《美国病理学杂志》。2001年11月；159(5): 1785–1795.
CAG重复性疾病中神经元核内包涵体与早幼粒细胞白血病蛋白核和卷曲体的相互作用
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下田隆志（Takayoshi Shimohata）
日本新泻大学大脑研究所
Hitoshi Takahashi先生
和神经病学，†
来自病理科*
和神经病学，†
日本新泻新泻大学大脑研究所
摘要
神经核内包涵体（NII）是CAG重复性疾病的病理特征。为了阐明NII的形成对核内亚结构的影响，我们研究了NII与齿状红核-千里光核萎缩和Machado-Joseph病患者脑内核体的关系。在这两种疾病中，早幼粒细胞白血病蛋白是早幼粒细胞核蛋白的主要成分，它改变了正常分布，并在NII周围重新排列，形成一个单囊结构。我们进一步证明NII与卷曲体紧密接触，卷曲体是一个高度动态的结构域，可能参与小核核糖核蛋白的生物生成。核内聚谷氨酰胺聚集体与卷曲体的优先关联也在齿状红细胞-扁桃体萎缩转基因小鼠大脑和表达突变型阿托品-1的培养细胞中得到证实。结果提示NII与核体的相互作用可能在CAG重复性疾病的发病机制中发挥作用。
已有研究表明，编码聚谷氨酰胺（polyQ）束的CAG重复序列的扩增是至少八种神经退行性疾病的诱因突变，包括亨廷顿病、齿状红细胞-经颅多普勒萎缩（DRPLA）和马查多约瑟夫病（MJD）。1最近，除脊髓小脑共济失调6型外，在CAG重复性疾病中发现了神经元核内内含物（NII）的发生，2-8在转基因动物模型中。9-14由于NII含有致病基因产物的抗原性和扩展的polyQ延伸，人们认为这些内含物是polyQ疾病的共同特征，1可能与疾病的发病机制密切相关。使用体外瞬时表达系统表明，含有扩展polyQ延伸的截短蛋白的表达导致聚集体的形成并导致细胞凋亡。5,7,8,15,16NII形成本身可能是一种细胞反应，以减少突变蛋白的毒性作用；17-19然而体外学习20以及我们最近的体外和体内研究21,22显示了转录因子的招募，如TAF二130（TATA-binding protein associated factor）、CREB（cAMP-responsive element-binding蛋白）和CBP（CREB-binding rotein）形成polyQ的核内聚集，表明NII的形成可能间接诱导转录异常，从而导致细胞死亡。
CAG重复性疾病发病机制的另一个关注点是NII的形成对核内结构的影响。最近体外研究表明，突变体ataxin-1诱导的大的核内聚集物隔离了早幼粒细胞白血病蛋白（PML）核体并改变其正常核分布。8突变体ataxin-3在培养细胞中的表达也表明了核内聚集物和PML核小体的共同定位。23PML是一种核基质相关蛋白，也是PML核体的组成部分。24,25典型的哺乳动物细胞核有10到20个PML核体，大小从0.3到1μm不等，被认为参与生长调节、转录调节和凋亡。24-26因此，基于培养的实验表明，在CAG重复性疾病中，内含物的形成可能导致核内组织的改变，从而导致核功能障碍。为了阐明NII形成对人脑核内结构的影响，在本研究中，我们研究了PML核小体和卷曲体这两种最显著的核小体亚型的分布。27我们发现，在DRPLA和MJD大脑中，PML重组了NII周围的一个特定结构，具有以前未观察到的独特分布模式体外研究。此外，这项研究首次报告了NII可能与螺旋体接触。DRPLA转基因小鼠的大脑中也证实了螺旋体和核内聚集物之间的相互作用体外研究。本研究阐明了与NII形成有关的重要核事件，NII可能在人脑CAG重复性疾病的病理机制中发挥关键作用。
材料和方法
人类材料与DRPLA转基因小鼠
本研究以一名MJD患者（女性，Q83，年龄32岁）、一名DRPLA患者（女性、Q59，年龄79岁）和七名对照组（年龄65至83岁；平均73.4岁）的尸检大脑为材料。我们还检测了含有一个全长人类突变DRPLA基因的单拷贝的转基因小鼠的大脑，该基因具有129个CAG重复序列。28由于在9周龄后的小鼠中检测到泛素化NII的发生，因此在本研究中，我们检测了14周龄小鼠的大脑皮层。
免疫组织化学
尸检时获得每个人脑脑桥核的组织碎片，在冷异戊烷中快速冷冻，并保存在深冰箱中直到使用。用冷冻材料制作冷冻切片（8-μm厚），用冷丙酮（−20°C）固定7分钟，并用亲和素-生物素过氧化物酶复合物（ABC）方法和Vectastain ABC试剂盒（加利福尼亚州伯林盖姆Vector Laboratories）进行免疫染色，使用兔抗泛素抗体（1:800）、C-Jun抗体（1:2000）、C-Fos抗体（1:200）、，Egr-1（1:2000）、Egr-2（1:2000。切片在4°C下与一级抗体孵育18小时。用小鼠抗PML单克隆抗体（1:200）或SUMO-1单克隆抗体对冷冻切片进行免疫染色。除从Dakopatts（Glostrup，丹麦）购买的抗泛素抗血清外，主要抗体从Santa Cruz Biotechnology（加州圣克鲁斯）购买。二氨基联苯胺用作显色剂。免疫染色后，用苏木精对切片进行复染。为了研究NII与核内结构的相互作用，冷冻切片进行双重免疫荧光染色。用10%的正常山羊血清孵育后，将切片与兔抗PML抗体（1:50；日本名古屋医学与生物实验室）和小鼠抗泛素单克隆抗体（1:50%；加利福尼亚州特梅库拉Chemicon）的混合物孵育18小时。为了对NII和卷曲体进行双重免疫荧光染色，用兔抗p80-coilin抗体替换兔抗PML抗体29（1:200；来自加利福尼亚州拉霍亚斯克里普斯研究所EK Chan博士的礼物）。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗后，将切片在室温下与荧光素结合的山羊抗鼠IgG（1:40；Cappel，北卡罗来纳州达勒姆）和罗丹明结合的山羊抗兔IgG的混合物孵育1小时，并借助荧光显微镜进行观察。对于阴性对照，用正常的兔或小鼠血清替换一级抗体。从DRPLA转基因小鼠（14周龄）获得大脑，该小鼠通过过量吸入乙醚而死亡。大脑被冠状切割，并在冷异戊烷中快速冷冻。冷冻切片由冷冻组织制成，并以与人体材料相同的方式进行免疫染色。
COS-7细胞转染与免疫细胞化学
如前所述，5用编码19或82个谷氨酰胺残基的全长或截短的DRPLA cDNA转染COS-7细胞。转染后48小时，用4%多聚甲醛将细胞固定在0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中，用0.1%Triton X-100在PBS中渗透，然后用10%正常山羊血清处理以消除非特异性染色。使用小鼠抗FLAG M5单克隆抗体（1:400；Eastman Kodak，Rochester，NY）和兔抗PML抗体（1:200）的混合物，或小鼠抗FLAG-M5抗体（1:40）和兔抗血清p80-coilin抗体（1:20）的混合物在4°C下进行18小时的双重免疫荧光染色，然后以与前面描述的人脑切片双重免疫荧光染色相同的方式与二级抗体孵育。
电子显微镜观察
对于传统的电子显微镜检查，在尸检时从一名MJD患者的大脑中获得桥脑细胞核的组织碎片，固定在0.1%磷酸缓冲液中的3%戊二醛-1%多聚甲醛中，pH 7.4，后固定在1%四氧化锇中，通过分级乙醇系列脱水，并嵌入Epon 812树脂中（Polysciences，Warrington，PA）。通过吸入乙醚对DRPLA转基因小鼠进行深度麻醉，然后用PBS经心灌注，随后用3%戊二醛-1%多聚甲醛在pH 7.4的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液中灌注。灌注后，将大脑从颅骨中取出，并在4°C的温度下将其浸泡在相同的固定剂中16小时。用同样的方法制备年龄匹配的非转基因小鼠。用与人类脑组织相同的方法将小鼠大脑皮层嵌入Epon 812树脂中。用组织碎片制作超薄切片，用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色，并用Hitachi-7100电子显微镜检查（日本Hitachinaka-city，Hitachi）。
对于免疫电子显微镜，尸检时获得的MJD脑桥核的组织碎片固定在4%多聚甲醛中的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液中，pH值为7.4。通过吸入乙醚对转基因小鼠进行深度麻醉，然后用与固定人脑相同的固定剂经心灌注。解剖大脑皮层并准备分析。组织碎片在分级二甲基甲酰胺系列中脱水，并嵌入LR白色树脂中（英国伯克希尔，伦敦树脂公司）。超薄切片被切割并安装在镍网格上。与10%的正常山羊血清孵育10分钟后，将切片与兔抗PML抗体（1:400）和鼠抗泛素单克隆抗体（1:50；Chemicon）的混合物，或兔抗p80-coilin抗体（1:200）和鼠对抗泛素单抗（1:50）的混合物在4°C孵育过夜；Chemicon公司）。用PBS清洗后，在室温下将切片与山羊抗兔IgG结合到15-nm金颗粒和山羊抗鼠IgG连接到10-nm金颗粒的混合物（1:30；英国加的夫英国生物细胞国际）孵育30分钟。然后用PBS清洗切片，并用2%戊二醛在pH 7.4的0.1 mol/L二甲氨基甲酸钠缓冲液中培养。用蒸馏水清洗后，用醋酸铀酰和柠檬酸铅对切片进行染色，并用日立H-7100电子显微镜进行检查。对于阴性对照，用正常兔和小鼠血清替换一级抗体。
结果
MJD和DRPLA患者大脑中的泛素NII
为了获得NII的形态学细节，我们研究了MJD和DRPLA患者的脑桥核。在MJD中，54.4%的神经元出现泛素化NII。每个核的NII数量不同，单个核和两个核的发生率不同（图1a），三个（图1b）或三个以上NII分别为25.3%、73.4%、0.6%和0.7%。在DRPLA中，8.5%的神经元出现泛素化NII，其中含有一个、两个或三个NII的细胞核数分别为67.6%、30.9%和1.5%。NII的大小在MJD中为0.8至3.7μm，在DRPLA中为0.7至2.2μm。核仁附近偶尔出现NII。在每个核有两个NII的神经元中，内含物经常以成对或双倍形式出现（MJD中为70.3%，DRPLA中为71.5%，图1a).
泛素、小泛素相关修饰物（SUMO-1）、c-Jun和PML的免疫组织化学。这些照片(a–l)来自MJD患者脑桥核的神经元(a–d,f–i型)，一个控制案例(e（电子）)和一名DRPLA患者(j–l). 泛素标记显示在含有两个核糖体的神经元中存在双重NII(一)或三个(b条)NII。SUMO-1在NII上共定位，核质中标记较弱(c（c）). NII对c-Jun呈强烈免疫阳性(d日). 神经元细胞核中的PML标记在对照组织中表现为核内小点(e（电子）)但作为MJD中的一个大型机构(（f）). 抗泛素（绿色）和抗PML（红色）抗体的双重免疫荧光染色显示，一个神经元含有双重类型的泛素化NII(克)和大圆环形PML标签(小时)位于其中一个配对NII上（以黄色显示我)NII周围有更大的标记区域。在MJD的其他神经元中可以看到PML标记在一个NII上的有限共定位(j个和k个)和DRPLA(我)大脑。含有全长人突变DRPLA基因的DRPLA转基因小鼠大脑皮层神经元中129个CAG重复序列(米和n个)观察到一些小的PML免疫阳性点与NII相关。在转染编码82个谷氨酰胺残基的截短DRPLA cDNA后培养48小时的COS-7细胞中(o个)，核内聚集体(箭头)与细胞核内的一些PML免疫阳性点相关（红色）。胞质内(箭头)和核内(箭头)使用抗FLAG M5抗体，聚集物显示为绿色。免疫过氧化物酶(a–f)和双重免疫荧光(g–o型)方法。比例尺，10μm。照片中的比例尺一也适用于照片b条和d日到米和照片中的比例尺米也适用于照片n个.
为了评估人类大脑中PML核小体与NII的相互作用，我们用免疫组织化学方法研究了PML核大体的组成蛋白之一的小泛素相关修饰物（SUMO-1）的定位。24在正常大脑中，在神经元核质中观察到SUMO-1免疫反应的弥散分布（数据未显示）。在MJD和DRPLA大脑中，SUMO-1免疫反应与NII共定位，显示出与泛素免疫组织化学相似的标记模式，包括成对形状的出现（图1c）在MJD和DRPLA中，分别有56.3%和2.8%的神经元出现SUMO-1免疫反应性NII。我们进一步研究了转录因子和NII之间的相互作用，发现在MJD和DRPLA中，NII对c-Jun呈强烈的免疫阳性反应（图1d）c-Fos呈弱免疫阳性（数据未显示），但Egr-1、Egr-2和Egr-3呈免疫阴性。在MJD和DRPLA中，在20.4%和1.5%的神经元中分别观察到c-Jun阳性NII，在13.8%和0.8%的神经元中分别观察到c-Fos阳性NII。
CAG重复性疾病、DRPLA转基因小鼠和转染DRPLA蛋白的培养细胞中的PML核体
PML免疫反应在正常神经元中表现为8至18个核点，大小从0.2至0.8μm不等（图1e）在MJD和DRPLA大脑中，分别有47.1%和11.0%的神经元重新排列了PML标记，并形成了一个大的单体（图1f）其大小分别为1.7至3.0μm和1.5至2.3μm。这些大PML结构大多仅存在于神经元细胞核中；然而，一些小体与一些正常大小的PML点共存。在缺乏大PML结构形成的神经元细胞核中，其外观和分布没有显著变化。MJD和DRPLA大脑的双重免疫荧光染色显示，大PML结构与泛素化NII共存（图1; g、 h和i）。在单型NII中，MJD和DRPLA的共定位发生率分别高达94.4%和83.9%。有趣的是，如果神经元每个核含有一个以上的NII，则大PML结构仅与一个NII共存（图1; i至l）。一般来说，PML免疫标记大于泛素标记，并且在NII的外围区域突出，表现出甜甜圈状的外观。
我们检测了携带一个带有129个CAG重复序列的全长人类突变DRPLA基因的DRPLA转基因小鼠神经元的PML核体。283周龄时，这些小鼠表现出肌阵挛运动。随后在12周大时出现共济失调、肌阵挛运动和癫痫的快速进展；这些动物在14至16周龄时全部死亡。神经病理学检查显示，早在4周时，大脑就出现了渐进性萎缩，但在死亡之前，中枢神经系统（CNS）任何区域的神经元均未出现明显丢失。在～9周龄时，首次在中枢神经系统的局限区域（如丘脑底核和小脑核）检测到泛素化NII的发生。在14周龄的小鼠大脑中，泛素化NII以单一形式出现，并出现在CNS更广泛的区域，包括大脑皮层（第II、III、IV和VI层）、苍白球、丘脑、脑桥核和脑干被盖，显示出与人脑病理学相似。三在14周龄小鼠的正常大脑皮层神经元中，PML标记在每个细胞核中显示为多个小点，大小从0.3μm到0.6μm，并散布在整个核质中。在DRPLA转基因小鼠大脑中，缺乏NII的大脑皮层神经元在PML标记模式中没有变化。大多数含有NII的皮层神经元也保留了PML标记的分散模式（图1，m和n），但在一些NII周围偶尔会遇到几个PML点的关联（图1m）在这些幼鼠大脑中未观察到人类大脑中PML的大圆环状标记。
我们检测了PML核小体在表达突变DRPLA蛋白的COS-7细胞中的分布。正如我们之前的研究所观察到的，5聚集体的形成仅限于表达具有82个谷氨酰胺的截短DRPLA蛋白的细胞，并且主要在细胞质的核周区域观察到，而在细胞核中观察到的频率较低。在缺乏聚集形成的细胞中，PML核小体呈0.3至1.1μm大小的多个核内小点，分散在核质中。在含有核内聚集物的细胞中，PML核小体保留了其多个点状外观，但一些在聚集物周围被招募（图1o）只有细胞质聚集体的细胞PML核体的分布没有明显变化。用人和小鼠大脑以及培养细胞进行的免疫组织化学研究显示，对照组织中没有阳性染色。
PML对NII周围环形结构的定位
为了阐明PML的精确定位，我们对一例MJD患者的NII进行了超微结构分析。常规电子显微镜检查表明，NII缺乏限制膜，成分不均匀，并且包含颗粒和丝状结构的混合物（图2a）丝状成分是直的或轻微弯曲的，直径约为12至15 nm，通常以随机排列的形式组织，但有时是平行排列的。虽然我们没有观察到每个细胞核含有两个以上内含物的神经元细胞核，但在电子显微镜下观察时偶尔会发现含有两个NII的细胞核。这些双型NII也由类似于单型NII的颗粒状和丝状结构组成。有时，NII被环形结构包围，这些结构基本上由粒状材料组成，从轮廓不规则模糊的宽圆圈到清晰的环形结构，呈现出各种不同的外观（图2、b和c）有趣的是，如果每个核含有两个包裹体，则环状结构的形成仅限于其中一个NII（图2、b和c）使用免疫金标记的电镜免疫组化显示，PML免疫反应在两种类型的NII中都存在，即那些缺乏或含有环状结构的NII。对于前一种类型，标记在NII的边缘区域分布得相当广泛（图2d）然而，在后者的情况下，PML标记更集中于环结构（图2e）泛素免疫反应基本上存在于NII的核心结构上，很少观察到与PML标记混合，即使在缺乏环状结构的NII中也是如此（图2d）.
MJD脑桥核NII的超微结构(a–e)以及DRPLA转基因小鼠的大脑皮层(（f）). 借助于传统电子显微镜(a–c)，NII似乎(箭头)由颗粒状和丝状结构的混合物组成。大型箭头在里面b条和c（c）表明NII的纤维核周围有环状结构。含有两个NII的神经元(b条和c（c）)表明两个NII中只有一个周围形成环状结构。颗粒纤维体(箭头在里面a–c)在形态上与螺旋体相同，与NII接触。双重免疫标记(d日和e（电子）)泛素（以15-nm金粒子表示）和PML（以10-nm金粒子显示）表明PML位于NII的边缘区(箭头在里面d日)或者在NII周围的环形结构上(箭头在里面e（电子）). NII上没有PML标签(箭头)DRPLA转基因小鼠(（f）). 比例尺，200 nm。
我们还对DRPLA转基因小鼠的NII进行了超微结构检查。对这些小鼠大脑皮层第二层和第三层的半薄切片的检查表明，50.8%的神经元形成NII，含有NII的神经元在核膜上有许多凹痕。非转基因小鼠大脑的大脑皮层神经元主要表现为表面光滑的圆形细胞核，没有任何内含物。超微结构检查显示，DRPLA转基因小鼠的NII是孤立的，非膜结合的，大小从1.2到2.2μm不等。NII的成分相对均匀，主要由纤维结构组成，基本上是直的，直径约9至12 nm，并以随机阵列组织。在DRPLA转基因小鼠中，未观察到MJD脑NII周围的环状结构。NII上或周围未检测到PML蛋白标记（图2f）免疫电镜显示。
NII与p80-Coilin免疫阳性结构的密切关联
为了阐明NII与核内结构的相互作用，我们进一步用免疫组织化学方法研究了螺旋体的组成蛋白p80-coilin的定位，30在MJD和DRPLA大脑中。在正常人脑的神经元细胞核中，p80-coilin免疫反应呈高达1.7μm的圆点。大多数神经元在细胞核中显示出单个卷曲体（图3a），但有些细胞核有几个或更多较小的螺旋体（图3b）在MJD大脑中，p80-colin标记的分布和大小没有明显变化；然而，一些神经元细胞核显示成对免疫标记（图3c）与泛素免疫组化观察结果相似。双重免疫荧光研究表明，大多数泛素化NII与p80-coilin阳性结构不同，但两者都密切接触（图3; d至g）。DRPLA人脑中也证实了这种关系（图3、h和i）在单型NII中，MJD和DRPLA的NII与螺旋体毗邻的发生率分别为76.7%和83.3%。其余的单型NII大多在检查切片的任何核区缺乏p80-coilin标记。当借助荧光显微镜观察时，大多数成对NII与一个或多个卷曲体相关（图3、f和g）在一些细胞核中，p80-coilin失去了正常的点样分布，并与泛素化NII共存（图3; j、 k和l）。在DRPLA转基因小鼠的大脑皮层神经元中也观察到NII与p80-coilin标记的接触或部分共定位（图3，m和n），NII的发生率高达93.1%。p80-coilin的标记在大多数神经元细胞核中表现为几个小点（～1.1μm），正常小鼠和转基因小鼠标记结构的大小和分布没有明显变化。在COS-7细胞中，p80-coilin-labeling表现为一些离散的圆点，测量范围为0.4至1.0μm。尽管在含有或缺乏突变蛋白聚集体的细胞之间，卷曲体的大小和分布没有明显差异，但核内聚集体通常与p80-coilin阳性结构相关（图3o）.
泛素和p80-coilin的免疫组织化学，这是一种螺旋体的特异标记物。这些照片(a–l)取自MJD脑桥核的神经元(a–g,j–l)和DRPLA(小时和我)大脑。胆碱标记在神经元细胞核中表现为大小不等的小圆体(一和b条)，并且很少以较大的身体表现出类似NII的外观(c（c）). 抗泛素和抗p80-coilin抗体的双重免疫荧光染色显示泛素化NII（绿色d日)和螺旋体（红色e（电子），由指示箭头)存在于相互关联的细胞核中(（f）). 在MJD的其他神经元中可以看到NII与卷曲体之间的联系(克)和DRPLA(小时和我)大脑。照片显示了一例罕见的p80-coilin在NII上的共定位j个（NII），k个（p80卷取），以及我（合并图像以黄色显示）。在DRPLA转基因小鼠的大脑皮层神经元中也可以看到NII与卷曲体之间的联系(米和n个). 用编码82个谷氨酰胺残基的截短DRPLA cDNA转染COS-7细胞(o个)，一组核内聚集体(箭头)与螺旋体接触。聚集物出现在细胞核和细胞质内(箭头)和显示为绿色，使用抗FLAG M5抗体。细胞质中观察到的颗粒标记(e–l型)是脂褐素颗粒的自体荧光。免疫过氧化物酶(a–c)和双重免疫荧光(d–o公司)方法。比例尺，10μm。照片中的比例尺一也适用于照片b条到我和照片中的比例尺米也适用于照片n个和o个.
NII与卷曲体的关联
为了阐明神经元细胞核中p80-coilin-i免疫阳性点的形态，我们对MJD大脑中的NII进行免疫电镜观察。p80-coilin的免疫金标记定位在颗粒纤维结构上（图4; a、 b、c）呈圆形至卵圆形，直径0.5～1.0μm，形态与螺旋体相对应。31,32这些标记结构与NII接触（图4a），偶尔位于两个NII之间（图4，b和c）经常观察到NII与卷曲体的联系，即使使用常规电子显微镜观察（图2; a、 b和c，箭头）。
MJD脑桥脑细胞核NIIs的超微结构(a–c)以及DRPLA转基因小鼠的大脑皮层(d–f日). 双重免疫标记(a–c)泛素（以15-nm金粒子表示）和p80-coilin（以10-nm金粒子显示），小箭头)表明p80线圈标记的结构是螺旋体(大箭头)与一个或两个NII接触(箭头). DRPLA转基因小鼠的两个大脑皮层神经元显示存在单个NII(箭头)与电子致密体有关(箭头). 照片e（电子）表明电子密度体(箭头)是一个在形态上与螺旋体相同的颗粒纤维体，以及一个NII(箭头)它通过丝状结构与螺旋体相连。免疫金法表明，颗粒原纤维体对p80-coilin呈阳性，如10-nm金颗粒所示(（f）). 比例尺，200 nm。
我们进一步研究了NII与DRPLA转基因小鼠大脑皮层神经元中卷曲体的关系。借助电子显微镜观察时，经常会发现颗粒纤维体和NII之间的联系（图4d）NII切片发病率高达77.8%(n个= 126). 颗粒原纤维小体的形态与卷曲小体一致，大小不同，可能是因为小体的切片高度不同，直径可达0.9μm。这些小体在颗粒原纤维核心周围具有径向纤维，NII与这些丝状结构相连（图4e）电子显微镜免疫组织化学证实颗粒纤芯对p80卷蛋白呈阳性（图4f）在非转基因小鼠脑的神经元细胞核中，11.1%的细胞核切片中出现了颗粒纤维体。转基因小鼠和非转基因小鼠的颗粒纤维小体（包括周围的细丝）的大小和外观没有明显差异。
讨论
本研究结果表明，DRPLA和MJD中至少有两个亚核结构共同但明显参与NII的形成。免疫组化分析显示，在含有NII的神经元细胞核中，PML蛋白改变了其正常分布，并在NII周围重新排列，使其呈现出甜甜圈样外观。这次重排与体外突变体ataxin-1表达的研究8或ataxin-323已进行调查。在这些研究中，观察到PML核小体被征募到突变蛋白的核内大聚集体上。这种结构变化可能导致某些核功能障碍，导致细胞死亡。然而，目前的免疫电镜研究表明，PML蛋白的抗原性定位于NII周围的纤维环状结构。在NII缺乏纤维环的情况下，PML标记在NII周围呈圆形分布。在正常细胞的典型PML核体中，PML蛋白对围绕中心核的致密纤维环或核体边缘的丝状成分具有特异性。33,34因此，我们认为NII周围PML的甜甜圈状标记不仅仅代表PML核体的聚集体，而是可能是PML为了保持PML分布的原始性质而积极重组的一种特定结构。与人脑相比，在DRPLA转基因小鼠或培养实验中未观察到类似甜甜圈的PML重排。考虑到在小鼠大脑和培养细胞中形成聚集物后的短时间内，PML重塑可能很耗时。最近的研究表明，PML核体参与蛋白酶体介导的泛素化蛋白质降解。35也有报道称，PML含有一个环填充结构域，35它可以作为泛素蛋白连接酶（E3）靶向蛋白质进行降解。36,37因此，NII周围PML的浓度可能表明PML通过生理泛素蛋白酶体途径积极参与NII的降解，而不是被NII吸收。
有趣的是，在本研究中，PML集中在每个核的一个NII上，即使一个核中存在多个泛素化NII。在以前形成突变蛋白的多核内聚集体的培养实验中没有观察到这种偏好。8, 23正如超微结构研究所揭示的那样，NII的成分是异质的。因此，每个细胞核中可能存在特定类型的NII，这反过来可能与PML对特定NII的偏爱有关，尽管我们无法描述与PML相关的NII的共同形态特征。或者，PML的浓度可能取决于NII形成的顺序。根据我们的结果，我们推测大多数PML集中在核内形成的第一个NII中。换句话说，即使形成了另一个NII，核内第一个NII的形成也可能对PML随后的分布产生一定的影响，并导致蛋白质向自身的积累。目前，在人脑病理学中，是否从一开始就在一个核内同时形成一个以上的NII尚待证明。然而，我们已经表明，在DRPLA转基因小鼠中，至少从～9周（NII形成的初始阶段）到16周（小鼠的最大生存时间）这段时间内，单个NII形成是大脑中的一个重要事件。
与PML相比，SUMO-1在NII中普遍分布。SUMO-1是一种具有泛素同源结构域的蛋白质，它共价修饰PML和另一种PML核体相关蛋白Sp100等特定核蛋白。38SUMO-1（sumoylation）的这种修饰被认为在将蛋白质引导到特定的亚核隔室（如PML核小体）中发挥作用，而不是将其靶向蛋白酶体降解。39这表明SUMO-1在将某些蛋白质划分为NII中发挥作用。或者，SUMO-1可能在NII中保护特定蛋白质免受降解。正如最近的研究所表明的，21,22,40,41一些转录因子如CBP和p53被招募到核内包涵体中。本研究还证明了c-Jun和c-Fos在NII中的共同定位。事实上，p53和c-Jun是泛素的靶点，也是SUMO-1的底物，使其能够避免泛素化，42可能表明SUMO-1在NII的蛋白质稳定性中发挥作用。然而，许多核蛋白被招募到NII中可能导致逐渐的核功能障碍，最终导致神经元萎缩或变性。
本研究揭示的另一个显著特征是NII与螺旋体之间的密切联系。在DRPLA和MJD脑、DRPLA转基因小鼠脑和培养细胞中观察到这种关联，与突变DRPLA蛋白形成核内聚集体。这种现象在不同疾病中常见，这表明接触依赖于引起DRPLA蛋白或ataxin-3内的polyQ延伸。在超微结构上，观察到NII和螺旋体要么直接接触，要么通过丝状结构相互连接（图4e）这种相互作用的分子基础令人感兴趣；然而，p80-coilin不太可能介导这种连接，因为该分子不包含任何可清楚识别的肽基序43-45或polyQ结构域，后者有可能与突变体扩展polyQ相互作用。20p80-coilin的电镜免疫组化也未能标记连接丝或NII。在包含在螺旋体中的蛋白质之间，27,46TATA结合蛋白可能是参与连接的候选蛋白之一，因为TATA结合蛋白质包含一个特别长的polyQ延伸，并且在DRPLA和MJD大脑的NII中被招募。21
螺旋体的功能尚未完全理解。它们包含参与剪接的小核核糖核蛋白颗粒，最近的研究表明，这些结构在小核核糖核蛋白颗粒的生物生成中发挥作用。25,27螺旋体是一种高度动态的结构，在细胞周期中经历组装和拆卸，变化的数量与细胞生长和基因表达水平有关。25,47尽管在本研究中，螺旋体的形态和分布没有明显变化，但它们与NII的密切相互作用可能会间接导致螺旋体功能的改变。由于其相对较大的尺寸，NII可能会干扰螺旋体的运动。48这种干扰可能延伸到盘绕体和核仁之间的密切关系。25,27为了阐明CAG重复性疾病中神经元细胞死亡的机制，现在有必要探讨NII和卷曲体之间的联系如何影响后者的功能。除了NII的影响之外，NII和螺旋体之间的优先关联可能解释了为什么当一个核中存在多个NII时，NII经常以成对或双重形式出现。正如电子显微镜所显示的那样，经常可以观察到卷曲体夹在两个NII之间。
致谢
我们感谢S.Egawa、Y.Ohta、T.长谷川、C.Tanda、J.Takasaki和K.Honma提供的技术援助；M.Machida、K.Abe和T.Koike的秘书协助；陈冠希（E.K.Chan）慷慨提供抗p80-coilin抗血清。
脚注
向Mitsunori Yamada，M.D.，病理学系，新泻大学大脑研究所，日本新泻951-8585，1 Asahimachi发送转载请求。电子邮件：.pj.ca.u-atagiin.irb@铁
由日本卫生、劳动和福利部共济失调疾病研究委员会的资助；以及日本教育、文化、体育、科学和技术部的科学研究补助金。
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