恶性肿瘤患者的预期寿命取决于转移性传播，最初通过淋巴管传播至淋巴结，最终通过血管传播至远处器官。因此，有针对性地破坏已建立的淋巴管，或抑制局部淋巴新生血管，有望减少转移。1直到最近，随着血管内皮生长因子（VEGF）-C和-D被确定为淋巴内皮的特异性生长因子及其相应的酪氨酸激酶受体VEGFR-3，对淋巴血管生成的干预才成为可能2-4然而，在瘤周毛细血管中也有表达。5VEGF-C和VEGF-D在实验性肿瘤中的转基因过表达已经建立了淋巴管密度和淋巴转移率之间的直接关系。6-8这些研究是在植入小鼠体内的人类乳腺癌和黑色素瘤以及小鼠肉瘤中进行的，6,9,10使用新型标记物定位淋巴管，如膜粘蛋白足蛋白，11CD44相关的透明质酸受体LYVE-1。12与接受肿瘤内VEGF生长刺激的肿瘤内血管相比，13毛细淋巴管几乎只出现在肿瘤表面的瘤周基质内，而不是肿瘤内。9,10,14,15这项关于子宫颈鳞癌的研究提供了证据，证明肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的亚组分是VEGF-C和VEGF-D的主要来源，它们的密度与区域淋巴管增殖相关，并且它们可能来自循环单核细胞的亚组份。
材料和方法
组织
7例正常人宫颈、5例低级鳞状上皮内病变、7例高级鳞状上皮间病变和32例国际抗癌联盟（UICC）的存档石蜡包埋或冷冻组织样本本研究纳入了经根治性子宫切除术和盆腔淋巴结清扫术治疗的pT1b1期宫颈鳞状细胞癌。所有程序均按照奥地利法律执行。
免疫组织化学和共聚焦显微镜
在福尔马林固定、石蜡包埋的宫颈组织样本、丙酮固定的冷冻切片或含有培养细胞的载玻片上进行免疫组织化学和免疫荧光。对于蛋白质表达的免疫组织化学检测，使用了具有以下特异性的抗体：VEGF-C（佐米德公司，加利福尼亚州南旧金山）、用自动肽合成器（430A型；加利福尼亚州福斯特市Applied Biosystems公司）制备的VEGF-C15-聚肽（VEGF-C-氨基酸260-274）、CD1、CD2、CD3、CD8、CD14、CD16、，CD19、CD20、CD23、CD34、CD45、CD45RA、CD56、CD68、CD123、HLA-DR（均来自新泽西州佛兰德斯的Research Diagnostics Inc.）、VEGFR-3、，2足蛋白（兔体内培养的IgG，11或小鼠产生的血清）、LYVE-1（亲合力纯化兔抗IgG抗体，由英国牛津的David Jackson博士善意提供）、类胰蛋白酶（Chemicon International Inc.，Temecula，CA）和VEGF-D（Santa Cruz Biotechnology Inc.，Santa Crux，CA）。对于免疫组织化学，使用基于生物素-链霉亲和素-辣根过氧化物酶的方法。对于免疫荧光，使用Alexa 488和Alexa 633标记的二级抗体，对于核反染，使用碘化丙啶（均来自分子探针，尤金，OR）。在Zeiss LSM 510（德国Oberhochen）上进行了三通道共焦激光扫描显微镜分析。
形态计量学
微血管密度由两名对患者临床过程一无所知的独立观察者测定。两位研究者对每位患者的微血管密度评分的平均值被输入到进一步的计算中。在测定淋巴微血管密度（LMVD）时，肿瘤形成的直接邻近区域具有最多明显突出的微血管（热点）16已选定。然后，在0.25mm的检查区域内，以×200的总放大率对所有装饰血管进行计数，以确定LMVD2使用眼网。每个染色的管腔被视为单个可计数的微血管。如果在足蛋白标记的淋巴管管腔内检测到至少一个肿瘤细胞簇，则认为癌性淋巴管病呈阳性。在放大×400倍（视野0.08mm）下，在其最高密度（热点）区域测定VEGF-C和VEGF-D阳性基质细胞的数量2). 在连续组织切片的相同区域测定CD68和VEGF-C表达的基质细胞的比率。VEGF-C在癌细胞中的免疫染色强度分为强（+++）、中（++）和弱表达（+）。肿瘤周围炎症分级为：+，炎症反应稀疏时；++，反应温和/不均匀；和+++，如前所述，有致密、均质的炎症浸润。17
现场杂交
人VEGF-C反义和义RNA探针由线性化的(阿帕我，千磅一） pCR2.1拓扑学载体（Invitrogen，加利福尼亚州圣地亚哥），对应于人类VEGF-C cDNA的核苷酸1033至1593（义5′-TTCCCTGCCACACACACATA-3′，反义5′-CAATATGGAGGACACACGACA-3′）。使用T7 RNA聚合酶和[DIG]UTP合成地高辛标记的反义mRNA，使用SP6 RNA聚合物和[DIG]UTP（德国曼海姆伯林格）合成义mRNA。现场如前所述，对四种不同病例的5μm厚福尔马林固定石蜡包埋组织样本进行VEGF-C mRNA表达杂交。18
血单个核细胞的分离与刺激
通过Ficoll-Paque密度梯度离心法（瑞典乌普萨拉法玛西亚）从正常健康献血者的肝素化外周血中分离血源性单核细胞。如前所述，使用MACS技术（Miltenyi Biotec GmbH，Bergisch Gladbach，Germany）通过磁性分选分离T细胞和单核细胞。19使用生物素化CD14单克隆抗体VIM13（纯度>95%）富集单核细胞（由奥地利维也纳免疫研究所O Majdic善意提供）。VEGFR-3表面阳性CD14的相对数量+通过细胞分选（FACSCalibur；Becton Dickinson，Mountain View，CA）测定单核细胞，从10开始6CD14号机组+含有1%牛血清白蛋白和10%胎牛血清的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的细胞。用抗人VEGFR-3单克隆抗体进行孵育20在4°C下清洗30分钟，然后在PBS和Alexa 488-共轭山羊抗鼠IgG（Molecular Probes Inc.）中清洗三次。用不相关的第一抗体进行对照。或者，CD14+细胞通过细胞纺丝离心到载玻片上，用相同的抗体标记免疫荧光，以及VEGFR-3的相对分数+/CD14号机组+细胞目测计数。对4名健康人的样本进行分析，并确定VEGFR-3的相对数量+细胞用SE表示为平均值。
对于在体外活化，CD14+单核细胞（1×106/ml）在RPMI 1640（纽约州格兰德岛生命科技公司）中培养，补充2 mmol/L我-谷氨酰胺、10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素，在24孔板（科斯塔，剑桥，马萨诸塞州）中加入脂多糖（LPS）大肠杆菌（1μg/ml）（血清型0127-B8；Sigma Chemie GmbH，Deisenhofen，Germany）、肿瘤坏死因子（TNF）-α（50 U/ml）（由奥地利维也纳Boehringer Ingelheim的GR Adolf博士提供）、重组人VEGF-D（0.3μg/ml。将新鲜分离的单核细胞保持在4°C以避免活化。
定性逆转录酶-聚合酶链反应（RT-PCR）
单核细胞总RNA用TriRegent（俄亥俄州辛辛那提分子研究中心）分离。总RNA（3μg）用于cDNA合成（总体积，20μl），逆转录酶反应混合物（2μl）用于与DNA热循环器（Perkin Elmer Cetus）进行40个周期的PCR反应（94℃下60秒，57℃下60秒钟，72℃下60 s），引物如下：G3PDH sense 5′-TGAAGGTCGGATCAACGGATTGGT-3′，antisense 5′-CATGTGGGCCATGAGGTCCACAC–3；VEGF-C感应5′-GATGTGGGGAAGGA-GTTGGAGTC-3′，VEGF-C-反感应5′-TTGGCTGG-AAGAGTTTTTTTTT-3′；VEGF-D感应5′-CTAGAGAAACGTGTGGAGGTG-3′，VEGF-D-反感应5′-AGTTTTGGGGTGCTGGATTAGATA-3′；VEGFR-3感测5′-CAGACGGGCAGGAGGTGTG-3′，VEGFR-3.反感测5’-CGGCTGACGCGAGTAGC。扩增的PCR产物（G3PDH，452 bp；VEGF-C，567 bp；VEGF-D，525 bp；和VEGFR-3，787 bp）在1%琼脂糖凝胶中电泳并用溴化乙锭染色。
免疫印迹法
如前所述培养U937细胞（CRL-2367；美国型培养物收藏馆，弗吉尼亚州马纳萨斯），在还原十二烷基硫酸钠样品缓冲液中溶解，通过5-15%梯度十二烷基硫酸钠盐-聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳蛋白质，并转移到硝化纤维素膜上（加州里士满BioRad）。切割膜，并用单克隆抗VEGFR-3 IgG、兔抗人VEGF-C和兔抗人血管内皮生长因子-D抗体孵育条带。分离培养的人血管内皮细胞裂解物21被处理并用作对照。如前所述，清洗条带并形成初级抗体的结合。21
统计
如图图例所示，使用了Mann-Whitney检验、Kruskal-Wallis-test、Spearman相关系数和齐方检验。给出的数字为平均值±SE.AP（P）≤0.05的值被认为是显著的。
结果
瘤周基质中LMVD增加与局部淋巴管病癌变相关
Podoplanin和LYVE-1双阳性淋巴微血管仅在瘤周基质内发现，但在非侵袭性和pT1b1期浸润性癌的肿瘤细胞之间未发现（图1、B和G）相反，CD34+在连续切片中，肿瘤细胞片之间也出现毛细血管，但没有干预基质（图1A）双重免疫荧光进一步证实，用足蛋白标记的所有血管也表达LYVE-1（图1；D、E和F）形态计量分析表明，在正常宫颈组织中，淋巴管平均密度（LMVD）为4.3±0.5微血管/高倍视野（HPF），而在LSILs（9.4±2微血管/HPF）、HSILs（11.6±2.2微血管/HRF）和浸润性癌（8.3±1.1微血管/HPF；图2A). 炎症基质反应分级为+（9.4%）、+（43.8%）和+（46.9%）。LVMD与炎症基质反应之间存在显著相关性(P（P）=0.012）（图2B），并且观察到LMVD增加并伴有高度异型增生的趋势（图2A）中位LMVD与淋巴管癌显著相关（淋巴管肿瘤侵袭病例中为11.3±1.6微血管/HPF与6.1±1.4（如果没有）；P（P）=0.014）（图2C）44%的病例观察到肿瘤细胞侵入瘤周淋巴管，并与淋巴结转移有统计学意义(P（P）=0.008）（图2F）VEGF-C在癌细胞中的表达分级为+++（37.5%）、++（25%）和+（37.5%。肿瘤细胞VEGF-C的表达与其他参数（包括LMVD和淋巴结状态）无关(P（P）> 0.05).
淋巴管的识别(A–F)在子宫颈pT1b1期鳞状细胞癌代表性病例的连续连续切片中。答：所有血管都有免疫标记(箭头)抗CD34抗体不区分淋巴和血管内皮细胞。除了几条血管，包括小动脉(箭头)在肿瘤基质内，肿瘤内也标记有两条血管（Tu）。B类：用兔抗足蛋白抗体标记的连续切片，显示六个穿过淋巴管的切片(箭头)，而其他船只(箭头)上一节CD34抗体标记的是足蛋白阴性的血管。抄送：下一个连续切片用标记相同淋巴管的兔抗LYVE 1 IgG免疫染色(箭头)作为前一水平的足蛋白。血管没有标记(箭头).D–F：用小鼠足蛋白抗体（绿色，D类)和兔抗LYVE 1 IgG抗体（红色，E类)揭示了两种标记物在同一淋巴管上的完美重叠（黄色，F类).G–I：瘤周淋巴管的联系(G公司)，CD68阳性TAM(H（H）)和VEGF-C产生细胞(我)子宫颈鳞状上皮癌连续切片。德国：淋巴管（Ly）是浸润性癌（Tu）周围肿瘤周单核浸润内的局部兔抗足蛋白抗体。高：CD68型+TAM位于肿瘤附近并环绕淋巴管（用绿色勾勒；位置根据前一节推断，在本节中显示无红细胞的血管）。我：VEGF-C在肿瘤细胞（Tu）中以颗粒形式表达，也在肿瘤周围炎症细胞中表达(箭头)其中一些与侵袭肿瘤的表面有关(箭头). 原始放大倍数：×350(A–C); ×600 (D–F型); ×420 (G–I型).
淋巴管密度与临床参数的相关性。答：与正常宫颈组织相比，低度鳞状上皮内病变（LSILs）、高度鳞状上皮间病变（HSILs）和鳞状细胞宫颈癌（Ca）的LMVD明显升高，但未达到统计学意义。(P（P）=0.078，克鲁斯卡尔·沃利斯试验）。B类：LMVD与炎性基质反应的分级有显著相关性（1，无；2，中度；3，致密均质炎性浸润）(P（P）=0.012，Kruskal-Wallis试验）。抄送：与没有肿瘤细胞浸润癌周淋巴管的宫颈癌相比，有肿瘤细胞浸润瘤周淋巴管（阳性）的宫颈癌LMVD显著增加（11.39±1.62与6.06 ± 1.36) (P（P）=0.014，Mann-Whitney试验）。医生：VEGF-C表达的瘤周细胞数量与浸润性癌症和LSIL的炎性基质反应等级相关(P（P）=0.043，Kruskal Wallis试验）。电子邮箱：在pT1b1期鳞癌中，VEGF-C阳性基质细胞≤35的LMVD显著低于VEGF-C-阳性细胞>35的鳞癌（6.11±1.53）与10.87 ± 1.45) (P（P）=0.014，Mann-Whitney检验），使用35个VEGF-C阳性基质细胞的中值作为临界值。传真：肿瘤细胞的淋巴管浸润与淋巴结转移高度相关(P（P）=0.008，X平方检验）。
VEGF-C和VEGF-D在肿瘤周围炎性浸润的单核细胞中表达
通过免疫组织化学方法，在瘤周炎性基质的单核细胞亚群中观察到VEGF-C和VEGF-D的表达（图1I和3B） ，在四种情况下就地杂交（图3A），使用数字素标记的反义探针，并使用相应的感测探针作为阴性对照（数据未显示）。通常，这些单核细胞在淋巴微血管附近形成小簇（图1C和3B） 与肿瘤表面紧密接触（图1I和3A） 肿瘤细胞内也检测到相对较少数量的生长因子及其特异性mRNA（图1I和3A） 侵袭性癌中VEGF-C表达细胞的平均数量（39.5±3.7/HPF）与炎症基质反应等级显著相关(P（P）=0.001）（图2D）在癌中最高（39.5±3.7/HPF），然后是HSIL（23.3±5.8/HPF）和LSIL（8.4±3.1/HPF）(P（P）= 0.001). VEGF-C表达的瘤周细胞数量与LMVD中值之间存在显著相关性（图2E）.
VEGF-C表达细胞的定位就地杂交(一)和免疫荧光(B类).答：VEGF-C mRNA的表达通过就地瘤周间质内细胞的杂交浓度最高，其中一些直接位于表面(箭头)浸润性肿瘤扩展（T）。肿瘤细胞也表达少量VEGF-C mRNA(箭头). 这些结果对四个不同的患者具有代表性。对于阴性对照，用感测探针进行杂交，未发现信号（数据未显示）。B类：当VEGF-C和淋巴管通过双重免疫荧光和共焦激光扫描显微镜共同定位时，单个或成簇的VEGF产生细胞（绿色通道）经常与足蛋白标记的淋巴管壁（红色通道）相邻。用碘化丙啶（蓝色通道）进行核复染。原始放大倍数：×600(一); ×2500 (B类).
VEGF-C表达的基质细胞是TAM
VEGF-C表达的瘤周基质细胞的特征就地，使用双免疫荧光和共聚焦显微镜，保持抗VEGF-C抗体标记恒定，并改变其他通道中的抗体（图4）所有VEGF-C产生细胞均表达标记物CD68、CD14、CD23、HLA-DR和CD45（图4），而约50%也产生CD16（图4）VEGF-C表达细胞不能产生CD1a、CD2、CD3、CD8、CD19、CD20、CD34、CD56、CD45-RA、CD123和类胰蛋白酶。所有VEGF-C阳性细胞也同样表达VEGF-D（图4）这些结果表明，VEGF-C阳性细胞是TAM的一个子集，包含瘤周炎性浸润中所有CD68阳性细胞的～25%（图1H）.
将VEGF-C和VEGF-D诱导的瘤周细胞鉴定为TAM。采用双标记共聚焦激光扫描显微镜对宫颈癌石蜡切片进行分析。VEGF-C表达细胞（绿色通道）在左侧列，并且反标记抗体显示在红色通道中。该分析表明，VEGF-C表达细胞也被标记有CD68、HLA-DR、部分CD16、CD23、CD45和VEGF-D特异性抗体。细胞核被碘化丙啶（蓝色通道）复染。原始放大倍数，×2500。
表达VEGF-C的巨噬细胞产生VEGFR-3
双重免疫荧光分析显示，所有瘤周VEGF-C-和VEGF-D-表达细胞也被抗VEGFR-3抗体以颗粒细胞内模式标记（图5）虽然VEGFR-3是一种酪氨酸激酶受体，但不在细胞表面膜上。2未能表达VEGF-C和VEGF-D的基质细胞也始终缺乏VEGFR-3，而且肿瘤细胞也未能表达受体（数据未显示）。
VEGFR-3和VEGF-C在瘤周基质和CD14亲和纯化的循环人单核细胞中的共表达。在瘤周组织中，VEGF-C（绿色通道）和VEGFR-3（红色通道）同时由相同的TAM共同表达，并共同定位于颗粒室中的细胞质内，可能位于内体或溶酶体中。相反，圆形CD14亲和纯化单核细胞在其表面膜和核周隔室（可能是内质网）中表达VEGFR-3，但不表达VEGF-C+通过荧光激活细胞分选法在四个不同的患者中检测到表达VEGFR-3的细胞，平均达到～60%。用外源性VEGF-D和TNF-α诱导培养这些细胞从头开始VEGF-C的合成。当与VEGF-D（1μg/ml，30分钟，37°C）孵育时，它们保持圆形，TNF-α（50 U/ml，30 min，37°C）诱导细胞扁平化和受体-配体的内吞作用，类似于观察到的TAM体内.原始放大倍数，×2500。
诱导VEGF-C合成体外在表达VEGFR-3的单核细胞中
CD14号机组+从四名正常人的血液中亲和纯化单核细胞，用抗VEGFR-3抗体进行免疫标记，并通过荧光激活细胞分选或胞浆制剂的形态计量学进行分析。始终，VEGFR-3的61.4±8.9%的亚组分+在预先纯化的CD14中鉴定出细胞+单核细胞（图5）这些细胞在其表面和核周位置表达VEGFR-3，可能在内质网中表达（图5）然而，他们未能生产出VEGF-C（图5和图6） .用TNF-α、LPS和人重组VEGF-D孵育诱导VEGF-C生成，并将VEGFR-3内化到颗粒细胞内隔间（图5和图6） ，类似于组织中产生VEGF-C的TAM（图5）RT-PCR证实了这些免疫组织化学结果（图6）.
一和B类：RT-PCR检测TNF-α和LPS激活单核细胞产生VEGF-C和VEGF-D mRNA。通过CD14亲和纯化从外周血中分离单核细胞(一)或淘析(B类)以避免激活。这些细胞组成性表达VEGFR-3（787 bp），但不表达VEGF-C（567 bp）和VEGF-D（525 bp）。用TNF-α（50 U/ml）或LPS（50 U/ml，30分钟）培养可快速启动VEGF-C和VEGF-D mRNA的生成。抄送：巨噬细胞相关肿瘤细胞系U937在不受刺激的情况下组成性地产生CD68和CD23，以及VEGF-C和VEGFR-3。
细胞系U937表达完整的VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3
巨噬细胞相关肿瘤细胞系U937组成性表达VEGFR-3，以及VEGF-C和VEGF-D（图7），适用于鉴定各自的蛋白质，但不可能从宫颈癌手术标本中分离出足够数量的表型稳定的TAM。Western blotting显示，U937细胞以各自的活性成熟形式以及典型的加工产物产生受体和两种配体（图7）.
VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3蛋白在分离培养的淋巴管内皮细胞（对照）和人类巨噬细胞相关细胞系U937的裂解液中的表达。在十二烷基硫酸钠缓冲液中溶解组织和细胞，通过十二烷基硫酸酯钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，转移到硝酸纤维素上，并用VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3特异性多克隆抗体进行免疫印迹。在对照组和U937细胞中检测到VEGF-C作为～21-kd蛋白，以及典型的二聚体和降解产物。除低聚物外，VEGF-D在U937细胞中也以～21-kd的带出现。VEGFR-3在U937细胞中以成熟的195-kd形式表达，并作为蛋白质水解处理的125-kd产物。
讨论
肿瘤扩散始于肿瘤细胞通过淋巴管迁移，在区域前哨淋巴结形成转移。这将使肿瘤内和/或瘤周淋巴管以及确保其生存的生长因子VEGF-C和VEGF-D处于中心阶段，20并支持其扩散。22最近，在移植了转基因VEGF-C过表达肿瘤的免疫缺陷小鼠中实现了淋巴结转移的快速发展，并形成了巨大的肿瘤周围淋巴管，这些实验突显了它们的重要性。6,7,9,10然而，在实验动物身上获得的结果受到以下事实的限制：它们的肿瘤血管系统可能与人类的不同，这是不可预测的，例如VEGF-D对小鼠血液和淋巴管内皮细胞的双重特异性，而对人类淋巴管的限制就证明了这一点。24
为了深入了解自然人类肿瘤（瘤周）淋巴管生成的机制，并为功能研究提供基础，需要对组织病理学定义明确、优先为无坏死的早期肿瘤和其他复杂继发性变化进行描述性分析。子宫颈鳞状上皮癌因其独特的解剖结构简单而具有优势。它们起源于分层的非角化鳞状上皮，该上皮位于富含胶原蛋白的基质上，只有很少等距的血管和淋巴管，以及稀疏的炎性细胞。肿瘤通过组织病理学精确定义的侵袭前上皮内低级别（LSIL）和高级别（HSIL）鳞状上皮内病变前体向基质浸润癌发展。所有阶段的肿瘤都以混合炎性基质浸润为界。在本研究中，我们选择了32例局限于宫颈且直径不超过4cm的早期宫颈鳞癌患者（pT1b1期，UICC），并进行了完整的临床随访。
随着淋巴管内皮特异性标记物的发现，淋巴管的定位、淋巴管内皮细胞的分离以及其功能的揭示直到最近才成为可能。目前的清单包括具有广泛不同功能的分子，例如VEGF-C和VEGF-D特异性酪氨酸激酶受体VEGFR-3，2-4CD44相关的透明质酸受体LYVE-1，12转录因子Prox-1，25膜粘蛋白足蛋白，11有助于细胞粘附（D.Kerjaschki，手稿编制中）。尽管所有这些分子都是组织切片中淋巴管定位的有用工具，但它们也有缺点；26例如VEGRF-3特异性抗体也免疫标记肿瘤附近的微血管，5,10LYVE-1在肝窦细胞中表达，27只有在分离培养的淋巴管内皮细胞亚群中，20Prox-1也存在于非内皮细胞的细胞核中，26,28足蛋白位于可能来自血管的肿瘤内皮细胞中，如高级别血管肉瘤和卡波西肉瘤，11在非血管细胞中，如肾小球足细胞，11,29和肌成纤维细胞（D.Kerjaschki，未发表的观察结果）。因此，有人适当地建议，使用手边的标记物组合可以弥补其个体缺陷，并可能产生更可靠的免疫组织化学结果。26本研究中使用足蛋白作为淋巴管内皮标记是有保证的，因为它以前1）被排除在表达特异性标记物PAL-E的皮肤血管之外；302） 在大多数但不是所有VEGFR-3中共同表达+血管；3） 与Rip-TAG小鼠VEGF-C过度表达胰腺β细胞癌中瘤周淋巴囊泡的LYVE-1标记一致（D Kerjaschki和G Christofri G，未发表的观察结果）；和4）在本研究中与LYVE-1共存。因此，在本研究中结合使用足蛋白和LYVE-1验证了双阳性血管被视为淋巴管的结论。
所有检查的宫颈鳞癌均无淋巴管，且淋巴管集中在瘤周基质内，而CD34+肿瘤内也有微血管。这些结果与之前在其他几种人类肿瘤中的发现类似，例如黑色素瘤，9结直肠癌和肝癌，27和其他。15, 31然而，它们与头颈部鳞状细胞癌的最新发现形成对比，在头颈部的鳞状细胞瘤中，通过LYVE-1标记观察到瘤内淋巴管。32这种差异不能简单地用不同的免疫组织化学标记物来解释，因为本研究中也使用了LYVE-1。据推测，不同解剖来源的鳞状细胞癌的淋巴管生成特性也不同，这也可能受到器官和区域特异性的、尚未确定的因素的影响。26
了解肿瘤内部和周围淋巴管的密度是否因淋巴管生成而增加，并支持肿瘤细胞扩散，对于未来潜在的抗转移治疗至关重要。迄今为止，仅对头颈部鳞状上皮细胞癌采用增殖标记物Ki67进行免疫染色，提供了新血管生成的直接证据。32在本研究中检查的宫颈鳞癌中，无论是上皮内非侵袭性肿瘤还是侵袭性肿瘤，瘤周淋巴管的局部密度均显著高于正常组织。由于非侵袭性上皮内肿瘤不会压迫下层基质，这间接证明了肿瘤周围淋巴管密度的局部增加是由于新生血管生成，而不是由于肿瘤的推动而使原有血管被动聚集，在皮内接种的实验性大鼠肉瘤中发现。10
在我们的一系列宫颈癌中，淋巴管密度与瘤周慢性炎症直接相关。17瘤周淋巴管密度的增加与包含癌细胞的淋巴管数量（癌性淋巴管炎）之间的统计关联建立了与临床相关性的联系，这与淋巴结转移的发生相关。14癌性淋巴管炎和淋巴结转移是早期宫颈癌的既定预后因素，表明预后不良。31
先前发现不同器官的人类肿瘤表达VEGF-C，这与患者的淋巴结状态和最终临床结局有关。32-36这些研究主要使用组织样本的RT-PCR，这不适合区分肿瘤和/或基质细胞产生VEGF-C的部位。有趣的是，免疫组化研究显示淋巴微血管主要位于瘤周基质内。9,14,15,17,23,27,31这就提出了一个问题，即肿瘤内淋巴管是根本不存在，还是实际上是由肿瘤细胞的VEGF-C诱导的，但目前可用的探针没有检测到，例如，因为这些淋巴标志蛋白在肿瘤内可能下调，但在肿瘤周围不会下调。或者，肿瘤细胞可以产生抗淋巴管生成因子或将VEGF-C蛋白降解为与VEGFR-3和VEGFR-2相互作用的片段，从而促进血管新生。9,37最终，VEGF-C和VEGF-D可能由瘤周基质中尚未识别的细胞产生和释放，并解释了淋巴管瘤周增殖的原因。在本研究中，我们通过针对不同表位的特异性抗体和就地杂交。与之前的研究类似，我们发现VEGF-C在高级别非侵袭性癌和侵袭性癌的肿瘤细胞中表达，然而，这与任何与瘤周淋巴管生成相关的参数在统计学上都没有相关性。VEGF-C和VEGF-D蛋白和mRNA的标记集中在肿瘤周围炎性浸润的单核细胞中。这些细胞已被鉴定就地根据CD68、CD14、CD23、HLA-DR和CD45的表达，作为激活的TAM的一个子集，但不包括浆细胞树突状细胞。38他们也不能产生CD1a、CD2、CD3、CD8、CD19、CD20、CD34、CD56、CD45-RA和类胰蛋白酶，因此排除了内皮细胞、产生VEGF-C的血小板、，39嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和树突状细胞。所有产生VEGF-C的TAM共同表达VEGF-D，表明这两种生长因子是并行合成的。约25%的CD68阳性TAM表达VEGF-C，其数量与瘤周炎症和淋巴微血管密度显著相关，而这又与癌周淋巴管炎有关。
所有产生VEGF-C和VEGF-D的TAM也共同表达相应的酪氨酸激酶受体VEGFR-3，而生长因子阴性的TAM始终也没有该受体。最近在植入免疫缺陷小鼠体内的人类黑色素瘤中也观察到表达VEGFR-3的TAM，有证据表明VEGF-C可以作为化学引诱剂在体外对于小鼠腹腔巨噬细胞，9然而，它们作为VEGF-C和VEGF-D来源的作用没有得到重视。同一细胞共同表达VEGF-C、VEGF-D及其受体为自分泌调节系统提供了元素，最近也假设人类淋巴管瘤的内皮细胞也是如此。40综上所述，这些结果证明了TAM的一个亚类作为瘤周基质中VEGF-C和VEGF-D的主要产生者的新作用，以及作为瘤周淋巴新生血管形成的潜在原因。
由于TAM来源于循环单核细胞，我们寻找在其表面表达VEGFR-3的单核细胞亚群，并可作为表达VEGFR3、VEGF-C-和VEGF-D的TAM群的前体。通过直接形态计量学和荧光激活细胞分选，发现正常人外周血中61.4±8.9%的CD14纯化单核细胞在其细胞膜和核周内质网中表达VEGFR-3。然而，无论是通过免疫荧光还是RT-PCR，他们都未能产生VEGF-C。仅在孵化后在体外用TNF-α、LPS和重组人VEGF-D。开始产生VEGF-C并将VEGFR-3内化到颗粒细胞间室，类似于TAM就地这些结果表明，一种新的表达VEGFR-3的单核细胞亚类不合成VEGF-C或VEGF-D，除非通过不同的受体-结合系统激活，包括通过外源性VEGF-D-激活的VEGFR-3。因此，在CD14纯化单核细胞中诱导在体外与VEGF-C和VEGF-D产生的TAM相似的表型就地. The就地TAM靠近肿瘤表面的位置可以提供包括TNF-α在内的各种激活因子的环境，从而在新移植的单核细胞中诱导VEGF-C和VEGF-D的合成。此前，还发现LPS可以促进人单核细胞/巨噬细胞中VEGF的表达。41
VEGF-C和VEGF-D以及VEGFR-3受到选择性剪接和翻译后修饰的影响，这也可能显著改变其生物活性，9这就提出了一个问题，TAM生产和释放哪种类型的VEGF-C和VEGF-D。由于表型稳定的TAMs无法从可用的宫颈癌手术标本中大量纯化，我们已经检测了巨噬细胞相关肿瘤细胞系U937作为TAMs的替代品。42这些细胞生成的VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3数量足以通过Western blotting进行分析，显示生长因子及其受体在各自的活性成熟形式和典型加工形式中的表达。这表明VEGF-C和VEGF-D以及VEGFR-3的生物活性形式至少在该替代TAM细胞系中产生。
总之，这项研究的结果为瘤周淋巴新生血管的假说提供了证据，该假说将作用分配给表达VEGFR-3的单核细胞的一个新亚组分。我们假设这些细胞被化学吸引到肿瘤，并暴露于肿瘤周围基质中的激活物，如TNF-α。在这里，它们被转换为TAM，并打开从头开始合成VEGF-C和VEGF-D，通过为抗原呈递细胞提供通向次级淋巴器官的管道，导致淋巴微血管增殖以启动抗肿瘤免疫反应。CD14+单核细胞衍生的VEGFR-3阳性树突状细胞的潜在作用43尚待确定。然而，肿瘤细胞可能使用相同的途径传播和形成淋巴结转移。由于对其他几种人类癌症的初步研究揭示了类似的情况（我们未发表的观察结果），VEGF-C和VEGF-D产生的TAM与肿瘤淋巴扩散之间的联系可能具有更广泛的意义。
