神经母细胞瘤亚群中端粒酶逆转录酶mRNA交替剪接对端粒酶活性的调节

摘要

神经母细胞瘤是儿童最常见的颅外实体瘤。其生物学行为是众所周知的不可预测的，包括从自发退化到快速转移扩散的范围。1神经母细胞瘤的一个独特特征是其分化能力。事实上，在部分成神经细胞肿瘤中，成神经细胞成熟为神经节细胞会产生神经节成神经细胞瘤，并可能进一步发展为良性神经节神经瘤。细胞成熟的程度和显示分化迹象的肿瘤细胞的数量形成了各种分级方案的基础，2-6但疾病不同病程的决定因素基本上尚不清楚。

最近发现的端粒酶被认为在恶性肿瘤的发展和进展中起着重要作用。7,8由于复制机器无法合成染色体的最末端3′端，因此每个细胞分裂处的端粒长度逐渐减少，限制了正常体细胞的复制潜力。9因此，大多数癌细胞的持续无限制增殖将导致端粒严重磨损，从而导致染色体突变和细胞死亡。10,11为了补偿端粒DNA序列的丢失，核糖核酸酶端粒酶在某些情况下被激活，添加六聚核苷酸重复序列（TTAGGG）_n个到端粒。因此，端粒酶活性（TA）存在于更新组织和快速分裂的细胞中，即生殖系和恶性肿瘤中。因为TA可能存在于非肿瘤细胞和增生组织中，12-15它不能被视为一个真正的肿瘤标志物，甚至有人认为TA可能仅仅是一个增殖指标。16然而，最近的研究表明TA和细胞周期调节因子丢失之间存在关联，从而建立了与恶性肿瘤的新联系。17,18TA也被描述为神经母细胞瘤的预后标志物，高TA与侵袭性生物学行为相关。19-21然而，一些神经母细胞肿瘤似乎含有hTERT转录物，但没有显示明显的TA，这可能是限制这些肿瘤生长潜力的一种机制。

端粒酶很可能构成一个多蛋白复合物，其中三个基本成分已被确定：人类端粒酶逆转录酶（hTERT）、内部RNA链（hTR）和RNA结合蛋白（hTEP1）。hTR和hTERT基因已被克隆，22-25虽然已经鉴定出其他几种端粒酶相关蛋白，26,27hTR和hTERT足以重建TA体外.28,29尽管进行了深入的研究，但人们对TA的调节还不太了解。尽管hTR在大多数胚胎和成人细胞中都能检测到，22,30与TA密切相关的hTERT的表达似乎受到严格控制，但其潜在机制仍不清楚。最近，研究表明小时基因存在于人体组织中，23,31提示通过选择性剪接对TA进行转录后调节，这可能导致截短的蛋白质产物，并可能导致功能失调。这种机制可以解释在某些神经母细胞肿瘤中hTERT转录不一致而未检测到TA的现象。

有鉴于此，我们试图阐明神经母细胞肿瘤中不同hTERT剪接变异体和TA之间是否存在关系，以及TA是否与神经母细胞瘤的增殖状态相关。此外，我们还搜索了MYCN公司扩增被认为是神经母细胞肿瘤的主要预后因素之一。32

材料和方法

RNA分离和逆转录酶-聚合酶链反应（RT-PCR）

据制造商介绍，RNA是用变色试剂Trizol（马里兰州盖瑟斯堡生命科技公司）分离的。使用RNA PCR试剂盒（德国兰根Perkin Elmer）逆转录1μg总RNA，并按照制造商的建议进行PCR。我们使用1.25 U/50μl Amplitaq Gold（Perkin Elmer）作为聚合酶，聚合酶必须通过加热至95°C 10分钟激活。此过程避免了依赖于引物的PCR伪影。选择引物序列扩增含有逆转录酶活性基序的hTERT mRNA区域。23,35引物5′末端标记Fam（6-羧基荧光素，Perkin Elmer），引物序列：2164 5′gcctgagcttactttcaa 3′和2620 5′cgcaacagctttgtc 3′。31在68°C退火温度下进行40次扩增循环后，通过毛细管电泳（ABIprism 310，Perkin-Elmer）分析PCR产物。作为阳性对照，甘油醛-3-磷酸脱氢酶mRNA（GAPDH）与引物GAPDH-S:5′acgaccactttgtcaagctcat 3′和GAPDH-a:5′ggtacttattgatggtacatg 3′平行扩增30个周期，退火温度为60℃。PCR产物的验证通过自动化测序（ABPrism 310，Perkin Elmer）进行。

对匹配的福尔马林固定石蜡包埋肿瘤组织进行如下分析：从石蜡块上切下五个切片，每个10μm厚，并收集在1.5 ml无菌聚丙烯管中。通过两次更换二甲苯和两次更换无水乙醇（均来自德国德伊森霍芬Sigma）来清除石蜡。将剩余的组织颗粒风干，覆盖1 ml Trizol，并使用手持式机械设备（Ultra Turrax T8；IKA Labortechnik，Hohenstaufen，德国）均质。将组织裂解物在室温下放置一夜，然后按照上述方法进行RNA分离。RNA完整性通过GAPDH mRNA的RT-PCR扩增来确定。hTERT mRNA的两个不同区域并行扩增（图1）▶：引物hTERT 1784（5′cggagagtgtctggagcaa 3′）和1910（5′ggatgaagagtctgga 3′）扩增所有转录物中的145-bp片段，而引物hPERT 2172（5′tgtacttgaaggtggaggtgg 3′）及hTERT 2350目的是扩增全长hTERT转录物特有的200-bp片段。hTERT 1784/1910的退火温度为60°C，hTERT 2172/2350的退火温度则为68°C。

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图1。

具有编码逆转录酶基序1、2、A、B、C、D和E的序列的hTERT mRNA的示意图。35全长转录本（457 bp）显示在顶部α区的剪接导致mRNA的36个碱基的剪接，导致逆转录酶基序a的缺失。RT-PCR引物2164和2620侧翼包含α和β剪接位点的区域，扩增子的大小取决于转录物的类型。引物2172和2350在关键剪接位点内结合，仅扩增全长转录物，引物1784和1910扩增hTERT转录物，而不考虑交替剪接。

结果

患者的临床病理数据详见表1▶在38例成神经细胞肿瘤中，有19例在TRAP分析中显示TA。与L428细胞提取物相比，相对酶活性在0.1到18.5%之间。TA的缺乏并不是由于检测失败（例如，由于存在抑制剂），因为所有肿瘤细胞提取物都能看到内部扩增标准的定期扩增。此外，由于两个预处理样品中含有较高的TA，因此之前的化疗似乎对TA没有影响。分化良好的肿瘤，即Hughes的1级/节细胞神经母细胞瘤，TA很低或缺失，而我们系列中的一个节细胞神经瘤是端粒酶阴性的。然而，TA在分化程度较低的肿瘤（Hughes的2级或3级）中非常异质，表现为TA水平高或低，甚至完全没有活性。因此，休斯的成绩与助教之间没有统计上的显著相关性，而助教与岛田的成绩有相关性的趋势(P（P）=0.06（通过费希尔精确测试）。相反，与肿瘤分期的相关性并不明显。最高TA出现在局部（2期）神经母细胞瘤中，而一些晚期肿瘤没有或很少出现TA。

使用部分包含hTERT mRNA逆转录酶域的引物（2164和2620）进行RT-PCR实验（图1）▶在这个区域内，已经确定了两个剪接位点。α位点的剪接导致mRNA中36个碱基的缺失（碱基2186到2221），而β剪接导致转录本中182个碱基（碱基2342到2524）的丢失。α剪接位点的核苷酸丢失会导致保守逆转录酶基序A的部分消融，而β位点的剪接会导致基序B、C、D和E的丢失。由于其中一个保守逆转录酶基序的缺失足以消除酶的功能，这两个剪接位点转录本的完整性对TA至关重要。

为了分析福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤样本，使用了两对引物。引物1784和1910扩增每个hTERT信息，而引物2172和2350仅设计用于扩增全长转录物。这是通过选择跨越α-和β-剪接发生序列的引物结合位点实现的，从而阻止剪接hTERT转录物的扩增。在阳性反应的情况下，发现200 bp PCR产物，而引物1784和1910产生145 bp PCR产物。

26例肿瘤中含有hTERT mRNA，所有样本均为阳性，作为阳性对照的甘油醛-3-磷酸脱氢酶mRNA普遍表达（数据未显示）。20个福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤样品与新鲜冷冻的样品相比显示出相同的结果。使用引物2164和2620的RT-PCR在几乎所有含有hTERT mRNA转录物的肿瘤和L428细胞系中揭示了剪接变体（实例如图2和图3所示▶ ▶). 值得注意的是，β剪接转录物始终存在，而其他两个剪接变体是随机分布的。20个肿瘤中存在全长转录物，其中9个显示TA为1%或更高。八个缺乏全长hTERT转录物的肿瘤的TA水平低或检测不到。11例肿瘤包含全长转录本，其中6例TA较低，5例无TA。相比之下，一个肿瘤在没有hTERT转录物的情况下显示出非常低的TA。任何数量的TA与全长hTERT转录本的存在都具有高度显著的相关性(P（P）<0.0001（通过费希尔精确测试）。此外，全长hTERT转录物与高TA水平显著相关（等于或大于1%，P（P）= 0.001). 相比之下，hTERT剪接变异体的分布和TA水平都与患者诊断时的年龄无关。

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图2。

hTERT转录物的RT-PCR证明(左边)和TRAP分析结果(正确的)肿瘤细胞系L428的(A类和B类)，患者1(C类和D类)和患者4(E类和F类). 这个x个轴定义荧光强度年axis表示PCR片段的长度，单位为bp。存在全长hTERT转录本(A类和C类)与TA相关(B类和D类)，由特征性的6 bp阶梯显示，代表加长的模板引物TS。缺少全长转录本(E类)与端粒酶不活跃和TA缺失有关(F类). TRAP分析中分析的蛋白质量为1μg，但L428除外，L428使用了120 ng。内部放大标准峰为黑色。

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图3。

福尔马林固定石蜡包埋神经母细胞瘤样本中hTERT转录物的RT-PCR证明。车道1和2对应于案例4和车道3和4对应于案例1。引物hTERT 1784/1910扩增所有hTERT转录物共有的145-bp PCR产物(车道1和三)而引物hTERT 2172/2350扩增了全长转录物特有的200-bp区域。M、 分子量标记。

不同神经母细胞肿瘤的增殖状态差异很大。Ki-S5免疫标记显示，所有肿瘤样本中都存在异质性模式，在肿瘤边缘突出，肿瘤大部分偶尔出现增殖细胞簇。分化良好的肿瘤仅含有少量Ki-S5阳性细胞（通常<3%）。其他样品的标记指数在9%至57%之间。增殖活性显示出与TA相关的趋势(P（P）=0.06（根据Kruskal-Wallis测试），并且在较小程度上存在hTERT转录本(P（P）=0.16，Kruskal-Wallis检验）。

MYCN公司放大，如以下显示的多个核信号所示就地杂交，仅在六个肿瘤中发现，其中四个是Hughes的3级，而根据Shimada的分级，只有两个组织学不良。四个包含与高TA相关的全长hTERT转录本，一个显示没有检测到TA的全长转录本，还有一个同时缺少TA和hTERT的转录本。统计分析显示MYCN公司高TA放大(P（P）=0.019，Fisher精确测试），并且在较小程度上存在全长hTERT转录本(P（P）= 0.08).

我们进一步研究了TA或hTERT转录和剪接是否可以提供预后信息。高TA与局部复发、远处转移或肿瘤相关死亡率方面的疾病进展显著相关(P（P）=0.004，Fisher精确测试）。这对应于岛田在该系列中确定的等级的显著性水平(P（P）= 0.005). 然而，具有全长hTERT转录本的病例仅显示出不良预后的趋势(P（P）= 0.13). 由于本研究旨在对新鲜组织进行分析，以期了解基本的调节机制，因此随访期（中位数，12个月）可能太短，无法对临床结果进行自信的估计，因此，必须保留对结果的考虑。然而，我们的分析表明，高TA可能预示着疾病的早期进展。由于与其他预后因素的相关性有限，TA可能是神经母细胞瘤预后的真正独立指标。

讨论

在神经母细胞肿瘤中，TA的存在被认为预示着不良结果，19,21以前的研究表明TA和hTERT mRNA的转录之间有很强的统计相关性。20,21然而，研究发现，尽管存在hTERT转录物，但神经母细胞肿瘤的一个子集没有检测到TA，这表明存在转录后水平的调节。为了解决这个问题，我们对38例成神经细胞肿瘤进行了一项比较分析，通过RT-PCR测定TA与hTERT转录的关系。

由于包含了内部扩增标准，我们改良的TRAP测定实际上可以排除假阳性结果，脱蛋白步骤保证了足够的灵敏度。41此外，通过与L428细胞的逐步稀释蛋白质提取物生成的校准曲线进行比较，可以合理评估组织样品中的相对TA。36

总的来说，与L428提取物相比，神经母细胞肿瘤样品中的TA值较低，这可能反映了与细胞培养中的最佳营养供应相比，肿瘤中的生长条件较差。这就提出了高分类的问题与TA值低。由于我们观察到相对TA的光谱范围为0.1%到18.5%，我们根据之前的报告假设，极低的TA（<1%）低于端粒维持或伸长所需的阈值。42在此基础上，24%的肿瘤中存在显著的TA。

第一篇关于端粒酶与神经母细胞瘤预后的文章报道，96%未经治疗的神经母细胞肿瘤中存在TA。19然而，在我们的研究中，发病率低得多的患者不太可能是因为纳入了10名在诊断活检前接受细胞毒性治疗的患者，因为预处理似乎不会影响TA水平。21相反，我们可以假设上述观察结果受到假阳性结果的影响，因为它们很容易在原始TRAP分析中发生，因为PCR-衍生引物二聚体上的模板滑移。41在最近的研究中，29%21和80%20神经母细胞瘤中含有TA，前者的结果与我们的观察结果一致。

然而，值得注意的是，与其他癌症（尤其是癌症）相比，端粒酶阳性神经母细胞瘤的比例相当小。7,8这可能是由于神经母细胞肿瘤倾向于分化甚至自发退化，这可能反映了在缺乏抵抗端粒磨损的机制的情况下无法维持肿瘤细胞增殖。根据这些反映，可以很好地想象TA的差异调节可能是神经母细胞肿瘤生物学行为的主要决定因素。在我们的研究中，TA与临床分期或组织病理学肿瘤分级之间没有明确的相关性。然而，分化良好的肿瘤（神经节神经母细胞瘤和神经节神经瘤）几乎没有表现出任何TA，这支持了上述考虑。

通过RT-PCR寻找hTERT转录物及其剪接变体，我们在38例肿瘤中的28例中发现了hTERT的转录。有趣的是，我们系列中的八个肿瘤缺乏全长hTERT转录物，这让人想起胚胎发育期间某些组织类型中的现象。31在妊娠后期，全长hTERT转录物似乎被剪接变异体取代，剪接变种跨越逆转录酶基序的区域发生改变。最近，在正常和肿瘤性卵巢组织、子宫内膜和子宫肌层中也观察到类似的替代转录物。43这些截短的表格在没有完整的抄本的情况下无法生成TA，这与体外实验表明，β-缺失变体无法重建具有功能的端粒酶复合物。28尽管各种剪接变异体可能在hTERT表达细胞中普遍存在，但缺乏全长转录物主要局限于非肿瘤组织。因此，作者得出结论，hTERT mRNA的交替剪接可能在转录后水平上构成TA的调节机制，这可能会随着恶性转化而丢失。43

尽管我们的观察结果支持这一观点，但它们还为恶性肿瘤中这种生理机制的偶尔维持提供了证据。在8个缺乏全长转录物的肿瘤中，TA缺失或至少远低于1%，表明除转录外，hTERT mRNA的差异剪接对神经母细胞肿瘤中的TA有显著影响，这确定了这些肿瘤中的一种新的调节机制。因此，我们很容易推测胚胎生命的调控机制在一定程度上可能在神经母细胞肿瘤中被保存。虽然我们无法在hTERT选择性剪接和患者年龄之间建立显著的整体相关性，但hTERT转录物截短的患者的中位年龄为14.4个月。该观察结果表明，hTERT mRNA交替剪接对TA的负调控可能持续到婴儿早期，因此可能解释了1.5岁以下儿童神经母细胞瘤的良好生物学行为。3,44

从我们的数据中可以看出，全长hTERT转录物对于显著TA的增强是不可或缺的。因此，缺乏全长转录物与TA含量低或缺失之间的明显相关性可以解释TA与其他人观察到的hTERT转录物之间的差异。20,21由于在这些分析中使用了扩增所有类型hTERT转录物的引物，变异转录物不可避免地逃脱检测。然而，我们系列中的五个肿瘤转录了具有完整逆转录酶基序的hTERT mRNA，而缺乏可检测的TA。与之前的观察结果一致，43这提示了额外的调节机制，例如，通过某些蛋白质亚基的磷酸化或去磷酸化进行的翻译后修饰，45-48或者可能是hTERT的RT基序之外的截断。49

这种明显差异的另一个原因可能是全长hTERT的表达水平（本研究中未研究）可能调节TA。这一观点将得到全长hTERT转录本与本系列中可检测到的TA的密切关联的支持(P（P）< 0.0001). 事实上，初步数据显示hTERT mRNA水平和TA之间存在良好的相关性。23,24,50此外，在淋巴细胞中检测到功能性hTERT mRNA，与TA的程度无关51以及正常的端粒酶阴性组织，如人脑、肝脏、前列腺、心脏和初级成纤维细胞。52因此有人建议15具有在某种刺激下增殖能力的细胞，例如抗原刺激的淋巴细胞，组成性地表达少量hTERT mRNA，这在恶性细胞中会显著上调。

几项研究表明，TA与正常组织和癌症的增殖活性密切相关。16,17,36因此，我们通过抗Ki-67蛋白的单克隆抗体（Ki-S5）测定了肿瘤生长分数，Ki-67蛋白在来自G₁通过划分周期的M阶段。53然而，尽管与TA的相关性较弱，但高Ki-S5标记指数单独对端粒酶激活既不必要也不充分，如4号和17号病例中Ki-S5高标记指数和无TA所示（表1）▶这可以通过包含G来解释₁Ki-67标记的阶段，因为最近的结果表明端粒酶在G₁/S过渡。54虽然我们的观察结果反对端粒酶仅仅是一种增殖标记物，但几条证据指出了TA与细胞周期放松调控之间的关系。16,17,55

在这方面，MYCN公司扩增值得考虑，因为hTERT启动子包含转录因子MYCN的结合位点。56根据最近的调查，57我们观察到MYCN公司副本号和TA。六个肿瘤中MYCN公司扩增，五个包含全长hTERT转录本，四个显示显著的TA，表明MYCN实际上可能会处理私有hTERT，而其他因素可能最终调节其活性。

我们的研究表明，TA在神经母细胞肿瘤中至少有一种新的调节机制，可能具有较高的生物学相关性。虽然这项研究不可能设计用于测试临床病理相关性，但我们的初步分析指出了TA对预后的影响。然而，TA的评估需要新鲜或保存良好的冷冻组织，在大多数情况下病理学家无法获得。由于高TA明显需要存在全长hTERT转录物，因此快速简便的RT-PCR方法非常适合档案标本的分析，可能为在大样本量和长期随访的回顾性研究中评估TA在成神经细胞肿瘤中的预后价值提供新的依据。鉴于部分带有全长转录物的样本中缺乏大量TA，可能需要使用实时PCR对hTERT转录物进行定量分析，以确定酶活性可检测的阈值水平。

脚注

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