《美国病理学杂志》。1999年8月；155(2): 421–428.
人视网膜色素上皮分泌的极化血管内皮生长因子及其受体在绒毛膜毛细血管内的定位
营养副分泌关系的证据
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Harriët G.t.Blaauwgeers公司
荷兰阿姆斯特丹阿姆斯特丹大学学术医学中心；高比乌斯实验室，‡
雨果·拉特
荷兰阿姆斯特丹阿姆斯特丹大学学术医学中心；高比乌斯实验室，‡
安东内拉·维特默
荷兰阿姆斯特丹阿姆斯特丹大学学术医学中心；高比乌斯实验室，‡
泰纳·A·帕塔南
芬兰赫尔辛基赫尔辛基大学哈特曼研究所；和眼科免疫科，†
卡里·阿利塔罗
芬兰赫尔辛基赫尔辛基大学哈特曼研究所；和眼科免疫科，†
艾泽·基伊斯特拉
荷兰阿姆斯特丹阿姆斯特丹大学学术医学中心；高比乌斯实验室，‡
雷尼尔·O·施林格曼
荷兰阿姆斯特丹阿姆斯特丹大学学术医学中心；高比乌斯实验室，‡
来自眼科，*
荷兰阿姆斯特丹阿姆斯特丹大学学术医学中心；高比乌斯实验室，‡
荷兰莱顿；病理科，§
芬兰赫尔辛基赫尔辛基大学哈特曼研究所；和眼科免疫科，†
荷兰阿姆斯特丹眼科研究所
摘要
视网膜色素上皮（RPE）维持正常眼的脉络膜毛细血管（CC），并参与年龄相关性黄斑变性脉络膜新生血管的发病机制。血管内皮生长因子-A（VEGF）由分化的人RPE细胞产生在体外和体内并且可能参与RPE和CC之间的旁分泌信号传导。我们研究了RPE细胞是否存在VEGF的极化分泌在体外此外，还研究了VEGF受体在人类视网膜中的定位。我们观察到，高分化的人RPE细胞在常氧条件下培养在跨孔滤膜上，与顶端细胞相比，向基底外侧细胞产生的VEGF增加了2-7倍。在缺氧条件下，VEGF-A的分泌仅增加到基底侧，导致基底外侧分泌增加3至10倍。通过对30只人眼和2只食蟹猴眼进行免疫组织化学染色，KDR（VEGFR-2）和flt-4（VEGFR3）优先定位于CC内皮面向RPE细胞层的一侧，而flt-1（VEGFR1）则位于CC内部和其他脉络膜血管上。我们的结果表明，RPE向其基底侧分泌VEGF，其受体KDR位于相邻的CC内皮细胞上，表明VEGF在旁分泌关系中的作用，可能与flt-4及其配体协同作用。这可以解释RPE在维持CC及其有窗通透性表型中已知的营养功能，并指出VEGF在正常眼功能中的作用。RPE在缺氧或VEGF生成极性丧失时上调基底外侧VEGF分泌，可能在脉络膜新生血管的发病机制中发挥作用。
视网膜色素上皮（RPE）在正常眼和病理条件下都具有重要功能。实验证据表明，RPE参与了脉络膜新生血管（CNV）的发病机制，CNV发生在各种眼部疾病如年龄相关性黄斑变性（AMD）的过程中。1-4在正常健康条件下，RPE在维持高血管化、高通透性有窗脉络膜毛细血管（CC）的外基底层方面具有积极的存活效果，而其内部的感光层则完全无血管。脉络膜血管的解剖和RPE侧CC窗的优先定位也表明了RPE对CC的调节作用。此外，AMD和实验动物研究的临床观察表明，缺乏RPE可导致脉络膜毛细血管继发性萎缩。1-3
另一方面，在CNV过程中，观察到RPE细胞包裹新血管，其基底侧朝向内皮细胞，这与进一步血管生长的停止相吻合。4这些形态学观察体内提示RPE具有控制CNV的功能。
根据这些观察，RPE似乎在与CC的相互作用中具有双重作用，但RPE/CC微单元的完整性在健康条件下是如何调节的，感光层是如何保持无血管状态的，为什么RPE层的病理变化导致脉络膜萎缩或脉络膜的血管生成反应，目前尚不清楚。然而，介体分子很可能在这些细胞间的相互作用中发挥重要作用。
以前曾在组成细胞的细胞培养中研究过这种相互作用，但从这些研究中出现了相互矛盾的结果。然而一些作者能够证明RPE细胞在体外产生内皮细胞增殖抑制剂，5其他人在RPE条件培养基中发现内皮细胞有丝分裂活性。6
我们假设生长/抑制因子的极化分泌可能解释了这些明显的矛盾体内和在体外观察。RPE产生的生长因子在体外包括血小板衍生生长因子-BB、转化生长因子-β和血管内皮生长因子-A（VEGF）。7血管内皮生长因子（VEGF）是一种血管通透性和血管生成因子，是维持CC的良好候选因子。研究表明，VEGF通过诱导开窗内皮表型，部分增加皮肤和肌肉的血管通透率。8此外，它还可以作为血管存活因子体内.9RPE与CC内皮细胞共培养实验在体外RPE衍生的VEGF可刺激下层内皮细胞的管形成。10
本研究的目的是评估培养的人RPE细胞分泌VEGF的极性，并研究VEGF受体的定位就地在人和猴眼组织切片中。
材料和方法
RPE细胞培养
从阿姆斯特丹科纳班克获得的四只人类捐赠者眼睛（捐赠者年龄：9、15、17和24岁）被用作初级RPE细胞的来源。在死后24小时内分离出RPE细胞（进一步称为RPE细胞系）。11按照Holtkamp等人的描述分离RPE细胞11简而言之，角膜、眼前段、视神经、玻璃体和神经视网膜从眼睛中取出，RPE细胞在37°C下通过两次培养用胰蛋白酶从眼睛中分离出来。从第二次培养中获得的细胞在10时被置于24孔板（Costar，Cambridge，MA）中5Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM）（Gibco BRL）中的细胞/孔，补充20%胎牛血清（FCS）（Gibco BRL，青霉素（100 U/ml；Gibco BREL）和链霉素（100 mg/ml；Gibco-BRL）。2天后，通过清洗和刷新培养基去除非粘附细胞。在汇合处，通过胰蛋白酶处理分离细胞，并以约4×10的体积传递到培养瓶中4细胞/厘米2对于本实验，在第6代和第11代之间使用RPE细胞。为了研究RPE细胞系在分离过程中是否未受到污染，对细胞进行了形态学和免疫组织化学分析。
对于免疫组织化学，细胞培养在组织腔载玻片上（Lab-tek；Nunc，Naperville，IL），并用细胞角蛋白8/18特异性抗体（CAM 5:2；Beckton-Dickinson，San Jose，CA）或葡萄糖转运蛋白-1特异性抗体进行染色（瑞典乌普萨拉乌普萨拉大学L.Andersson赠送）。作为阴性对照，使用针对非人类细菌蛋白的抗体（小鼠阴性对照免疫球蛋白；DAKO）。
所有细胞在37°C和5%CO下培养2。媒体每周更换两次。
Transwell过滤器上的RPE细胞单层
根据Holtkamp等人的方法，RPE细胞在transwell过滤器（直径12 mm，孔径0.4 mm；Costar）上培养。11简单地说，用160 ml 1:40稀释的Matrigel（协作生物医药产品，马萨诸塞州贝德福德）在滤纸上涂布，并风干过夜。将RPE细胞系接种为1.6×105细胞/厘米2200毫升/过滤器，添加1%正常人血清（NHS）的IMDM（荷兰阿姆斯特丹CLB）。在下部隔室中，添加了1000 ml培养基，从而使液位高度保持水平，以防止静水压力。2天后，将IMDM/1%NHS添加到上部室最终体积750 ml和下部室最终体积1500 ml中。
使用Endohm室和欧姆计（佛罗里达州萨拉索塔市世界精密仪器公司）每周测量一次跨上皮电阻（TER）。通过减去无细胞基质涂层过滤器的TER值，对TER测量值进行背景校正。电镀约3周后，使用RPE单层过滤器进行实验。
Transwell滤光片上RPE细胞单层的显微镜观察
通过光学显微镜检查滤光片上可能形成的RPE细胞多层。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗过滤器，并将其冷冻在N液体中2，嵌入Tissue-Tek（Miles，Elkhart，in）中，切成10-μm厚的切片，在丙酮中固定5分钟，然后风干。切片用苏木精染色10分钟，然后用伊红染色1分钟。
通过免疫荧光显微镜检测紧密连接的存在。过滤器用PBS（pH 7.4）清洗，用4%多聚甲醛固定，再用PBS清洗，用0.2%Triton X-100培养15分钟使其渗透，用5%正常山羊血清封闭（Jackson Lab），并用抗紧密连接相关蛋白ZO-1的多克隆抗体培养（Zymed Laboratories，San Francisco，CA；1:200）持续1小时。用PBS清洗后，用异硫氰酸荧光素结合猪抗兔免疫球蛋白（Nordic，El Toro，CA；1:100）将过滤器孵育1小时，再次在PBS中清洗，并在荧光显微镜（Leica）中观察之前用vectashide密封。
如前所述，11用电子显微镜（EM）分析RPE细胞单层的完整性。为了扫描EM，用Hanks的缓冲盐溶液清洗过滤器，然后将细胞固定在含有1%戊二醛和1.25%多聚甲醛（pH 7.3）的80 mmol/L二甲氨基甲酸缓冲溶液中。固定几天后，过滤器用乙醇脱水，临界点用一氧化碳干燥2作为中间产物，并涂有几纳米铂。使用飞利浦SEM 505扫描电子显微镜（荷兰埃因霍温飞利浦工业公司）和二次发射检测器对过滤器进行检查和显微照相。
对于传输EM，滤波器在OsO中后置4，在一系列分级乙醇中脱水，并嵌入Epon中。超薄切片被切割，用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色，并在配备EDAX PV9800系统和超薄窗口检测器（EDAX PV9760/53）的飞利浦EM 400电子显微镜（飞利浦工业公司）上进行检查和拍照。
Transwell过滤器上RPE细胞单层VEGF的分泌
实验使用12个跨阱过滤器进行，每个供体的RPE细胞汇合在一起。在实验之前，从48个过滤器中取出培养基，用含有1%NHS的新鲜培养基替换。过滤器在正常生长条件下培养（24个过滤器，37°C，20%O2，5%一氧化碳2，潮湿环境）或缺氧条件下（24个过滤器，37°C，1%O2，5%一氧化碳224小时（24个过滤器）或48小时（24过滤器）。因此，对所研究的四种条件中的每一种都进行了三次测试。24小时或48小时后，从上部和下部隔室收集培养基，进行snap冷冻，并在−20°C下储存，直至进一步分析。
根据制造商的说明，通过酶联免疫吸附试验（英国阿宾顿研发系统公司）测定RPE细胞向基底或顶端的VEGF生成水平。每种培养基样品均进行了三次测试。
统计分析
对于统计数据分析，独立样本t吨-检验是在通过Levene方差相等检验（SPSS软件，SPSS Gorinchem，荷兰）调查方差相等后使用的。
人类和灵长类组织样本
在死亡后5至15小时内，从阿姆斯特丹科纳班克采集了30名无已知眼病患者的眼睛。此外，两只食蟹猴的新鲜正常眼睛(束状猕猴)由荷兰奈梅亨大学提供。本研究中的所有动物实验均按照ARVO《关于在眼科和视力研究中使用动物的决议》进行。解剖后段标本。所有组织均经snap冷冻并储存在−70°C。
免疫组织化学
将气干冰冻切片（10μm）在冷丙酮中固定10分钟，然后用Zamboni固定剂（饱和苦味酸溶液中的2%多聚甲醛）固定2分钟，并通过间接免疫过氧化物酶程序进行染色。为了减少非特异性染色，将切片在PBS中的10%正常山羊血清（宾夕法尼亚州西格罗夫Jacksons Immuno-Research Laboratories，West Grove；目录号005-000-121）中预孵育15分钟，然后在4°C下与以下抗体孵育过夜：抗内皮细胞单克隆抗体（mAb）PAL-E（1:1000）、抗血管内皮生长因子受体KDR、，抗血管内皮生长因子受体flt-1（均为德国布伦瑞克38124 GBF基因表达系H.a.Weich博士的赠礼；1:200）和抗血管内皮生长因子受体flt-4（在芬兰赫尔辛基赫尔辛基大学哈特曼研究所培养；1:400）。根据制造商的说明，对切片进行清洗，并与随后的敏感的基于亲和素-生物素的组织染色+试剂盒（Zymed 85–9043）的化合物一起培养。再次清洗切片，并使用含有0.01%H的3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）进行染色2O（运行）2.12用H冲洗各部分，终止反应2O.用苏木精进行反染色。将切片清洗并安装在甘油/甘油（Sigma；GG-1）中。在对照组中，省略了第一个抗体。
所有部分都由两名独立观察员进行了蒙面检查。微血管染色分级如下：无染色（−）、弱染色（±）或明显染色（+）。
结果
Transwell过滤器上RPE培养物的特性
在植入跨孔滤光片（每个供体12个滤光片）后，人视网膜色素上皮（RPE）细胞单层（传代6至11）的TER逐渐增加。无电池的矩阵涂层过滤器的TER为15欧姆·厘米2.大约3周后达到最大净TER。四种RPE细胞系的TER范围为30±1.2至100±4.3欧姆·厘米2但在每个细胞系内几乎没有变化（图1）.
跨上皮电阻（TER）（欧姆·厘米2±SD）的四个供体A、B、C和D的RPE细胞，在transwell过滤器上培养3周（每根棒代表12个过滤器）。
通过滤光器横截面的光学显微镜检查验证了RPE单层的完整性（图2A）透射电子显微镜研究显示，在跨阱系统上部腔室的一侧有一层细胞，具有微绒毛和紧密连接（图2B）以及细胞下侧和滤膜之间的基底膜物质沉积，表明上部隔室代表RPE单层的顶部（“视网膜”）侧，下部隔室代表基底（“脉络膜”）侧。紧密连接相关蛋白ZO-1的细胞层免疫荧光染色表明存在紧密连接复合物。ZO-1存在于每个细胞周围的一个水平，在两个低（35欧姆·厘米）的细胞系中2，图2C)和高（100欧姆·厘米2，图2D)TER公司。ZO-1染色还显示，对于所有四种RPE细胞系，过滤器上的细胞密度相似（约106细胞/孔）。综上所述，这些结果表明培养的RPE细胞与分化的静止RPE非常相似体内.
在transwell过滤器上培养3周的RPE单层的特性。一：RPE细胞单层（供体B）的光学显微镜，苏木精-伊红染色。B类：RPE细胞单层顶端的电子显微镜。注意顶端微绒毛的存在以及细胞之间的结构（表示为箭头)表明存在紧密连接。C类和D类：供体B RPE细胞单层的免疫荧光显微镜（低TER:35 Ohm·cm2) (C类)和施主D（高TER:100欧姆·厘米2) (D类)对紧密连接相关蛋白ZO-1进行染色。注意细胞间连接处的ZO-1染色。
RPE细胞系在常氧和缺氧培养条件下产生VEGF
RPE细胞系在正常培养条件下（20%O）产生血管内皮生长因子-A（VEGF）2，5%一氧化碳2). VEGF的总生成量在不同RPE细胞系之间存在差异，从1056±64到7410±456 pg/过滤器（106细胞）（24小时培养）（图3）有趣的是，四种RPE细胞系的TER值与总VEGF生成量相关（比较图1和图3 ).
24小时内，四名供体A、B、C和D的RPE细胞在transwell滤器上培养3周（每个滤器代表三个滤器），分泌的VEGF总量（基底侧和顶端侧合计，±SE的平均值）。
所有检查滤过物中的VEGF分泌高度极化。无论是在缺氧还是在常氧条件下，还是在这两个时间点，这对每个供体都具有统计学意义(P（P）< 0.05). 在正常氧条件下，在两个时间点，细胞基底侧的VEGF积累量是顶端侧的两到七倍（图4）当RPE单分子膜保持在缺氧条件下（1%O2，5%一氧化碳2)，VEGF的生成在基底侧增加了1.3到1.5倍，而在根尖侧则少得多。24小时时，供体B、C和D的基础增加（因此极化更高）具有统计学意义(P（P）<0.05，图4). 因此，在缺氧条件下，向基底侧分泌的VEGF量是向顶端侧分泌量的3–10倍。
正常（37°C，20%O2，5%一氧化碳2，潮湿环境）和缺氧（37°C，1%O2，5%一氧化碳2，潮湿环境）条件下（每根棒代表三个过滤器）。注意，基底侧的VEGF分泌高于顶端侧（在所有情况下均具有统计学意义，P（P）< 0.05). 在缺氧条件下，VEGF分泌较高，主要是基底侧（统计显著性由*表示=P（P）<0.05和**=P（P）< 0.01).
VEGF受体KDR、flt-1和flt-4在人眼和猴眼的定位
用抗血管内皮生长因子受体flt-1（VEGFR-1）、KDR（VEGFR2）和flt-4（VEGFR3）的抗体对30只人类供体眼和两只猴眼的视网膜和脉络膜进行染色，并用开窗内皮标记物PAL-E进行染色。用PAL-E抗体染色，可以清楚地勾勒出人类供体眼和猴眼中脉络膜毛细血管的内皮细胞以及其他脉络膜血管内皮细胞的轮廓（图5A）用抗血管内皮生长因子受体KDR和flt-4抗体对切片进行染色，显示出人类和猴子眼睛中脉络膜毛细血管的特殊染色模式（图5、C和D）仅在绒毛膜毛细血管内皮面向RPE的一侧观察到KDR和flt-4的颗粒染色。在脉络膜毛细血管的巩膜侧和较大的脉络膜血管中，仅观察到KDR和flt-4的零星染色（图5，C和D）邻近视网膜的微血管结构为阴性。绒毛膜毛细血管中flt-4的染色比KDR更为明显。相反，抗flt-1抗体染色显示，除了内部CC的显著染色外，其他脉络膜血管的染色较弱（图5B）整个视网膜微血管的染色模式表明内皮细胞和周细胞都表达该受体（结果未显示）。
用单克隆抗体PAL-E对人脉络膜冰冻组织切片进行免疫过氧化物酶染色，识别有窗内皮(一)和识别VEGFR-1（flt-1）的抗体(B类)，VEGFR-2（KDR）(C类)和VEGFR-3（flt-4）(D类). 注意整个脉络膜毛细血管和其他脉络膜血管PAL-E的强烈染色(一)与RPE细胞层一侧绒毛膜毛细血管VEGFR-2（KDR）的局部染色相反(C类)和VEGFR-3（flt-4）(D类). VEGFR-1（flt-1）染色可见于内CC和脉络膜大血管(B类). 血管结构的着色显示为箭头.
讨论
本研究表明，培养的人RPE细胞的致密单层优先向基底（脉络膜）侧分泌VEGF-A。此外，在人类和猴的眼部组织切片中，发现VEGF受体KDR和flt-4特异性地位于脉络膜毛细血管内皮面向RPE的视网膜侧，而flt-1的分布更为广泛。这些发现表明，VEGF参与了脉络膜毛细血管和RPE之间的旁分泌关系，这可能有助于解释众所周知的RPE在维持绒毛膜毛细血管存活和开窗形态方面的作用。此外，这些发现可能对理解CNV的发病机制具有重要意义。
几位作者之前已经证明，培养的人RPE细胞产生VEGF和其他生长因子。7,13-18事实上，在RPE条件培养基中，VEGF被发现对内皮细胞的大多数（如果不是全部）有丝分裂活性负责。6 体内RPE细胞在眼创伤愈合和增殖性玻璃体视网膜病变中具有去分化和多能干细胞的作用。因此，有人可能会认为人类RPE细胞在体外由于特定的培养条件而产生VEGF，这可能诱导细胞的“损伤型”表型，与观察到的表型相当体内在伤口愈合和其他病理条件下。然而，有几个体内研究表明，在休息的正常眼睛中，1,6,17,18VEGF由RPE细胞组成，表明生长因子在眼睛中具有生理作用。此外，在我们的四种不同RPE细胞系中，TER较高的细胞系产生了较高数量的VEGF。这可能表明RPE细胞分化程度较高在体外如较高的TER所反映的，19导致较高的VEGF生成。在这些TER最高的致密RPE单层中，VEGF分泌也最为极化，基底侧产生的VEGF是顶端侧的10倍。上一个在体外研究发现RPE细胞分泌0.6到70 ng VEGF/106细胞。6,20这与我们的结果有很好的相关性，因为在低氧条件下，RPE条件培养基中发现的VEGF浓度范围从心尖侧的0.2 ng/ml到基底侧的11 ng/ml。正如在培养内皮细胞的实验中观察到的那样，这些VEGF浓度处于生物活性范围。21-23从这些实验中，VEGF已经成为一种重要的通透性和血管生成因子。21-23 体外，VEGF对内皮细胞有丝分裂并刺激其迁移。注射时体内进入肌肉或皮肤后，它会在这些组织的连续内皮中迅速诱导内皮开窗。8在其他情况下，如在发育中的视网膜中，VEGF被证明是内皮细胞的存活因子。9
脉络膜毛细血管和RPE之间的关系一直是临床医生和基础科学家关注的焦点。从解剖学上讲，脉络膜血管丛是朝RPE方向建模的，好像被某种神秘的力量吸引到了RPE上。此外，脉络膜毛细血管内皮细胞仅在面向RPE的一侧有开窗。临床观察也清楚地表明，在地理年龄相关性黄斑变性（AMD）和其他情况下RPE丢失后，脉络膜毛细血管将消失。24,25动物模型也表明，RPE的丢失导致脉络膜毛细血管萎缩，之前是内皮开窗的丢失。2,26所有这些数据都表明RPE对脉络膜毛细血管有强烈的调节作用。
根据培养的RPE产生的VEGF的观察结果，以前有人认为VEGF可能参与了这方面的研究。此外，在共培养实验中，来自RPE单层的VEGF诱导了I型胶原凝胶中底层内皮细胞的毛细血管形成。三然而，这些研究并未明确RPE细胞的分化程度或VEGF的分泌方向。事实上，这些结果令人困惑，因为当RPE向视网膜分泌VEGF时体内，这有望诱导视网膜新生血管。最近在一个由感光细胞产生构成性VEGF的转基因小鼠模型中发现了这种新生血管。27然而，在正常的眼睛中，外层视网膜当然是完全无血管的。本研究中的数据表明，RPE的VEGF组成性分泌体内可能高度极化，仅限于基底脉络膜侧。
我们的观察结果表明，VEGF参与了RPE和脉络膜毛细血管之间的生理旁分泌关系。VEGFR-2，KDR在面向RPE细胞基底侧的绒毛膜毛细血管内的特异性定位进一步支持了这一观点，因为这些细胞表达VEGFR-2将允许VEGF-A发出旁分泌信号。相反，在脉络膜和视网膜的其他血管中也发现了VEGFR-1，flt-1的免疫组织化学染色，这一模式暗示了内皮细胞和周细胞染色。有人认为这两种VEGF受体（KDR和flt-1）介导VEGF-A的不同功能。28因此，组织中受体的差异表达可能会调节VEGF-A的活性。VEGF受体家族的第三个成员flt-4使用其他基因产物VEGF-C和VEGF-D作为配体，而其对VEGF-A的亲和力可以忽略不计。29,30我们发现flt-4存在于含有KDR的绒毛膜毛细血管的血管段中，这表明不同类型的VEGF分子之间可能存在协同作用。然而，RPE细胞是否真的产生VEGF-C或VEGF-D尚不清楚。
鉴于VEGF对内皮细胞的已知作用体内和在体外，VEGF在RPE对脉络膜毛细血管的营养影响以及诱导其高度渗透性表型方面可能非常重要，这可以通过位于脉络膜毛细血管RPE侧的丰富窗孔反映出来。31最近，罗伯茨和帕拉德8和Esser等人32发现VEGF能够诱导内皮开窗体内和在体外同样，RPE细胞向基底侧分泌VEGF可诱导脉络膜毛细血管开窗。VEGF-A的分泌是否充足或VEGF-A和VEGF-C或其他因素是否协同作用尚待解决。最近的一项研究表明，这种协同作用存在于内皮细胞增殖和导管形成中在体外.33此外，VEGF受体KDR和flt-4主要定位于脉络膜毛细血管的RPE侧，为现有血管提供选择性反应区域。通过这种旁分泌机制，RPE细胞分泌的VEGF也可能作为绒毛膜毛细血管的营养因子。
这些发现也可能对理解AMD中脉络膜新生血管的发病机制具有重要意义。据报道，在衰老和AMD患者中，绒毛膜毛细血管萎缩，Bruch膜厚度增加，对VEGF等水溶性化合物相对不渗透。34,35可以推测，布鲁赫膜的后一种变化不仅可能导致因到达脉络膜的VEGF数量不足而导致CC萎缩，而且可能导致VEGF在RPE基底侧积聚，正如在AMD免疫组化研究中确实观察到的那样。36在RPE下，VEGF可能达到临界浓度并诱导CNV。由于我们观察到RPE细胞在缺氧条件下上调基底外侧血管内皮生长因子的生成，局部缺氧可能进一步增强这种机制。事实上，由于CC萎缩和Bruch膜增厚，AMD患者出现了相对的视网膜外缺氧。34,36在CNV的其他情况下，RPE单层的缺陷可能导致分泌的VEGF方向错误，继而导致典型的视网膜下新生血管。
致谢
作者感谢伦敦大学学院眼科研究所病理学系的P.J.Luthert博士和J.Greenwood博士在启动这些研究时提出的有益建议；N.Bakker、E.M.Danzmann和A.A.Put准备照片；W.Kamphuis博士的有益建议；E.Pels博士和她的同事们在阿姆斯特丹科纳班克提供了人类眼组织；捐赠者及其亲属的慷慨；以及BIS/Eurotransplance协助获取组织。
脚注
向荷兰阿姆斯特丹1100 DD，邮政信箱22660，学术医学中心眼科R.O.Schlingemann博士发送转载请求。电子邮件：.ln.avu.cma@nnamegnilhcs.r
由Stichting Blindenhulp、荷兰糖尿病基金会（拨款95.103）、Praeventiefonds（拨款26-1822-3）、Edward en Marianne Blaauwfonds和Stichtin“De Drie Lichten”资助
工具书类
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