的情况下，肾小管间质纤维化的强力诱导−/−Ang II小鼠表明存在通过血管紧张素诱导纤维化的TGF-β1非依赖性途径。
转化生长因子（TGF）-β被认为是纤维化和免疫调节的关键分子，在许多纤维化条件下其表达增加。1哺乳动物表达三种亚型（TGF-β1、TGF-α2和TGF-γ3），它们以潜在形式合成，必须先被激活，然后才能与受体结合并诱导TGF-δ介导的效应。成熟TGF-β与同一基因产物的N末端片段[称为潜伏相关蛋白（LAP）]的非共价结合负责维持TGF-α亚型的潜在形式。1
整合素由控制细胞间和细胞外基质相互作用的α和β亚单位组成，从而影响生长、分化和发育。整合素αvβ6主要在上皮细胞上表达，并作为细胞外基质蛋白纤维连接蛋白、tenascin和vitronectin的RGD基序的受体。2在器官发生过程中，αvβ6整合素在肺、皮肤和肾脏中高度表达。三在小鼠中，β6整合素亚基mRNA在妊娠第11天的表达非常低，E14和E17显著增加，出生后2周趋于稳定。成年大鼠β6整合素mRNA的表达存在于近端小管、皮质厚升肢、髓内和髓外集合管以及致密斑。4αvβ6整合素的表达随着肾脏的炎症或修复而增加，例如慢性肾盂肾炎或移植排斥反应。三缺乏αvβ6整合素的小鼠皮肤和肺部出现明显炎症，但没有肾脏结构异常。5
TGF-β1 LAP是整合素αvβ6的配体，其结合诱导TGF-。6此外，在肺上皮细胞损伤的博莱霉素模型中，缺乏β6整合素的敲除小鼠能够完全抵抗野生型（WT）中形成的纤维化。6有趣的是，尽管在敲除过程中巨噬细胞持续浸润，但这种对损伤的保护作用与WT中的巨噬细胞浸润程度相似。这种保护作用与缺乏αvβ6整合素阻止TGF-β1活化有关。
活化的TGF-β通过至少四种方式促进基质积累，包括增加基质蛋白的合成，增加参与细胞表面基质组装的整合素的合成，减少基质金属蛋白酶的合成，以及增加蛋白酶抑制剂的合成，包括纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1），从而减少基质降解。PAI-1是组织型纤溶酶原激活物（t-PA）和尿激酶样纤溶酶酶原激活剂（u-PA）的主要生理抑制剂，两者都能将纤溶酶原激活为纤溶酶，从而促进纤溶和蛋白水解。7,8质粒还激活其他潜在的基质金属蛋白酶。已证实肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）与PAI-1的重要相互作用在体外和体内支持血管紧张素直接诱导PAI-1，并通过醛固酮（Aldo）增强这种诱导。9-12然而，在体外数据表明，血管紧张素诱导PAI-1具有早期TGF-β非依赖性阶段，晚期TGF-α依赖性增加PAI-1。13因此，RAAS、TGF-β和PAI-1在损伤反应和纤维化中密切相关。14在本研究中，我们使用β6−/−研究TGF-β依赖性和非依赖性肾纤维化的可能机制。
材料和方法
动物
成年雄性WT和β6整合素缺失小鼠（β6−/−)使用C57BL/6或129Sv背景。小鼠被安置在无病原屏障设施的微隔离器笼中。所有方案均由范德比尔特大学机构动物护理和使用委员会批准。
实验方案
WT和β6组−/−10至12周龄的小鼠接受了单侧输尿管梗阻（UUO）（WT-UUO，n个= 12; β6−/−UUO、，n个=12）在上述无菌条件下。15小鼠左侧输尿管用6-0丝进行双结扎，并在两个结扎点之间切开。上结扎始终位于肾脏下极的水平。在初步研究中，在UUO后，129和C57BL/6背景下发生了相同程度的纤维化，因此将结果合并。为了研究RAAS对纤维化的影响，将血管紧张素II（Ang II）、Aldo或两者同时应用于其他小鼠（WT UUO+Ang II，n个= 6; β6−/−UUO+Ang II，n个= 6; WT UUO+Aldo，n个= 4; β6−/−UUO+奥尔多，n个= 3; WT UUO+Ang II/阿尔多，n个= 6; β6−/−UUO+Ang II/阿尔多，n个= 6). 将装有Ang II（浓度为40μg/kg/h；Bachem Bioscience Inc.，Torrance，CA）的微渗透泵（Alzet，型号1002；Durect Corp.，Cupertino，CA）插入腹腔。以0.25μl/小时的速率输送含盐泵的内容物，持续2周。将Aldo可植入微丸（美国创新研究公司，佛罗里达州萨拉索塔）皮下植入2周，以140μg/kg/天的速度释放。16Ang II或Aldo的剂量基于之前的长期研究，研究表明，在具有这些水平的大鼠中，只有中度高血压伴轻度纤维化，以及我们未发表的轻度高血压、PAI-1诱导，但在小鼠中使用这些剂量8周后，只有轻微纤维化的数据。17
为了确定诱导纤维化的TGF-β依赖性和非依赖性途径，对WT或β6给予单克隆抗TGF-−/−注射或不注射Ang II的UUO小鼠。每隔一天通过腹腔注射给予低剂量和高剂量的1D11（低，0.5 mg/kg/体重；高，5 mg/kg/重量）和对照抗体（13C4，5 mg/kg体重）。抗TGF-β抗体的剂量是根据抑制小鼠TGF-？的生物活性而选择的，而不会在身体任何器官中产生组织病理学。18第一次TGF-β抗体注射在UUO前1天进行。用如下抗体处理WT UUO小鼠：对照抗体13C4（WT UUO+CONT Ab，n个= 5; WT UUO+Ang II+CONT Ab，n个=3），大剂量抗TGF-β抗体（WT-UUO+H-TGF-，n个= 5; WT UUO+Ang II+H-TGF-βAb，n个=5），或低剂量抗TGF-β抗体（WT UUO+L-TGF-，n个= 4; WT UUO+Ang II+L-TGF-βAb，n个= 4). β6−/−注射Ang II的UUO小鼠用以下抗体治疗：对照抗体13C4（β6−/−UUO+Ang II+CONT抗体，n个=4），大剂量抗TGF-β抗体（β6−/−UUO+Ang II+H-TGF-，n个=8），或低剂量抗TGF-β抗体（β6−/−UUO+Ang II+L-TGF-β，n个= 5). UUO手术后5或14天，处死上述组的小鼠，并采集阻塞和未阻塞的对侧肾脏（用作正常对照）进行形态学、免疫染色、生化和分子评估。
形态学评估
在Masson的经三色染色的冠状切片上对肾小管间质纤维化程度进行评分。每个区域的所有皮质和髓质区域的得分从0到4+，并计算每个肾脏的平均值。在肾小管间质纤维化所占的每一个区域中，纤维化被评估为0（0%）、1（<25%）、2（25-50%）、3（>50-75%）和4（>75%）。在不了解治疗方案的情况下对所有切片进行检查。
血压测量
在室温下，使用尾切式血压监测仪测量清醒训练小鼠的大鼠和小鼠（2000型；日本东京室町Kikai有限公司）的收缩压。
免疫组织化学
肾脏组织在4°C的4%多聚甲醛中固定过夜，并使用标准技术嵌入石蜡中。对4μm切片进行脱蜡和再水化。用3%过氧化氢酶将内源过氧化物酶淬火10分钟，并暴露于Power Block（加利福尼亚州圣拉蒙市BioGenex实验室）45分钟。
增殖细胞核抗原（PCNA）细胞周期蛋白多肽免疫组化使用小鼠-小鼠试剂盒（Innogenex，San Ramon，CA）鉴定增殖细胞。应用单克隆小鼠抗人PCNA（1:100；DAKO Corp.，Carpindia，CA），然后使用兔抗鼠抗体（DAKO）、生物素化山羊抗兔Ig（BioGenex）和过氧化物酶结合链霉亲和素。使用0-4+量表，通过对每节所有高倍皮质区域进行评分，对皮质中PCNA阳性的小管间质细胞进行半定量（0-4表示：0%，<25%，25-50%，>50-75%，以及>75%区域中的小管间质细胞核显示阳性核染色）。
为了对PAI-1进行免疫染色，在4℃下使用兔抗鼠PAI-1抗体（1:50；美国诊断公司，格林威治，CT）过夜，然后使用生物素化山羊抗兔Ig（BioGenex）和过氧化物酶结合链霉亲和素。
为了检测活性TGF-β，用透明质酸酶（Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO）以1 mg/ml的浓度在37°C下含0.85%NaCl的0.1 mol/L醋酸钠（pH 5.5）中处理切片30分钟。用5%的正常山羊血清封闭后，在4°C下使用6.5μg/μl Tris缓冲盐水/0.4%Triton缓冲液中的活性TGF-β兔多克隆抗体（LC 1-30-1；由国家癌症研究所Kathy Flanders博士赠送）过夜。19添加生物素化山羊抗兔Ig（BioGenex），然后添加过氧化物酶偶联链霉亲和素。
TSP-1在4°C下用一级山羊抗人TSP-1（1:100，N-20，sc12312；Santa Cruz Biotechnology Inc.，Santa Cru z，CA）和二级辣根过氧化物酶结合抗羊抗体（1:100）染色过夜。添加二氨基联苯胺作为发色剂。
通过大鼠抗鼠F4/80抗体（1:20；Serotec公司，北卡罗来纳州罗利市）检测巨噬细胞浸润。使用生物素化抗大鼠二级抗体（加利福尼亚州伯林盖姆Vector Laboratories，Burlingame，CA），然后使用链霉亲和素结合碱性磷酸酶（Innogenex）。用0.25%左旋咪唑封闭10分钟后，添加西格玛快速红TR/萘酚AS-Mx片（西格玛）作为显色剂。用苏木精对载玻片进行复染。对间质中浸润的巨噬细胞进行计数，数据表示为每个高倍视野中的巨噬细胞数量。用非特异性抗血清而不是一级抗体处理的对照玻片没有染色。
肾胶原蛋白总含量
冷冻部分肾组织，并根据羟脯氨酸和脯氨酸的浓度计算相对胶原蛋白含量占总蛋白的百分比，通过反相高效液相色谱法测量羟脯氨酸和脯氨酸的苯基异硫氰酸酯衍生物。20简言之，组织匀浆被水解真空中在恒沸HCl（110°C，16小时）中干燥，取1 ml复烤溶液[乙醇/水/（C2H5）3N，2:2:1]，并在氮气下复烤100μl。添加20μl衍生试剂[甲醇/水/（C2H5）3N/-苯基异硫氰酸酯，7:1:1:1]，并在室温下进行反应20分钟。然后在离心过程中将样品冻干，以去除试剂。在此阶段将样品冷冻或用缓冲液（5%乙腈溶于5 mmol/L磷酸二钠中，pH 7.4）稀释至1 ml。以相同方式干燥并偶联含有氨基酸标准物的溶液。在这些条件下，耦合效率>99%。通过在每个匀浆中加入去甲亮氨酸，使回收率和效率标准化。
北方斑点杂交
按照所述进行Northern杂交。21用Trizol试剂（纽约州格兰德岛生命科技公司）提取肾脏总RNA。将20μg总RNA装入1%琼脂糖凝胶中，通过电泳进行分离，并转移到尼龙膜上。这些印迹与以下cDNA探针杂交：小鼠PAI-1（365 bp），21小鼠TGF-β1（974 bp）、人类胶原蛋白I（弗吉尼亚州马纳萨斯美国型培养物收藏中心）和小鼠胶原蛋白III（355 bp）。为了评估RNA负载，用大鼠看家基因GAPDH cDNA重制印迹。特定信息与GAPDH的比率用于量化每个组织样本的表达。
现场杂交
[35S] 如前所述，通过pCR II质粒（Invitrogen，Carlsbad，CA）的转录，结合SP6或T7 RNA聚合酶（Ambion Inc.，德克萨斯州奥斯汀）的PAI-1 cDNA插入物，制备PAI-1的标记正反义核糖探针。22用蛋白酶K和三乙醇胺/醋酸酐处理后，切片在乙醇中脱水并风干。如前所述进行杂交。A控件就地用感测探针进行杂交，未发现特异性信号。
Smad 2的Western Blot分析
将冷冻肾组织转移到含有150 mmol/L NaCl、50 mmol/L-Tris-HCl、pH 7.5、5 mmol/L/乙二胺四乙酸、1%Nonide P-40、0.5%脱氧胆酸钠、0.1%十二烷基硫酸钠、100μg/ml苯甲基磺酰氟、1:100磷酸酶抑制剂鸡尾酒I的RIPA+缓冲液中，1:100磷酸酶抑制剂鸡尾酒II（Sigma）、1:100蛋白酶抑制剂鸡尾饮片（德国曼海姆罗氏诊断有限公司）。组织样品在1.5 ml均质器（Pellet Pestle Dips；Kontes Glass Company，Vineland，NJ）中在冰上均质，并在4°C下以13000 rpm离心15分钟。使用Dc蛋白质检测试剂盒（加利福尼亚州Hercules的Bio-Rad实验室）测量蛋白质浓度。将50μg样品中的蛋白质加载到10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳上，并转移到0.2μmol/L硝化纤维素膜上。使用特异性兔抗磷酸化Smad2（P-Smad2）多克隆抗体（Upstate Biotechnology，Lake Placid，NY）在4°C、1:500稀释液下过夜检测磷酸化Smad2（P-Smad2）。在含有0.1%吐温20（TBS-T）的Tris缓冲盐水中洗涤后，添加辣根过氧化物酶标记的驴抗兔IgG二级抗体（1:2500稀释液，加入5%牛奶TBS-T中），并在室温下孵育50分钟。根据制造商的说明，ECL Plus（伊利诺伊州阿灵顿高地阿默沙姆）可显示蛋白质印迹上的蛋白质带，并在胶片上显影。用100 mmol/Lβ-巯基乙醇、2%十二烷基硫酸钠、62.5 mmol/L-Tris-HCL、pH 6.7剥离膜。使用兔抗Smad 2多克隆抗体检测总Smad 2（T-Smad 2）（Zymed Laboratories Inc.，San Francisco，CA）。从TGF-β1刺激的人结肠癌细胞系FET中获得的细胞裂解物（12 ng/ml，1小时，由范德比尔特大学医学中心Pran Datta博士善意提供）用作阳性对照。
统计分析
结果表示为平均值±SEM。通过单因素方差（方差分析）评估统计差异，然后是未配对学生的t吨-根据需要进行测试。Mann Whitney对非参数数据进行了比较U型-测试。A类P（P）值<0.05被认为是显著的。
结果
β6肾小管间质纤维化−/−UUO肾脏
第5天，WT小鼠梗阻肾脏出现肾小管扩张、肾小管萎缩和间质空间扩大。WT小鼠梗阻后第14天，皮质和髓质的小管间质损伤均进展。相反，β6阻塞肾脏−/−小鼠的损伤明显减少（图1）WT和β6中的非梗阻性肾脏−/−小鼠的PCNA阳性细胞很少。野生型肾小管上皮细胞有显著增殖，但β6没有−/−小鼠，阻塞后（图2）UUO后巨噬细胞浸润在β6中更为显著−/−但这种差异在统计学上并不显著（图3）WT和β6中的非梗阻对照肾−/−小鼠表达的I型胶原、III型胶原、PAI-1和TGF-β1的mRNA水平与低水平相似（图4）I型胶原的肾脏mRNA水平（图4，A和B），胶原蛋白III（图4，A和C），PAI-1（图4，A和D）和TGF-β1（图4，A和E）WT小鼠对UUO的反应增加。相反，β6−/−在第14天，小鼠的mRNA表达水平仅为阻塞性WT小鼠的三分之一至一半（I型胶原：WT UUO 1.2±0.1与β6−/−UUO 0.3±0.02，P（P）< 0.01; 胶原蛋白III：WT UUO 1.3±0.1与β6−/−0.4 ± 0.1,P（P）< 0.01; PAI-1:WT UUO 1.1±0.1与β6−/− 0.03 ± 0.1,P（P）<0.01，TGF-β1:WT+UUO 3.6±0.2与β6−/−1.9±0.2，均表示为相对于GAPDH mRNA的密度比（图4）.
梗阻肾脏的肾脏形态学变化。答：β6−/−UUO后第5天和第14天，小鼠的纤维化程度低于时间匹配的WT。B类和抄送：纤维化的半定量评分（0-4+评分）显示β6的损伤较小−/−皮层UUO(B类)和髓质(C类)与WT UUO相比(n个在第5天每组＝4，n个=每组在第14天时为8）。数据显示为平均值±SEM。马森三色染色；原始放大倍数，×200。
UUO后管状细胞增殖。答：WT和β6小管和间质PCNA免疫染色−/−第5天UUO肾脏。B类：第5天皮层PCNA阳性小管间质细胞的半定量评分(n个=每组4个）。数据显示为平均值±SEM。原始放大倍数，×400。
第14天阻塞肾脏中F4/80+间质巨噬细胞。答：WT和β6中的巨噬细胞（红色）−/−UUO肾脏。B类：每个高倍视野平均巨噬细胞数量的定量(n个=每组8）。数据显示为平均值±SEM。原始放大倍数，×400。
肾脏mRNA表达的Northern印迹分析。胶原蛋白I(A类,B类)，胶原蛋白III(A类,C类)，PAI-1(A类,D类)和TGF-β1(A类,E类)β6在肾脏中的mRNA表达显著降低−/−UUO公司与第14天的WT UUO(n个=每组5人）。数据显示为平均值±SEM。
收缩压
假手术对照小鼠（104±6 mmHg）和所有其他仅患有UUO的动物的血压保持正常（图5）UUO WT和UUOβ6的血压显著升高−/−小鼠输注血管紧张素II 14天（图5）与单独注射UUO的小鼠相比，单独注射Aldo导致血压轻微升高，但并不显著。WT和β6的血压−/−与单独注射血管紧张素和醛固酮相比，联合注射血管紧张肽和醛固醇后，UUO小鼠的血压进一步升高（图5）.
收缩压（SBP）。在UUO WT和UUOβ6中，单独或与Aldo联合输注血管紧张素II 14天显著升高收缩压−/−老鼠。单独输注Aldo后收缩压略有升高(n个＝每组3至8个）。数据显示为平均值±SEM。
β6纤维化的诱导−/−RAAS的UUO肾脏
与β6相比，WT UUO梗阻肾的胶原蛋白含量显著增加−/−第14天的UUO（胶原蛋白/总蛋白的百分比8.8±0.9与2.7 ± 0.8,P（P）< 0.01; 图6). 相反，β6受阻−/−与基线相比，胶原蛋白含量没有显著增加（图6）在β6中−/−UUO小鼠输注Ang II或Aldo或两者联合14天后，胶原蛋白含量显著增加，与输注WT UUO的水平相当（图6）β6中单独输注Ang II或Aldo−/−UUO小鼠不影响巨噬细胞浸润。Ang II和Aldo联合输注治疗β6−/−UUO小鼠显著减少巨噬细胞浸润。相反，在WT UUO中，Ang II输注导致巨噬细胞浸润增加，达到与阻塞的β6类似的水平−/−肾脏（巨噬细胞/hpf：β6−/−UUO 41±7与重量UUO 23±9，pNS；β6−/−UUO+Ang II 32±9，β6−/−UUO+Aldo 36±8，β6−/−UUO+Ang II/Aldo 21±6；β6−/−UUO公司与β6−/−UUO+Ang II/阿尔多，P（P）< 0.05; WT UUO+Ang II 51±14，WT UU+Aldo 39±6，WT U UU+Ang II/Aldo 34±1，WT UUO与WT UUO+Ang II，P（P）< 0.05).
肾脏胶原蛋白含量。与未梗阻的对侧肾脏相比，第14天WT UUO中的总胶原蛋白含量（以总蛋白百分比表示）增加，而β6无明显变化−/−响应UUO。注入Ang II或Aldo或联合用药可恢复β6的完全纤维化反应−/−无人机(n个=WT和β6各8−/−只有UUO；n个=WT和β6各3至8−/−UUO加输液）。数据显示为平均值±SEM。
血小板反应蛋白（TSP）-1的表达
TSP-1蛋白是TGF-β的潜在激活物，在WT和β6中，在非梗阻肾小动脉和动脉的平滑肌细胞中同样丰富−/−老鼠。TSP-1在皮质小管上皮细胞阻塞的WT中显著增加，呈弥漫性强颗粒模式。相反，在阻塞的β6中，受损小管中TSP-1的存在较少−/−肾脏。注入血管紧张素Ⅱ治疗阻塞性β6−/−小鼠导致TSP-1表达更强烈、更弥漫的颗粒模式，类似于Ang II融合的WT UUO（图7）.
TSP-1蛋白表达。TSP-1蛋白在WT和β6小动脉和动脉平滑肌细胞的非梗阻肾脏中被鉴定−/−老鼠。在梗阻的WT肾皮质小管上皮细胞中，TSP-1显著增加，在第14天呈弥漫性强颗粒模式。相反，阻塞β6的损伤小管中TSP-1表达较少−/−在阻塞的β6中输注血管紧张素II−/−导致TSP-1表达更强烈、更弥漫的颗粒模式，类似于Ang II融合的WT UUO(n个=每组3至6）。数据显示为平均值±SEM。原始放大倍数，×200。
TGF-β活性与纤维化
两个WT中未梗阻肾脏的TGF-β活性免疫染色均为低水平（图8A）和β6−/−小鼠（图8B）活性TGF-β主要在肾小管上皮细胞、间质细胞和肾小球壁细胞中表达，在WT-UUO肾脏中显著增加（图8C）相反，活性TGF-β仅局限于β6的某些小管中−/−UUO肾脏（图8D）表明抑制了这些薄壁小管上皮细胞和间质细胞TGF-β的局部激活。血管紧张素输注显著增加WT-UUO肾脏中TGF-β的活性表达（图8E），但仅轻度增加β6中的活性TGF-β−/−UUO小鼠（图8F）.
活性TGF-β表达。两个WT的非梗阻肾脏中活性TGF-β均低水平表达(A类)和β6−/−老鼠(B类). 在第14天，主要在肾小管上皮细胞、间质细胞和肾小球顶叶细胞中表达的活性TGF-β在WT UUO肾中显著增加(C类). 相反，在β6的小管中检测到的TGF-β活性要低得多−/−UUO肾脏(D类). Ang II输注导致WT UUO肾中TGF-β表达完全激活(E类)但β6中活性TGF-β仅轻度增加−/−第14天的UUO小鼠(F类).n个=每组3至6人。原始放大倍数，×200。
在WT小鼠UUO后第5天和第14天，总Smad 2在非梗阻的对侧和梗阻的肾脏中同样高水平表达（图9A）磷酸化Smad 2是TGF-β信号激活的标志物，在WT梗阻后第5天到第14天显著增加（图9A）相反，磷酸化Smad 2在β6中显著降低−/−在梗阻的β6中注入Ang II诱导纤维化时，肾脏受阻且不增加−/−肾脏（图9、B和C）在用TGF-β1刺激的PET细胞裂解物中大量表达磷酸化S-mad 2作为阳性对照（图9B）.
UUO肾脏中Smad 2的典型Western blot分析。答：WT小鼠UUO后第5天和第14天，未梗阻对侧和梗阻肾脏中的磷酸化Smad 2（P-Smad 2）和总Smad 2。从第5天到第14天，梗阻的WT肾脏中的P-Smad2显著增加，而梗阻的β6中的P-Smad2较低−/−肾脏(B类,C类). β6中的血管紧张素II输注−/−UUO小鼠没有增加P-Smad 2水平(B类,C类). 抗TGF-β抗体治疗β6−/−注射Ang II的UUO小鼠仅在数量上降低P-Smad 2(B类,C类). TGF-β1刺激PET细胞裂解物作为阳性对照(B类) (n个=每组5只）。数据显示为平均值±SEM。
为了进一步研究肾纤维化的机制，我们用抗TGF-β抗体治疗小鼠。首次在单独使用UUO的WT小鼠中检测抗TGF-β抗体对纤维化的影响。与对照抗体相比，低剂量抗TGF-β抗体显著降低梗阻性WT肾脏中的胶原蛋白含量，高剂量抗TGFβ抗体进一步降低（图10）然而，仅抗TGF-β抗体，即使是高剂量，也只能部分抑制（小于50%）WT UUO肾脏中胶原蛋白的增加（图10），有或无Ang II输注（图11）提示其他机制可能在纤维化中起作用。同样，低剂量和高剂量的抗TGF-β抗体（而非对照抗体）显著但仅部分降低了AngⅡ刺激的β6胶原增加−/−UUO肾脏（图11）.β6中抗TGF-β抗体治疗−/−注射Ang II的UUO小鼠仅在数量上减少磷酸化Smad 2（图9、B和C）.
TGF-β抗体对WT-UUO小鼠肾脏胶原含量的影响。对照抗体对梗阻（UUO）WT肾脏中增加的总胶原含量（以总蛋白百分比表示）没有影响与对侧肾无梗阻（C）。低剂量（L）或高剂量（H）TGF-β抗体（Ab）治疗后，总胶原蛋白含量部分但显著受到抑制(n个=每组4至5）。数据显示为平均值±SEM。
TGF-β抗体对AngⅡ融合UUO小鼠肾脏胶原含量的影响。β6中的总胶原蛋白含量（以总蛋白百分比表示）−/−输注Ang II后，UUO肾脏增加，高（H）或低（L）剂量TGF-β抗体（Ab）治疗后仅部分抑制UUO肾。高剂量TGF-β抗体对Ang II输注野生型UUO肾的肾胶原含量有类似的影响(n个=每组3至8）。*，P（P）< 0.01. 数据显示为平均值±SEM。
PAI-1定位与表达
WT UUO在皮质和髓质的小管和移行上皮细胞中显示中度PAI-1 mRNA表达就地杂交，与阻塞β6低水平PAI-1 mRNA表达相比−/−肾脏。阻塞性β6中PAI-1 mRNA表达增加−/−静脉注射Ang II、Aldo或联合用药后的肾脏，其强度和位置与相同治疗的WT小鼠相似（图12）。通过Northern blot和就地杂交，对TGF-β抗体治疗与对照抗体治疗的反应（数据未显示）。
PAI-1 mRNA表达就地杂交。在WT UUO中PAI-1 mRNA表达显著，而在β6中表达很少−/−UUO公司。在Ang II或Aldo或联合输注后，β6中PAI-1 mRNA的表达相似−/−UUO和WT UUO与胶原蛋白积累程度相似相关(n个=每组3至6）。原始放大倍数，×40。
PAI-1蛋白在未阻塞的WT肾脏中不存在（图13A）然而，PAI-1在第14天的WT UUO肾脏中高度表达，主要在皮质近端小管上皮细胞中表达（图13B）和肾小球壁上皮细胞（数据未显示）。Ang II或Aldo的输注（图13，C和D）与单独WT UUO相比，阻塞WT中PAI-1的染色强度或分布没有改变（图13B）相反，β6−/−UUO小鼠在第14天的近端小管中PAI-1明显减少，肾小球中则无PAI-1（图13E）内髓小管局部PAI-1染色强（未显示）。然而，β6中Ang II的输注−/−UUO小鼠PAI-1表达显著增加，与WT中的模式相似，近端小管PAI-1的表达增加（图13F）.
PAI-1在UUO肾脏中的表达。WT非梗阻肾PAI-1免疫反应(A类); WT UUO肾脏(B类); 输注Ang II后的WT UUO肾脏(C类)或阿尔多(D类); β6中−/−UUO肾脏无(E类)或使用(F类)Ang II输注(n个=每组3至6）。原始放大倍数：×400(A–C,E类,F类); ×200 (D类).
讨论
TGF-β和RAAS与纤维化的发生密切相关，并且相互关联。两者通过诱导基质合成和抑制基质降解部分激活纤维化。PAI-1的诱导是后一种机制的有力中介。23虽然血管紧张素可以通过1型受体（AT1）直接诱导PAI-1体内和在体外，一些在体外有证据表明血管紧张素诱导PAI-1的后期TGF-β依赖期。13因此，我们使用β6−/−以确定依赖于局部TGF-β激活的纤维化机制以及独立于这些TGF-β介导的事件的纤维化机制。我们选择了β6−/−小鼠因为它具有正常的表型，不像TGF-β1基因敲除小鼠，后者会死于与显著免疫细胞浸润相关的疾病。由于αvβ6整合素只是TGF-β1活化的一种机制，因此TGF-−/−小鼠没有基线肾脏异常。我们进一步选择使用β6−/−小鼠尤其用于研究肾小管间质纤维化的发展。β6整合素在皮肤上皮、肺上皮和肾小管上皮中表达。4在肾小球中未检测到表达。因此，TGF-β1通过β6的局部肾上皮细胞激活及其对纤维化的重要性可以通过诱导这些小鼠的小管间质损伤来确定。
这项研究确实证明了αvβ6介导的TGF-β激活对于UUO后的完全损伤的发展至关重要。β6中UUO引起的肾小管间质纤维化明显减少−/−小鼠与WT小鼠相比，表明阻断β6机制可以预防肾小管间质纤维化。
TGF-β的激活可通过多种机制发生，包括纤溶酶裂解。24然而，必须存在其他机制体内对于TGF-β的激活，因为敲除纤溶酶原（产生纤溶酶的底物）导致小鼠不具有TGF-α1敲除小鼠的表型。激活TGF-β的其他机制在体外包括活性氧物种和TSP-1。25事实上，TSP-1敲除小鼠的炎症模式与TGF-β1敲除鼠相似，支持血小板反应蛋白在TGF-体内.26在本研究中，WT-UUO肾小管上皮细胞中TSP-1升高。然而，对血管紧张素输注阻塞的β6的反应−/−小鼠，免疫染色显示TSP-1增加，但TGF-β活性降低，表明TSP-1依赖性TGF-−/−肾脏。
然后我们研究了β6缺失保护作用的潜在下游机制。我们检测了WT和β6中局部活性TGF-β1的表达−/−用特异性抗体检测小鼠UUO肾脏TGF-β活性19并发现WT-UUO肾小管上皮细胞和一些间质细胞中的活性TGF-β显著增加，而β6中的活性TGF-β表达很少−/−UUO公司。这一观察结果支持了β6整合素的敲除抑制了肾小管间质中这些实质细胞中TGF-β的局部激活。我们还通过评估其下游信号通路Smad蛋白来研究TGF-β的激活。27,28磷酸化状态的Smad-2被用作TGF-β活化的特异性标记物。Smad 2在TGF-β信号传导中的关键作用的进一步证据是，当Smad 7使其失活时，可以抑制TGF-α诱导的纤维化。29在WT小鼠的梗阻性纤维化肾脏中，我们观察到，正如预期的那样，通过免疫染色和Smad 2的激活间接评估的，活性TGF-β1伴随增强。磷酸化Smad 2在β6梗阻但非纤维化肾脏中的低表达−/−小鼠表明，防止TGF-β1活化是防止β6纤维化的关键机制−/−小鼠，正如之前在博莱霉素肺纤维化模型中观察到的那样。
接下来，我们确定直接RAAS刺激是否可以诱导β6纤维化−/−UUO小鼠。最近在血管紧张素1型受体（AT1a）敲除小鼠中记录了血管紧张素在阻塞性肾病间质纤维化中的作用。30在我们的模型中，血压效应可能已经增强，并有助于RAAS刺激的纤维化效应。然而，Ang II或Aldo输注在非梗阻性肾脏中并没有诱导纤维化，这表明仅系统血流动力学效应不足以导致损伤。在这方面，对血管紧张素原基因0至4拷贝小鼠的研究表明，血管紧张素通过非血流动力学效应调节梗阻性肾病中至少50%的肾间质纤维化反应。31事实上，我们观察到，Ang II、Aldo或两者联合输注14天可以恢复β6的纤维化−/−UUO小鼠。通过TGF-β的中和抗体治疗，这些小鼠中缺乏对Ang II或Aldo诱导的纤维化的完全预防，这支持了纤维化成分的存在，该成分与TGF-？无关。β6中的纤维化−/−通过phospho-Smad 2评估，患有血管紧张素的UUO小鼠与TGF-β活化增加无关，进一步支持了血管紧张素可以诱导梗阻性β6肾小管间质纤维化的TGF-α非依赖性机制−/−老鼠。
血管紧张素是PAI-1的强诱导剂。局部PAI-1表达增加与硬化和肾小管间质纤维化的部位直接相关。10,21,23,32此外，PAI-1基因敲除小鼠对输尿管梗阻诱导的纤维化具有保护作用。33这些结果表明，由于TGF-β活化减少，细胞外基质合成减少，而PAI-1减少介导的基质降解增加，都有助于减少β6中胶原的积累−/−老鼠。实际上，受保护的β6−/−与带有UUO的WT相比，UUO小鼠的PAI-1水平非常低。此外，β6的纤维化反应−/−接受RAAS刺激的UUO小鼠PAI-1表达增加，表明该途径可能部分依赖于TGF-β。重要的是，尽管使用TGF-β抗体进行治疗，但RAAS刺激的β6中纤维化和PAI-1表达主要维持−/−UUO小鼠。我们假设通过PAI-1调节基质降解是纤维化反应的重要组成部分。RAAS刺激的阻塞性WT和β6中PAI-1的增加在强度和位置上相似−/−老鼠。这些发现支持了我们的假设，即纤维化的发展与局部PAI-1表达紧密相关，在缺乏αvβ6的情况下，PAI-1的表达可能与TGF-β无关。
巨噬细胞在组织损伤、介导损伤后的修复和重塑中发挥着不同的作用。活化巨噬细胞的持续存在与肾脏进行性纤维化密切相关。34然而，巨噬细胞本身可能不会介导纤维化。我们的数据表明，尽管UUO后巨噬细胞浸润强烈，但在β6缺乏实质细胞反应性的情况下，间质纤维化减弱−/−小鼠，与之前在肺博莱霉素模型中的观察结果平行。6
巨噬细胞携带AT1受体，对血管紧张素产生趋化和活化反应。35然而，我们已经表明，巨噬细胞的AT1受体介导的作用可能在某些纤维化情况下具有保护作用。尽管巨噬细胞的数量没有改变，但采用AT1a-全骨髓移植在UUO后导致更多损伤。36在当前研究中，我们还观察到巨噬细胞与β6纤维化缺乏相关性−/−UUO小鼠给予RAAS刺激。先前在接受AT1受体拮抗剂治疗的UUO小鼠中也观察到巨噬细胞与纤维化之间缺乏相关性。37在目前的研究中，巨噬细胞浸润减少，尽管血管紧张素输注可完全恢复纤维化，表明非巨噬细胞依赖性纤维化。我们推测，实质细胞PAI-1的表达可能是这种机制之一。
总之，我们已经证明整合素αvβ6是肾纤维化的关键决定因素。尽管巨噬细胞大量浸润，但β6的缺失对小管间质纤维化具有显著的保护作用。血管紧张素和醛固酮均诱导β6纤维化−/−UUO小鼠没有增加TGF-β活化。这种纤维化与PAI-1增加有关。这些数据表明PAI-1诱导中存在TGF-β非依赖性成分。我们的研究结果增加了以整合素αvβ6和/或PAI-1为靶点可能提供治疗肾纤维化的新临床策略的可能性。
致谢
我们感谢Genzyme的Steve Ledbetter博士和国家癌症研究所的Kathy Flanders博士在提供TGF-β抗体方面的帮助。
脚注
向Agnes B.Fogo医学博士、MCN C3310、范德比尔特大学医学中心病理学系、田纳西州纳什维尔加兰大道21号和37232-2561发送转载请求。电子邮件：.ude.tlibrednav@ogof.senga
国家卫生研究院（向A.F.和L.J.M.拨款DK44757和DK56942，向J.D.拨款AG-06528）、退伍军人事务部（向J.D.）和国家心脏、肺和血液研究所（向D.S.拨款HL53949）提供了部分支持。
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