《美国病理学杂志》。2001年11月；159(5): 1635–1643.
洞穴蛋白-1在人卵巢癌中下调并作为候选肿瘤抑制基因
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凯·维森
Charité，德国柏林洪堡大学；Clontech Laboratories Inc.公司。，†
卢达·迪亚琴科
加利福尼亚州帕洛阿尔托；以及妇产科，‡
哈根·肖伯
Charité，德国柏林洪堡大学；Clontech Laboratories Inc.公司。，†
凯萨琳娜·阿尔特
德国柏林洪堡大学Charité；Clontech Laboratories Inc.公司。，†
巴赫特·朱马巴耶娃
加利福尼亚州帕洛阿尔托；以及妇产科，‡
保罗·西伯特
加利福尼亚州帕洛阿尔托；以及妇产科，‡
曼弗雷德·迪特尔
德国柏林洪堡大学Charité；Clontech Laboratories Inc.公司。，†
Reinhold Schäfer公司
德国柏林洪堡大学Charité；Clontech Laboratories Inc.公司。，†
克里斯汀·塞尔斯
Charité，德国柏林洪堡大学；Clontech Laboratories Inc.公司。，†
来自病理研究所，*
德国柏林洪堡大学Charité；Clontech Laboratories Inc.公司。，†
加利福尼亚州帕洛阿尔托；以及妇产科，‡
德克萨斯州休斯顿贝勒医学院
摘要
识别卵巢癌差异表达的新标记物与我们将微阵列与来自正常卵巢和晚期卵巢癌的cDNA杂交。该分析揭示了小窝蛋白-1基因(空腔1)在卵巢癌样本中。抑制CAV1型卵巢癌中的卵巢癌是使用由68个来自不同匹配的人类肿瘤和正常组织的cDNA池组成的肿瘤组织阵列进行确认的。免疫组织化学显示小窝蛋白-1在正常和良性卵巢上皮细胞中表达，但在浆液性卵巢癌中表达缺失。在低度恶性肿瘤中，观察到小窝蛋白-1从正常上皮的膜相关模式重新分布到细胞质定位模式。在所研究的六种卵巢癌细胞系中，有四种细胞未检测到小窝蛋白-1的表达。在表达高水平小窝蛋白-1蛋白的SKOV-3和ES-2癌细胞中，检测到22-kd小窝蛋白1亚型的磷酸化。分别使用5-氮杂-2′脱氧胞苷和曲古菌素A抑制DNA甲基化和组蛋白去乙酰化，可以缓解OAW42和OVCAR-3细胞中小窝蛋白-1的下调，这部分是通过mRNA水平的直接调节介导的。的表达式CAV1型在卵巢癌细胞系OVCAR-3中，导致肿瘤细胞存活受到抑制体外，表明CAV1型该基因可能在人卵巢上皮细胞中起到抑癌基因的作用。
肿瘤的形成和发展是一个基于大量基因改变的多阶段过程。1原癌基因，如RAS系统和MYC公司可以被突变激活或扩增，如第53页,第16页、和皇家银行因突变、基因组沉默或缺失而失活。2-4这些基因改变对信号转导控制、细胞周期调节和细胞凋亡具有根本性影响。在正常细胞中，生长因子信号从其膜受体传递到细胞核是一个高度组织化的过程，涉及信号分子的受控时空激活。这在一定程度上是由于小泡的形成，在许多细胞类型中观察到小泡状的膜内陷。5Caveolae已被证明在胞吞和脂质代谢中发挥作用，但也在信号转导中发挥作用。它们富含脂质、膜受体和大量信号分子，其中已发现RAS和RAF、SHC、PKCα和有丝分裂原活化蛋白激酶。小窝蛋白（小窝蛋白-1α、-1β、2和3）是膜小窝的主要组成蛋白。6Caveolin-1已被证明与HRAS蛋白、EGF受体、SRC家族酪氨酸激酶和蛋白激酶C结合。7-9这些观察结果导致了这样一种假设，即Caveolins作为对接蛋白，将信号分子集中在正常细胞的不同膜域。6此外，小窝蛋白-1也作为信号调节器发挥着关键作用，这一观察结果表明小窝蛋白1靶向下调小窝蛋白-1NIH3T3细胞足以激活有丝分裂原激活的蛋白激酶并刺激凤尾鱼非依赖性生长。10癌基因转化过程中小窝形成的缺失已在前面描述过11据报道，caveolin-1蛋白在转化细胞中被磷酸化甚至丢失。如最近所示，小窝蛋白-1还抑制小鼠体内的c-Neu依赖性信号传导，人类乳腺癌细胞系中小窝蛋白1表达的缺失表明该蛋白在人类乳腺癌中起作用。12尽管小窝蛋白-1抑制肿瘤细胞生长的潜力已被证明，13,14只有少数研究调查了caveolin-1在正常和恶性人上皮和间充质细胞中的表达就地.15-17
我们基于微阵列的方法鉴定了人类卵巢癌和正常卵巢中差异表达的基因，结果显示，卵巢癌中的基因表达下调小窝蛋白-1基因(CAV1型)在卵巢癌中。此外，我们使用第二种肿瘤组织特异性阵列来研究小窝蛋白-1在68个不同的匹配cDNA池中表达。通过免疫组化，我们进一步证实了小窝蛋白-1蛋白在正常卵巢上皮细胞中的表达，但在卵巢癌细胞中没有表达，并研究了小窝素-1蛋白下调卵巢癌细胞表达的机制CAV1型基因。
材料和方法
肿瘤标本
用于RNA制备的人类卵巢组织标本在液氮中进行snap冷冻。对来自柏林慈善大学医院病理研究所档案的正常卵巢、良性卵巢肿瘤和卵巢癌的福尔马林固定石蜡包埋标本进行免疫组织化学分析。根据世界卫生组织分类对肿瘤进行组织病理学诊断。组织包括6个正常卵巢、19个浆液性囊肿或浆液性腺瘤、7个粘液性腺癌、5个交界性恶性浆液性卵巢肿瘤、29个浆液癌（3级1、10级2、16级3）、2个1级粘液癌和3个2级子宫内膜样癌。
RNA制备
冷冻组织样品在液氮中均质并溶解在裂解缓冲液中。根据制造商（加利福尼亚州帕洛阿尔托市Clontech）提供的协议，使用Atlas纯RNA系统制备RNA，并对DNA污染进行控制。根据Chomzcynski和Sacchi的方法从细胞系中制备RNA。18
肿瘤组织芯片的表达分析
匹配的肿瘤/正常表达阵列由68个cDNA组成，由人类致瘤组织和相应的正常组织合成(http://www.clontech.com/technfo/manuals/pdf/pt3424–1.pdf格式). 每对都根据三个看家基因的表达进行独立标准化，并固定在单独的点中。19A类空腔1-使用DECA-primeII标记试剂盒（德克萨斯州奥斯汀市Ambion）对特定cDNA片段进行放射标记，使用ExpressHyb杂交溶液（Clontech）在68°C下杂交过夜，清洗，并暴露于带有增感屏的Biomax MS X射线胶片（纽约州罗切斯特市伊士曼柯达公司）。使用STORM-860磷化成像仪（分子动力学，尤金，OR）计算单个斑点的信号强度。
免疫组织化学
将切在硅烷涂层载玻片上的两个μm切片脱蜡，并在pH 6.0的10 mmol/L柠檬酸钠缓冲液中煮沸5分钟。小鼠单克隆抗小窝蛋白-1抗体（克隆2297；转导实验室）以1:500的稀释度应用1小时。为了确保染色强度一致，对每个肿瘤标本外围的正常间充质组织和肿瘤内的毛细血管内皮细胞进行了检测，作为阳性对照。在阴性对照组中，一级抗体被省略或替换为具有无关特异性的抗体（小鼠IgG1，X0931；DAKO）。按照制造商的建议，使用Vectastain ABC-AP试剂盒（Vector Laboratories，Burlingame，CA）进行免疫染色。切片用苏木精复染，并安装在Permount中。数字图像是使用奥林巴斯DP-10电荷耦合设备摄像头采集的。图像对比度的调整在图像上进行。使用半定量评估评估小窝蛋白-1免疫染色。通过将平均染色强度和小窝蛋白-1阳性细胞百分比的值相乘得到综合评分。强度分级为1（弱阳性）、2（中度阳性）或3（强阳性，相当于周围基质的正常间充质细胞）。
细胞培养
将人卵巢癌细胞系SKOV3、ES-2、OAW42、CAOV-3、MDAH 2774和OVCAR3维持在补充有10%胎牛血清和2mmol/L谷氨酰胺的Dulbecco改良Eagles培养基（DMEM）（BioWhittaker，Walkersville，MD）中。人类卵巢表面上皮细胞在添加有10%胎牛血清和2 mmol/L谷氨酰胺的培养基199（西格玛化学公司，密苏里州圣路易斯）和MCDB105（纽约州格兰德岛生命科技公司）的1:1混合物中培养。曲古抑菌素A（TSA）（Sigma）的用量为25 ng/ml，5-氮杂-2′脱氧胞苷（Sigma5μmol/L），MEK1抑制剂PD98059（Alexis，San Diego，CA）的用量是50μmol/L，PI-3激酶抑制剂LY294002（Alexis10μmol/L。在制备细胞提取物或RNA之前，将细胞培养3天。
表达式构造
最近描述了pLNHX载体（Clontech）和pLNHX-caveolin-1表达载体。15在pc-CAV-V5质粒（Genestorm；Invitrogen，Groningen，Netherlands）中小窝蛋白-1由巨细胞病毒直接早期启动子控制，并与V5表位标签融合。
菌落形成分析
在稳定转染中，2×105根据制造商的协议，使用Fugene（德国曼海姆罗氏）用1.5μg pLNHX-caveolin或空载体转染每6孔板的OVCAR-3细胞。转染72小时后，通过将0.5 mg/ml的G418添加到培养基中10天来选择G418抗性克隆。进一步扩展和分析了几个单独的克隆。使用pc-CAV-V5质粒或空载体pcV5以类似的方式进行稳定转染，但使用30μg/ml Zeocin（Invitrogen）进行10至14天的筛选。
终端dUTP镍端标记（TUNEL）分析
用于检测细胞凋亡，1×106OVCAR-3细胞/10厘米2用3μg pc-CAV-V5或使用Fugene（Roche）的空载体pcV5瞬时转染培养皿。转染细胞48小时后，将其固定在4%甲醛中，并使用制造商描述的ApoAlert DNA片段试剂盒（Clontech）进行TUNEL分析。
Northern Blot分析
对于Northern印迹制备，通过1.2%琼脂糖凝胶电泳分离10μg总RNA，并将其印迹到Hybond N尼龙膜（Amersham，Arlington Heights，IL）上。A类CAV1型-使用ExpressHyb杂交溶液（Clontech）在58°C下将特定cDNA片段杂交2小时，清洗，并使用增感屏（Eastman Kodak Co）将其暴露在Biomax MS X射线胶片上2天。
Western Blot分析
通过2×10的温育制备蛋白质提取物6细胞在500μl RIPA缓冲液（150 mmol/l NaCl，1%Nonidet P-40，0.5%脱氧胆酸盐，0.1%十二烷基硫酸钠，50 mmol/LT ris-HCl，pH 8.0，100μmol/l原钒酸钠，2 mmol/l-抑肽酶）中冰上30分钟。组织样本在同一缓冲液中均质。将样品缓冲液（2×）添加到细胞提取物中（120 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8，200 mmol/L-二硫苏糖醇，4%十二烷基硫酸钠，20%甘油，0.002%溴酚蓝），将样品煮沸10分钟，离心，并将等分样品储存在−20°C。使用10μg每种提取物，并按照前面所述进行处理。15小窝蛋白-1和磷酸化小窝蛋白-1-特异性抗体（克隆2297和P-Tyr14，转导实验室）分别在TBST中以1:1000和1:2500稀释。为确保负载均匀，在室温下，在200 mmol/L甘氨酸、1%吐温-20、0.1%十二烷基硫酸钠中剥离印迹2小时，用1:5000稀释的肌动蛋白特异性单克隆抗体（克隆C4，罗氏）培养并培养。
结果
基于微阵列的分析确定Caveolin-1（CAV1）在卵巢癌中的差异表达
为了寻找与正常组织相比在人类卵巢癌中差异表达的新标记物，我们使用Atlas Select人类肿瘤cDNA阵列，该阵列代表了437个被选为在各种人类癌症组织中上调或下调的基因（Clontech；www.clontech.com/archive/oct99upd/atlas select.html). 我们将这些阵列与从两个正常人卵巢和两个3级浆液性卵巢癌中获得的总RNA杂交。这项分析显示，两种肿瘤样本中有16个基因过表达，41个基因下调，下调因子为2或2以上（数据未显示）。在下调基因中，我们观察到CAV1型与正常样本相比，癌症样本中的相对表达水平分别为0和0.09。
A类CAV1型-然后将特异性探针杂交到含有68个cDNA对样本的阵列上，这些样本来自多个人类肿瘤和单个患者的相应正常组织19（匹配肿瘤/正常阵列；http://www.clontech.com/archive/jan00upd/pdf/matchedarray.pdf). 如图1所示,CAV1型在三分之三的卵巢肿瘤中受到强烈抑制，但在乳腺（九分之九）和结肠（十一分之八）中也受到抑制。相比之下CAV1型与相应的正常cDNA相比，在肾、前列腺（三分之二）和胃（八分之六）的十五个肿瘤样本中的十一个样本中观察到。
的表达式分析CAV1型使用匹配的肿瘤/正常阵列。答：组织来自单个患者肿瘤和正常组织的cDNA样本。N个,正常；T、 肿瘤。数字1至9识别来自以下细胞系的cDNA：1，HeLa；2、Daudi；3、K562；4、HL60；5，G361；6、A594；7、Molt4；8、SW480；9，拉吉。b：使用获得的杂交结果CAV1型探查。所使用的过滤器包含三个卵巢样本（浆液型腺癌），如图所示，分别为N（正常）和T（肿瘤）以及编号1至3。抄送：相对CAV1型通过磷酸化图像分析获得的三对卵巢衍生cDNA的表达水平如表所示。
细胞系和卵巢癌中Caveolin-1在蛋白水平下调
使用Western blot分析，在永生化人卵巢表面上皮细胞、SKOV-3和ES-2卵巢癌细胞系以及从两个良性浆液性腺瘤制备的蛋白提取物中检测到高水平的小窝蛋白-1（图2a). 然而，在MDAH 2774、CaOV-3、OVCAR-3和OAW42癌细胞中没有caveolin-1表达。
人卵巢癌细胞小窝蛋白-1表达的Western blot和免疫组织化学分析。答：在人卵巢表面上皮细胞（HOSE）、ES-2和SKOV-3人卵巢癌细胞中，存在小窝蛋白-1的α（22kd）和β-亚型（24kd），在MDAH2774、CAOV-3、OCVAR-3和OAW42中未检测到表达。这两种亚型也存在于两种浆液性卵巢腺瘤（Ad1、Ad2）的蛋白制备中。b：磷酸钙载体蛋白-1特异性抗体的使用显示肿瘤细胞系ES-2和SKOV-3中小窝蛋白-1α-亚型的Tyr-14磷酸化。表达pp60src的RSV-3T3小鼠成纤维细胞裂解物用作阳性对照。去除印迹，并用抗细胞质肌动蛋白抗体进行复制，以控制相等的负荷。抄送：小窝蛋白-1的免疫组织化学分析显示在正常卵巢的表面上皮和底层基质中表达。日期：浆液性腺瘤的上皮内层也可见类似的染色，而1级浆液性癌中可观察到膜相关定位丢失和下调，如图所示箭头(e（电子）).传真：在3级浆液性癌的上皮细胞中观察到小窝蛋白-1的表达完全缺失。血管内皮细胞的阳性染色作为内部阳性对照。
随后的免疫组织化学分析（总结见表1)caveolin-1在正常卵巢表面上皮的基底膜和侧膜上有强而细粒度的表达。此外，小窝蛋白-1在表面上皮下的皮质基质中表达（图2c). 在良性浆液性囊肿和腺瘤中，可检测到类似的基底外侧膜相关表达（图2d)然而，在分析的7个粘液腺瘤的上皮中，caveolin-1完全缺失（数据未显示）。1级恶性肿瘤和交界性恶性浆液性肿瘤表达的小窝蛋白-1水平降低。在这些肿瘤中，正常上皮中存在的膜结合小窝蛋白-1的表达发生了改变，该蛋白似乎均匀分布在整个细胞质中（图2e). 最有趣的是，在29例2级和3级浆液性和子宫内膜样卵巢癌中，caveolin-1染色显著降低（图2f; 表1).
表1。
| 卵巢标本 | 组织学 | 样品数量 | 平均染色强度 | %染色细胞的数量 | 平均得分 |
|---|
| 正常卵巢 | | 6 | 3 | 93 | 278 |
| 温和的 | 浆液囊肿/腺瘤 | 19 | 2.9 | 83 | 247 |
| 粘液性腺瘤 | 7 | 0 | 0 | 0 |
| 边界线 | 塞卢斯 | 5 | 2 | 17 | 36 |
| 癌（1级） | 塞卢斯 | 三 | 1.3 | 10 | 15 |
| 粘液的 | 2 | 0 | 0 | 0 |
| 癌症（2级） | 塞卢斯 | 10 | 0.3 | 三 | 5 |
| 子宫内膜样 | 三 | 0.7 | 6.7 | 7 |
| 癌症（3级） | 塞卢斯 | 16 | 0.4 | 5.3 | 6 |
Caveolin-1在SKOV-3和ES-2癌细胞中磷酸化
在v-src转化细胞中检测到Caveolin-1是一种酪氨酸磷酸化蛋白20最近Lee和同事21表明小窝蛋白-1在酪氨酸14处发生磷酸化，以响应生长因子信号。为了评估这种修饰是否也发生在卵巢癌细胞中，我们用正常卵巢上皮细胞和SKOV-3和ES-2癌细胞的提取物进行了Western blot分析，使用磷酸钙蛋白-1特异性抗体。如图2b所示小窝蛋白-1的22-kd亚型在两种癌细胞系的酪氨酸14处磷酸化，但在永生化上皮细胞中没有磷酸化。
Caveolin-1下调与高甲基化
这个CAV1型该基因位于染色体7q31.1上。22杂合性缺失已在该区域被描述，但目前没有证据表明CAV1型人类肿瘤中的基因。17研究下调CAV1型在卵巢癌细胞中，我们使用了DNA甲基化抑制剂（5-氮杂-2′脱氧胞苷）和组蛋白脱乙酰化抑制剂（TSA）。此外，我们还分析了RAS依赖性信号通路对CAV1型通过分别使用PD98059和LY294002抑制剂干扰MEK1/2（MAP/ERK激酶）和PI-3激酶（磷脂酰肌醇-3激酶）来表达。
5-aza-2′脱氧胞苷和TSA处理OVCAR-3和OAW42细胞后，观察到小窝蛋白-1的强烈上调（图3，A和b）。5-氮杂-2′脱氧胞苷对DNA甲基化的抑制导致两种CAV1亚型的重新表达，而TSA对组蛋白脱乙酰化的抑制作用较弱，似乎是亚型依赖性的。在OAW42细胞中，PD98059抑制MEK1/2后，也可检测到较小的22-kd小窝蛋白-1蛋白的轻微上调。该抑制剂没有改变OVCAR-3细胞中小窝蛋白-1的表达，也没有观察到LY294002对PI-3激酶的抑制作用。
Caveolin-1的表达可以在OAW42中重建(一)和OVCAR-3(b条)用DNA甲基化抑制剂5-aza-2′脱氧胞苷（5-aza）和组蛋白脱乙酰酶抑制剂TSA治疗卵巢癌细胞。用未处理细胞制备的提取物进行Western blot分析(车道1)，与50μmol/L PD98059孵育72小时后(车道2)，含10μmol/L LY294002(车道3)，含5μmol/L 5-氮杂-2′脱氧胞苷(车道4)，含25 ng/ml TSA(车道5)联合5-aza-2′脱氧胞苷和TSA（5μmol/L，25 ng/ml；车道6)使用溶剂乙醇（E，车道7)或二甲基亚砜（D，车道8).抄送：Northern印迹分析CAV1型用25 ng/ml TSA或5μmol/L 5-aza-2′脱氧胞苷孵育OVCAR-3和OAW42细胞后的mRNA表达。细胞在标准培养基（−）中与抑制剂或溶剂乙醇孵育72小时，然后制备RNA并与CAV1型-特定探针。28S和18S核糖体RNA显示为负载控制。
区分直接控制CAV1型基因和间接作用导致caveolin-1蛋白表达，我们用5-aza-2′脱氧胞苷和TSA处理相同细胞系后进行Northern blot分析。如图3c所示，抑制DNA甲基化导致空腔1OVCAR-3和OAW42细胞中的mRNA（图3c，分别比较车道1至3和车道5至7）。仅在OAW42细胞中，TSA抑制组蛋白脱乙酰化后，观察到mRNA表达的刺激，但在OVCAR-3细胞中没有观察到（图3c，分别比较车道1至4和车道5至8）。在这两种细胞系中，在蛋白水平上观察到的表达水平差异并没有在mRNA水平上完全反映出来。
强制表达CAV1降低卵巢癌细胞OVCAR-3的存活率
检查CAV1型在卵巢癌细胞的生长调节中，我们将该基因导入OVCAR-3细胞。在集落形成分析中，G418抗性克隆的生长CAV1型测量（pLNHX-cav）表达结构或控制载体（pLNHX）。CAV1型表达导致OVCAR-3细胞集落形成减少约70%（图4A）对转染pLNHX-cav质粒后获得的G418-耐药克隆的分析表明，这些克隆均未表达可检测到的小窝蛋白-1蛋白水平（数据未显示）。因此，我们使用了不同的CAV-1构建物（pc-CAV-V5），其中巨细胞病毒启动子在瞬时转染后诱导高水平的小窝蛋白-1表达（图4B）对携带pc-CAV-V5构建体的稳定克隆的选择显示，集落形成被抑制>90%，这表明高水平的小窝蛋白-1表达与OVCAR-3细胞的存活不相容（图4C）在这些实验中，我们注意到转染48小时后分离的细胞数量增加。当我们对用pc-CAV-V5构建体或空载体pc-V5瞬时转染的OVCAR-3细胞进行TUNEL分析时，与对照转染体相比，CAV-1转染细胞中凋亡细胞的数量显著增加（图4D）.
答：集落形成试验表明，通过表达小窝蛋白-1OVCAR-3细胞转染了小窝蛋白-1-表达载体（pLNHX-cav）或空载体（pL NHX）。在0.5 mg/ml G418中选择细胞，直到菌落可见。固定和染色后，对菌落进行计数，数值显示为菌落/烧瓶（75 cm2). 给出了四个独立实验的平均范围和SD。B类：短暂转染pc-CAV-V5后OVCAR-3细胞中caveolin-1蛋白的高表达。在制备蛋白提取物之前，用pc-CAV-V5、空质粒pc-V5或未转染（−）转染细胞。V5-epitope-tagged caveolin-1表达结构编码一个约32 kd的蛋白质。SKOV-3细胞作为阳性对照，肌动蛋白作为负荷对照。抄送：在OVCAR-3细胞中使用pc-CAV-V5构建物或空质粒pc-V5进行集落形成分析。选择抗Zeocin菌落2周，固定并染色。医生：pc-CAV-V5的过表达增加了OVCAR-3细胞的凋亡。用pc-CAV-V5（小窝蛋白-1）或空的pc-V5（载体）瞬时转染OVCAR-3细胞。48小时后进行DNA片段分析（TUNEL），并用二氨基苯吲哚（DAPI）对细胞核进行染色。箭头显示TUNEL染色的细胞，表明细胞凋亡。
因此，通过阵列杂交、免疫组织化学和转染研究获得的结果表明，小窝蛋白-1在人类卵巢上皮细胞的存活中具有重要作用。
讨论
这个CAV1型编码膜小泡主要成分和重要信号调节因子的基因在卵巢癌中持续下调RNA和蛋白质水平。在浆液性卵巢肿瘤中，我们观察到随着去分化程度的增加，蛋白表达逐渐减少。正常卵巢和大多数浆液性腺瘤表达的小窝蛋白-1水平相当，而所有分析的粘液性腺癌的小窝素-1表达均为完全阴性。这两种类型的卵巢肿瘤很可能是由不同的分子机制发展而来的KRAS公司突变在粘液性卵巢癌中更常见。23,24更重要的是，小野和同事们25发现浆液型和粘液型卵巢癌之间存在100多个差异表达基因。这表明CAV1型该基因属于一组较大的基因，优先参与浆液型卵巢上皮细胞的信号传导和生长控制。
除了空腔1在卵巢癌中表达下调，我们观察到CAV1型在乳腺、结肠、肺和胃源性肿瘤中使用匹配的肿瘤/正常阵列。这些观察结果证实了其他人发布的数据，14,26然而，由于检测到正常间充质细胞和内皮细胞中caveolin-1 mRNA和蛋白的高表达，因此在解读array衍生数据时必须谨慎就地.15使用免疫组织化学方法，我们证实了卵巢上皮细胞在肿瘤进展过程中小窝蛋白-1的表达缺失。在乳腺和肺等其他组织中，小窝蛋白-1蛋白在上皮细胞中的表达就地尚未演示。在正常休眠乳腺组织中，小窝蛋白-1的表达似乎仅限于肌上皮细胞，而分泌上皮细胞则为阴性17（Wiechen和Sers，未发表的观察结果）。此外，mRNA表达可能并不总是反映不同细胞类型内的蛋白质表达。因此，阵列杂交、免疫组织化学和功能分析的结合对于确定小窝蛋白-1在不同人类肿瘤生长调节中的作用至关重要。
CAV1型在从肾脏和前列腺制备的肿瘤衍生cDNA中发现上调，表明该基因在这些组织中的功能完全不同。Yang及其同事描述了小窝蛋白-1在前列腺癌进展中的作用，16世卫组织认为小窝蛋白-1蛋白在前列腺癌进展中发挥作用，并保护前列腺癌细胞免受Myc诱导的凋亡。16,27因此，根据细胞环境，小窝蛋白-1似乎具有相反的功能，导致生长抑制或生长促进。其他基因产物也有这种替代活性，例如RAS蛋白，通过使用类似的信号通路，可以诱导不同细胞类型的分化或转化。28尽管大多数卵巢癌细胞系和肿瘤表现出小窝蛋白-1的下调，但SKOV-3和ES-2细胞表达高水平的小窝蛋白-1，尽管它们的生长能力是无限的。这一看似矛盾的发现的一个解释是，这些细胞中酪氨酸14上小窝蛋白-1α亚型的磷酸化。小窝蛋白-1的生长因子依赖性磷酸化刺激其结合Grb7适配器蛋白的能力，从而以细胞类型特异性的方式促进凤尾鱼的非依赖性生长。21SKOV-3和ES-2卵巢癌细胞系显示出高水平的磷酸化小窝蛋白-1的观察结果允许两种潜在的解释：要么细胞已经发展出绕过小窝蛋白-1介导的生长抑制的机制，或者由于生长因子受体过度表达导致小窝蛋白-1的特异性磷酸化，导致这些细胞中的信号增强。
相反，在OVCAR-3细胞中CAV1型基因被抑制，caveolin-1过度表达导致细胞凋亡增加。caveolin-1对程序性细胞死亡的直接诱导尚未被描述，这是否是一种细胞类型特异性效应尚待研究。潜在的参与CAV1型最近在成纤维细胞和T24人膀胱癌细胞中发现了凋亡调控。抗sense介导的抑制CAV1型消除了这些细胞对凋亡刺激的敏感性。29,30LY294002对PI-3激酶途径的抑制恢复了这种敏感性，小窝蛋白-1的过度表达抑制了PI-3激酶的活性。OVCAR-3细胞的PI-3激酶活性水平升高31同时高水平表达caveolin-1可能会引发相互冲突的信号，导致细胞死亡。PI-3激酶途径的激活和AKT2型在相当大比例的卵巢癌中显示。31,32小窝蛋白-1通过干扰PI-3激酶活性在细胞凋亡敏化甚至诱导中的潜在作用表明小窝蛋白1在抑制卵巢癌发展中具有特殊作用。
编码小窝蛋白-1的基因位于人类染色体7q31.1上。22卵巢癌中检测到7q31.1杂合性缺失，33前列腺，34胃，35和肾脏，36暗示损失CAV1型在人类卵巢癌中。然而CAV1型未检测到该基因。17CpG岛甲基化CAV1型启动子区仅在人乳腺癌细胞系中观察到37但卵巢癌样本中没有。17这表明CAV1可能是一种II类肿瘤抑制基因。II类肿瘤抑制基因的特征是其表达受阻，而不是突变或缺失。38
我们用5-氮杂-2′脱氧胞苷治疗卵巢癌细胞株后获得的数据表明，卵巢癌细胞的调节区甲基化空腔1基因是一种抑制机制CAV1型持续的抑癌基因沉默是通过CpG甲基化和组蛋白去乙酰化的协同作用实现的。39因此，观察到5-aza-2′脱氧胞苷或组蛋白脱乙酰酶抑制剂TSA均可有效诱导小窝蛋白-1的表达。然而，对CAV1型对5-氮杂-2′脱氧胞苷和TSA反应的mRNA表达表明，主要是DNA去甲基化刺激了CAV1型OVCAR-3和OAW42细胞中的基因。在OAW42细胞中，组蛋白去乙酰化的抑制也可以激活CAV1型mRNA在一定程度上表达，在OVCAR-3细胞中不表达。对空腔1李和同事也描述了该基因40who研究了睾酮介导前列腺癌细胞小窝蛋白-1上调的机制。尽管小窝蛋白-1蛋白被睾酮显著上调CAV1型这种刺激的促进剂相当低。这些数据和我们自己的观察表明，除了启动子甲基化和组蛋白去乙酰化外，小窝蛋白-1基因和蛋白的表达可能在转录后水平上受到进一步调节。
总之，通过使用两种不同的cDNA阵列与人类组织制备的材料杂交，免疫组织化学分析和功能研究，我们已经确定CAV1型作为人类卵巢癌的一种强有力的候选抑癌基因。
致谢
我们感谢Jana Keil、Kathleen Skultty、Deborah Horn和Susanne Metzkow提供的技术援助；和Oleg Tchernitsa对手稿发表评论。
脚注
向Christine Sers，Schumannstr柏林洪堡大学Charité病理学研究所分子肿瘤病理学实验室提出转载请求。德国柏林D-10117，20/21。电子邮件：ed.etirahc@sres.enitsirhc
由Deutsche Krebshilfe（授予10-332-Scha1和10-1485-Wi2）和Deutsche-Forschungsgemeinschaft（授予Scha396/1-1）支持。
工具书类
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