肝细胞类器官培养中的组织学组织

摘要

本实验室和其他实验室的最新研究1,2已经证明，肝细胞在单层培养条件下持续增殖可以形成由肝细胞和间充质细胞组成的复杂结构，后者可能来源于分离过程中的星状细胞污染物。三在随后的研究中，我们还证明，在聚苯乙烯珠上的滚筒瓶中的相同培养物可以形成组织学组织元素，包括肝细胞和开窗内皮。4然而，没有发现有组织的胆道上皮是这些培养物的组成部分。在这个系统中，我们去除了聚苯乙烯珠等任何支撑结构，并在表面有褶皱的胶原蛋白涂层滚筒瓶中检测了从大鼠肝脏胶原酶灌注中分离的细胞的行为，目的是增强细胞的附着。在我们目前的研究中，我们证明，在缺乏人工三维底物的情况下，肝细胞和受污染的间充质细胞和上皮细胞会经历一系列复杂的变化，并从单层演变为组织结构。最后的组织覆盖在滚筒瓶的表面，由所有肝细胞成分组成，包括内皮细胞的基底层、肝细胞的中间层以及带有结缔组织的星状细胞，以及胆道上皮的表层。这些发现表明，与肝组织学组织相似的结构化组织结构可以由完全分离的肝细胞成分形成。

胆管上皮、肝细胞和星状细胞的独特存在允许使用这些培养物来鉴定和研究这些组织学元素表型成熟所必需的因素。地塞米松（非代谢性皮质类固醇）、表皮生长因子（EGF）和肝细胞生长因子（HGF）等物质在基因缺失的小鼠遗传模型中难以研究。HGF或其受体c-met的纯合缺失会导致胚胎死亡。肝脏被描述为比正常肝细胞小，肝细胞不成熟。目前还没有提供组织学异常的其他细节，尚不清楚肝脏异常是否继发于胚胎中观察到的胎盘缺陷。5-7EGF受体或其多配体的纯合缺失对肝脏发育没有影响，可能是因为与同一家族的其他受体功能重叠。8、9考虑到在啮齿类动物胚胎中进行肾上腺切除术的困难以及在胚胎发育中合成皮质类固醇的位点的多样性，通过体内组织消融或基因模型实际上是不可能的。这同样适用于其他细胞因子和激素，如胰岛素、三碘甲状腺原氨酸等。本文中描述的模型产生了上述标准的、可重复的和定型的组织学。虽然该组织学与典型的肝脏组织学不同，但体外结构以及清除或添加特定成分后容易观察到的细胞表型和组织学缺陷为研究不同分子在肝组织形成中的作用提供了另一个机会。这些研究的结果及其对肝脏生物学的影响如下。

材料和方法

Northern印迹法分析基因表达

从培养物中提取总RNA和mRNA

使用RNAzol B（德克萨斯州休斯顿市BioTECX）提取总RNA。将1体积的刮伤组织与3体积的RNAzol混合，从滚瓶培养物中提取RNA。根据制造商的指南纯化RNA。用常规分光光度法测定RNA的浓度和纯度。在变性1%琼脂糖凝胶上完成每个泳道20μg RNA的尺寸分离，并通过毛细管法转移到尼龙膜（Amersham，Piscataway，NJ）上。在紫外光下交联后，将膜与特定互补DNA杂交过夜（如图8所示▶)标有[³²P] dCTP使用Amersham随机引物试剂盒。随后在高强度条件下清洗膜，并将其暴露于R胶片（照相胶片）（伊斯曼-柯达，纽约州罗切斯特）中1至3天。用激光密度计对RNA杂交带进行定量。

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图8。

白蛋白、TGF-β1和IV型胶原在培养物中不同时间的表达，在HGF和/或EGF存在下维持。对照培养物既没有添加HGF也没有添加EGF。胶原酶灌注结束时分离的肝细胞颗粒以及整个正常大鼠肝组织（NRL）也进行了检查以进行比较。用Northern凝胶对提取的RNA进行分析。上部GAPDH用作白蛋白和TGF-β1的标准化对照，而下部GAPDH用于IV型胶原数据的标准化，因为相应的RNA在两个单独的凝胶上运行。与HGF相比，EGF在第8天对TGF-β1和IV型胶原的诱导作用更强。

结果

文化条件与基础组织学

如前所述，在接种细胞之前，折叠滚筒瓶的表面涂有I型胶原蛋白。11培养基HGM补充HGF和EGF，除非特定实验另有说明。接种的细胞在～24小时内附着在培养瓶表面。在培养的前5天，大约50%的肝细胞发生凋亡。随着结缔组织的形成，凋亡细胞逐渐从混合物中消失。在培养的第18至20天，细胞元素的组织获得了其典型的结构。滚轴瓶的表面覆盖着灰棕色的薄纸，在内表面的凹槽中更为突出。在培养30天时，可以从滚筒瓶中回收大约2到4克组织。从滚筒瓶表面刮下薄片组织，造粒，并根据需要进行组织学和生物化学评估。观察到的组织学是标准的，并且具有高度的重复性。图1A▶是从滚筒瓶上刮下的许多组织带的组织学外观的低功率（×20）视图。图1B显示了更高的功率视图（×200）▶每个色带由相同的标准组织学组成。面对培养基的表面有一层连续的立方形胆道上皮。胆道层下方有5至10个细胞层，由嵌入结缔组织元素的肝细胞组成。肝细胞与胆道层之间有不同数量的结缔组织分隔，从完全缺失到将两种细胞类型隔开的厚层（如图1、a和B所示▶). 肝细胞具有可变的核和核仁结构，表明其具有不同程度的倍性。内皮细胞层附着在基质上，位于肝细胞和结缔组织下方。当将来自胶原酶灌注的肝细胞部分置于培养物中时，可以看到这种典型的形态。当在类似条件下将非实质细胞颗粒（包含内皮细胞、星状细胞和偶尔的小肝细胞）放入培养物中时，未观察到生长（数据未显示）。

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图1。

第20天的类器官培养组织切片。培养物保存在含有HGF和EGF的HGM培养基中。答：从滚筒瓶内部刮下的纸带部分的H&E染色。原始放大倍数，×20。B类：彩带的组织结构如所示A类表面被立方形胆道上皮覆盖。胆道上皮下有一层结缔组织，其间散布着肝细胞巢。内皮细胞位于色带的底面，附着在基质的塑料上。原始放大倍数，×200。

通过电子显微镜，可以很容易地确定存在的细胞元素的所有典型特征。图2A▶显示双核肝细胞。细胞质组织的细节，包括线粒体、粗面内质网、胆管、紧密连接等，如图2B所示▶.图3▶显示了有机物培养物中其他细胞元素的细胞超微结构。胆道上皮（图3A）▶显示典型的脑细胞核和表面微绒毛。表面上皮下有密集的胶原纤维网。图3B中显示了具有小脂滴的星形细胞嵌入结缔组织基质中▶基底层的内皮细胞也显示出细胞类型的典型亚细胞结构（图3C）▶。我们没有检测到有窗内皮的存在。偶尔也可见巨噬细胞。

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图2。

植入培养物组织中的肝细胞的电子显微镜。左侧：双核肝细胞包埋在类器官内，包含由胶原基质（Col）包围的空泡内含物（V）。注意圆形细胞核（N）表示分化的肝细胞。正确的：分化肝细胞之间细胞间接触区域的放大倍数更高。具有管腔微绒毛的胆管（BC）由桥粒（D）和紧密连接（TJ）界定。肝细胞内富含糖原（Gly）、线粒体（Mt）和粗面内质网（RER）。

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图3。

从30天培养物中分离出的有机物被固定并处理以进行透射电子显微镜检查组织的超微结构特征。答：存在于类器官表面的胆道上皮（BE）具有典型的立方上皮单层结构，并在细胞-细胞接触处表达紧密连接和桥粒(箭头)以及高度交叉的侧膜结构域。单层在其基底外侧结构域产生基底膜（BM）细胞外基质。B类：含有脂滴的星状细胞（SC）(箭头)嵌入胶原基质中。抄送：内皮细胞（EC）层的超微结构，位于含有高度铰接上皮细胞的类器官表面。EC下方的胶原基质中可见一个星形细胞，其细胞质中含有两个脂滴（L）。比例尺：1μm(A类和C类)，2微米(B类).

组织化学

结果如图4所示▶。如预期的那样，表浅胆道上皮细胞的细胞角蛋白19呈阳性，低倍镜下呈线性棕色染色（图4A）▶结蛋白通常存在于肌成纤维细胞和星状细胞中，见于嵌入结缔组织基质的间充质细胞中，并与胶原束的存在有关（图4B）▶.HEPPAR抗体12以及细胞色素P-450 IIB1抗体染色的肝细胞阳性，偶尔胆道上皮细胞也染色标记物阳性（图4，C和E▶，相应地）。基底表面的内皮细胞对因子VIII呈阳性反应（图4D）▶.小管菌Mg染色阳性⁺⁺ATP酶13（图4F▶，参见箭头）。

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图4。

所有切片均取自20天龄的培养物，保存在含有地塞米松、HGF和EGF的完整培养基中。答：冰冻切片细胞角蛋白19的免疫组织化学染色。浅表胆管上皮层染色阳性（线性棕色区域）。B类：结蛋白免疫组织化学显示，结蛋白阳性细胞伴随胶原纤维散布在肝细胞之间。抄送：肝细胞特异性HEPPAR抗体免疫组化染色。肝细胞呈阳性（棕色）。偶尔胆道上皮细胞也呈阳性。医生：凝血因子VIII免疫组织化学染色显示，色带基底表面有内皮细胞。H、 肝细胞；B、 胆道上皮。电子邮箱：细胞色素P-450 IIB1的免疫组织化学。大肝细胞呈阳性（棕色）。传真：镁的组织化学染色⁺⁺ATP酶。13冻结部分。含有该酶的阳性小管被视为细棕色线条。

细胞动力学

在存在HGF和EGF的情况下，大多数细胞（每种类型>70%）PCNA染色阳性（图5A）▶这表明培养物中的大多数细胞都处于细胞周期中。抗原Ki-67通常在S期的细胞中表达。培养物中Ki-67染色阳性的肝细胞不到5%，而>60%的胆管上皮细胞染色阳性（图5B）▶在地塞米松不存在的所有系统中，均观察到较高（>80%）的PCNA标记和较高的Ki-67标记（见下文）。

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图5。

答：有机色带的PCNA染色（20天龄培养物）。80%以上的表面胆道上皮、结缔组织细胞和肝细胞有阳性细胞核，表明这些细胞处于细胞周期中。B类：Ki-67的免疫组织化学染色，用于识别积极合成DNA的细胞（S期）。<5%的肝细胞中可见阳性细胞核（暗区），而>60%的胆道上皮细胞对该核蛋白染色呈阳性。原始放大倍数，×200。

生长因子和激素对组织组织的影响

这些研究的结果如图6所示▶（H&E污渍）和图7▶（细胞角蛋白19染色，作为胆道上皮的标记物）。在含有地塞米松、HGF和EGF的培养物中观察到上述典型组织学（图6A和7A）▶ ▶（请注意图1B和6A▶ ▶相同，以便于比较）。然而，选择性清除这些成分对培养物的组织学有很大影响。

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图6。

第25天，类有机物培养物的H&E染色在不同的生长条件下保持不变。侧面显示了地塞米松（Dex）和HGF+EGF的补充。典型形态如所示A类，有Dex、HGF和EGF（请注意：使用的照片与图1B相同▶). 在B类[-des-Dex，plus（HGF+EGF）]，存在具有原始特征的上皮样细胞，很少有细胞可区分为肝细胞。不到15%的细胞对HEPPAR或细胞色素P-450 IIB1呈阳性（数据未显示）。在C类[加上Dex，减（HGF+EGF）]，肝细胞仍然较小，HEPPAR阴性，有几个凋亡小体，没有表面胆道上皮，也没有结缔组织。在D类[负Dex，负（HGF+EGF）]无表面胆道上皮，肝细胞较小或具有卵圆细胞特征。照片中央有两个核分裂(箭头). 原始放大倍数，×200。

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图7。

如图6所示，器官样培养物在第25天的细胞角蛋白19染色保持在类似的生长条件下▶.英寸A类细胞角蛋白19在类器官培养的胆道上皮上染色，出现Dex、HGF和EGF。在B类[减去Dex，加上（HGF+EGF）]，表面上皮细胞角蛋白19染色阳性。一个微弱的污点C类[加Dex，减（HGF+EGF）]反映凋亡细胞对二级抗体的摄取。中的注释D类[负Dex，负（HGF+EGF）]，缺乏细胞角蛋白19阳性的胆道上皮。原始放大倍数，×200。

去除EGF和HGF，存在地塞米松（图6C和7C）▶ ▶

在第20天的培养中，这两种生长因子的联合去除导致胆管上皮的消除。肝细胞是可识别的，但很小，并且对HEPPAR和细胞色素P-450 IIB1抗原保持阴性（数据未显示）。培养物的组织学中嵌入了许多凋亡的肝细胞。未发现结缔组织发育。

地塞米松的去除，HGF和EGF的存在

肝细胞表型成熟出现全面停滞。这些细胞类似于大鼠肝脏中的卵圆细胞体内一些未成熟肝细胞（<15%）HEPPAR和细胞色素P-450 IIB1阳性。虽然细胞角蛋白19仅强烈标记表面上皮（图7B）▶在H&E染色中，表面胆道上皮和下面的肝细胞之间没有明确的界限（图6B）▶.没有镁可以证明的泪小管结构⁺⁺ATP酶或电子显微镜（数据未显示）。存在结缔组织。Ki-67标记指数为～10%。

地塞米松、HGF和EGF的去除

表面胆管上皮缺失（图7D）▶肝细胞（图6D）▶看起来不成熟，与图6B所示类似▶一些未成熟肝细胞（<35%）HEPPAR和细胞色素P-450 IIB1阳性。令人惊讶的是，在这些培养物中发现了一些有丝分裂和高PCNA（>90%）和Ki-67（～25%）肝细胞标记指数。存在结缔组织。

综合结果表明，地塞米松是形成完全成熟、组织学上可识别的肝细胞所必需的，与胆道层不同。当存在HGF和EGF时，通过简单的组织学分析更明显（比较图6、A和B▶). 当单独添加地塞米松时，它会抑制细胞增殖，并与较小的萎缩肝细胞相关。因此，尽管地塞米松是肝细胞分化的调节剂，但其作用因HGF、EGF和培养基的其他成分而异。HGF和EGF是胆道上皮的外观、维持或生长所必需的。单独添加HGF或EGF可以恢复胆道上皮的形成，但当两种生长因子同时存在时，并不能完全恢复。结缔组织的形成也依赖于HGF和EGF的存在。其机制尚不清楚。如上所述，当将从大鼠肝脏胶原酶灌注液中分离出来的非实质部分置于无肝细胞的培养物中，并充分补充HGF培养基和地塞米松、HGF或EGF时，未发现结缔组织元素生长或任何组织形成。在这些培养物中，EGF或HGF单独恢复了一些结缔组织的形成。EGF在恢复结缔组织形成方面似乎更有效。组织学结果与基因表达分析结果相一致。图8▶显示在无生长因子（对照）、仅EGF、仅HGF和EGF加HGF的培养物中IV型胶原的表达。在含有EGF（单独或与HGF联合）的培养物中，IV型胶原基因的表达最强。在培养的第8天和第23天，HGF单独增加了IV型胶原的表达，高于对照值，但程度低于EGF。然而，这两种生长因子在诱导TGF-β表达方面同样有效。相反，白蛋白表达与生长因子没有明显差异。

讨论

这项工作的发现提供了关于特定信号在肝组织学形成中的作用的信息，并指出了肝组织和其他复杂组织可能在培养中的某个时刻组装的方式。产生成熟组织的组织学模式是在胚胎发生过程中产生的。门静脉三联征和相邻肝细胞排列成由窦状窦排列的板是肝组织学的特征。三联体包含血管内皮细胞和胆道上皮细胞，它们被组织成完整的血管和导管结构。在这些培养物中形成的组织最类似于线性化的门静脉三联体结构，其中的结构不是圆形导管和血管，而是扁平化的。这可能是因为组织必须生长的平坦基底的几何形状所产生的影响。然而，值得一提的是，还发现了圆形导管，通常形状不规则，尽管尚不清楚这些结构是否代表了表面上皮的内陷。

在这些培养物中胆道上皮的起源很有趣。如上所述，其他研究人员的研究表明，通过两步胶原酶灌注从肝脏灌注中分离出的肝细胞组分的原始细胞接种物含有极少量（<0.05%）的胆道上皮细胞。10我们对直接来自胶原酶灌注的细胞分离物涂片进行了细胞角蛋白19染色，细胞角蛋白19-阳性细胞的数量与前面描述的相同（数据未显示）。在缺乏EGF和HGF的培养物中，未发现胆道上皮。这两种生长因子中的每一种单独添加都会诱导胆道上皮的出现，当两者结合时，这种程度要小得多。这并不意味着这两种生长因子是胆道上皮发育的唯一调节分子。Auth及其同事的最新研究14提示来自肝细胞的其他因素也可能参与。在这些培养物中，胆道上皮的细胞来源尚不清楚。存在两种可能性：1）胆道上皮来源于细胞分离时污染的胆道上皮细胞。尽管原始细胞分离物中存在极少数的胆道上皮细胞，但这些细胞可能是我们在培养物中看到的胆道内皮细胞的前体。在最初的细胞分离中，公布的最大胆道上皮细胞数为0.05%，接种250000000个肝细胞可能包括多达125000个胆道上皮上皮细胞。鉴于培养的前5至10天肝细胞丢失，如果胆道上皮细胞在相同条件下具有选择性存活优势，则胆道细胞的百分比可能会上升。2） 胆汁上皮来源于经历去分化和再分化的肝细胞。早期培养物的组织学分析没有显示胆道上皮的存在。它出现在6到8天的培养物中。胆道上皮的外观与细胞角蛋白19的表达平行。第6天之前培养物表面的细胞看起来像未成熟的小肝细胞前体，与组织内的其他细胞无法区分。细胞角蛋白19阳性的表面胆道上皮细胞在这些培养物中的出现最好地解释为当时恰好位于组织表面的未成熟肝细胞的再分化。在这些培养物中，胆道上皮可能来源于未分化的肝细胞，这种可能性只能通过选择性来确定体内胶原酶灌注前标记肝细胞。我们尝试使用含有β-半乳糖苷酶的腺病毒构建物进行这种标记（数据未显示）。然而，我们发现胆道细胞也被腺病毒标记（数据未显示）。需要对肝细胞进行进一步的选择性标记研究，以最终检验这种可能性。

令人感兴趣的是胆管上皮细胞和肝细胞之间增殖率的差异。PCNA染色细胞核的百分比非常高，这两种细胞类型具有可比性，表明这两种类型的细胞在细胞周期中的百分比相同。然而，Ki-67（周期S期指标）阳性细胞核的百分比在胆道上皮中要大得多（60%）对肝细胞（5%）。这表明肝细胞大量进入细胞周期，但在G₁，然后进入S阶段。目前，这种情况的机制或影响尚不清楚。

在培养物中看到的间充质细胞（星状细胞、内皮细胞等）可能来源于胶原酶灌注后肝细胞颗粒中存在的少量细胞污染物。导致内皮细胞定位到结构的基底部分的机制尚不清楚。还可以看到由这些内皮细胞排列的完整圆形间隙和类似的血管间隙。目前尚不清楚为什么这些结构如此之少，以及它们是否是由内皮细胞从组织底部迁移形成的。星状细胞已被证明是早期原代肝细胞培养中可见的成纤维细胞的起源细胞。三我们的研究还表明，间充质基质细胞的扩增明显依赖于肝细胞提供的未知功能的存在。当从胶原酶灌注液中分离出的非实质性细胞颗粒在类似条件下（HGM培养基中含有HGF和EGF，在滚筒瓶中）培养时，但在没有肝细胞的情况下，没有观察到生长。肝部分切除术后肝再生过程中，肝细胞合成成纤维细胞生长因子-1、血管内皮生长因子和转化生长因子-α。15在无肝细胞的非实质细胞培养中联合添加这些生长因子也不会导致结缔组织生长（数据未显示）。在培养物中，肝细胞和构成结缔组织的非实质间充质元素之间的相互刺激的性质尚不清楚，似乎涉及尚未确定的刺激。无论所涉及因素的性质如何，数据都强调，成熟肝细胞是培养中构建肝组织所需的关键基本细胞元素。我们的发现也证明了EGF（或EGF受体配体）在肝脏组织学形成中的重要作用。EGF比HGF更能诱导胆道上皮的出现和结缔组织的形成。

除了作为构建组织结构的模型的价值外，所述系统还允许体外胚胎学方法研究不同生长因子对肝组织组织的影响。显然，任何推断都来自体外到体内有先天的局限性。另一方面，可以使用该系统进行一些研究，这是不可能在整个动物（成年或胚胎）中进行的。尽管小鼠特定基因的纯合子缺失仍然是探索特定信号作用的一个非常有价值的工具，但在导致胚胎死亡的条件下（例如HGF及其受体的缺失），它们的用处往往有限5-7,16). 基因敲除小鼠在确定皮质类固醇和三碘甲状腺原氨酸等小激素的作用方面也没有多大帮助。参与这些激素生物合成的基因的特定消除（如人类可能自发发生的内分泌综合征）通常会导致前体代谢物从酶块上游积聚，从而使结果的解释复杂化。同样困难的是联合消除生长因子组（例如HGF和EGF）。本研究中的系统可用于提供此类信息。以往的研究表明，HGF和EGF是胆道上皮细胞的有丝分裂原。然而，我们的研究结果表明，这些生长因子对胆管上皮细胞的外观和表型的诱导至关重要。虽然皮质类固醇的作用更为复杂，但似乎它们对肝细胞的完全表型成熟至关重要。还应注意的是，地塞米松虽然对整个组织学的发展至关重要，但对上皮细胞的增殖有总体负面影响。如上所述，肝细胞似乎对结缔组织基质元素的正常生长至关重要，因为单独培养非基质部分时未观察到组织生长。EGF似乎是这个过程中比HGF更关键的因素，如诱导IV型胶原基因表达所示（图8）▶目前尚不清楚HGF和EGF的作用是直接的还是通过TGF-β1介导的，也不清楚哪些细胞成分（上皮细胞或间充质细胞）是TGF-α1产生的来源。

在省略地塞米松、生长因子和表皮生长因子的培养物中，有丝分裂刺激的性质尚不清楚。类似肝细胞前体的细胞大量生长（图5D和6D）▶ ▶有几个容易识别的有丝分裂。虽然大多数细胞无法识别为成熟肝细胞，但其中几组细胞的HEPPAR抗原呈阳性。培养物中的间充质细胞可能产生HGF，已知增殖的肝细胞会产生TGF-α。17然而，如果是这样，所产生的生长因子水平不足以诱导胆道上皮的出现。胰岛素和/或二铁饱和转铁蛋白（HGM培养基的标准添加剂）也可能在这一过程中发挥作用。18、19

需要更多的研究来充分分析本研究结果的含义。然而，该模型唯一适用于体外胚胎学研究中，针对基质和生长因子特定成分的选择性阻断剂（反义RNA、抗体）可能会产生对肝组织组织重要的机制和途径的独特信息。

致谢

脚注

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