转移性黑色素瘤患者T淋巴细胞干扰素信号通路的下调

将PBMC分类为淋巴细胞亚群

冷冻保存的PBMC解冻、广泛清洗，并在含有10%FBS的RPMI 1640中放置过夜。PBMC清洗并用CD56、CD16、CD8、CD3、CD4和CD19抗体染色（BD Biosciences，http://www.bdbiosciences.com; 和Caltag，网址：http://www.caltag.com)将PBMC清洗并重新悬浮在RPMI 50%FBS中30分钟，并置于冰上。使用BD-FACSAria流式细胞术将PBMC分类为CD8 T细胞（CD3⁺CD8（CD8）⁺CD4细胞⁻CD19型⁻CD56型⁻CD16型⁻)，CD4 T细胞（CD3⁺CD4细胞⁺CD8（CD8）⁻CD19型⁻CD56型⁻CD16型⁻)，B细胞（CD19⁺CD3（CD3）⁻CD8（CD8）⁻CD4细胞⁻CD16型⁻CD56型⁻)和CD56dim NK细胞（CD19⁻CD3（CD3）⁻CD56暗CD16⁺)使用中所示的闸门图S1本研究中使用的所有抗体均为荧光偶联的鼠抗人单克隆抗体（BD Biosciences和Caltag）。将200000个细胞分选成含有50%FBS的冰镇RPMI。分选后的细胞通过离心造粒，在1 ml TRIzol（Invitrogen，http://www.invitrogen.com网站)加上10μg线性丙烯酰胺，并储存在−80°C下。

总RNA的分离与检测

根据制造商的方案，从TRIzol匀浆中分离出总RNA，并将其重新悬浮在无RNase水中。使用无DNA试剂盒（Ambion，http://www.ambion.com网站)，根据制造商的协议。使用Nanodrop ND1000A分光光度计（Nanodrot Technologies，http://www.nanodrop.com)以及使用安捷伦2100生物分析仪（安捷伦科技，网址：http://www.agilent.com).

双色DNA微阵列的总淋巴细胞参考RNA

PBMC是从斯坦福血液中心的20名健康捐献者（10名男性，10名女性）中获得的，年龄从25岁到65岁不等。使用RosetteSep去除鸡尾酒从PBMC中去除粒细胞和单核细胞（Stemcell Technologies，http://www.stemcell.com网站). 取一份纯化淋巴细胞进行抗体染色以确定纯度。将细胞与CD3、CD56、CD16、CD8、CD4和CD19的荧光偶联单克隆鼠抗人抗体孵育30分钟，清洗，用流式细胞仪（FACS Calibur、BD Biosciences）分析，确定其为>99%的纯淋巴细胞。将其余纯化的淋巴细胞在10 ml TRIzol和50μg线性丙烯酰胺中均质化，并储存在−80°C下。分离出总的DNA-free RNA。将来自20个健康供者总淋巴细胞样本中每个样本的100μg总RNA进行混合，以生成总淋巴细胞参考RNA。

RNA的扩增和标记

使用氨基烯丙基MessageAmp II aRNA扩增试剂盒（Ambion，http://www.ambion.com网站). 扩增过程包括在体外转录期间将5-（3-氨基烯丙基）-UTP（aaUTP）并入aRNA中，以实现与N个-羟基琥珀酰亚胺酯类反应性Cy染料。使用Nanodrop分光光度计和RNA 6000 Nano LabChip测定法分析aRNA产量和大小。将氨基烯丙基-aRNA样品（每个样品2μg）汇集在年龄和性别匹配的配对中，真空干燥至完全干燥，并重新悬浮在8μl偶联缓冲液（Ambion）中。用20000 pmol的Cy染料标记后活性染料（Cy3或Cy5）标记aRNA（Amersham Biosciences，http://www5.amershambiosciences.com)在室温下保持30分钟，然后将羟胺添加到0.18 M，在室温下持续15分钟，避光。使用RNeasy MinElute Cleanup试剂盒（Qiagen，网址：http://www.qigen.com). A类₂₆₀，A₅₅₀、和A₆₅₀并使用以下公式计算每1000个核苷酸的染料分子数：染料分子/1000 nt=（A_染料/A类₂₆₀)×（9101厘米⁻¹M（M）⁻¹染料消光系数⁻¹) × 1,000. 标记产生30–60个染料分子/1000 nt。

DNA微阵列的杂交与处理

将750 ng Cy Dye标记的aRNA、750 ng差异标记的总淋巴细胞参考aRNA和50μl安捷伦对照靶标合并，并使用安捷伦片段缓冲液在60°C下片段化30分钟。添加安捷伦杂交缓冲液，并使用SureHyb（安捷伦）组件将490μl目标溶液杂交到安捷伦人类1A寡核苷酸微阵列v2上，并在60°C下以4 rpm孵育17 h。根据安捷伦SSPE清洗方案清洗和干燥阵列，使用安捷伦微阵列扫描仪进行扫描，并使用安捷伦特特征提取软件v7.1提取数据。

微阵列数据分析

开源R软件包(http://www.r-project.org)和来自BioConductor项目的工具(http://www.bioconductor.org)用于微阵列数据的处理和分析。原始数据集包含48个数组：四种细胞类型中每种细胞的六个健康数组和六个黑色素瘤数组。数据中的两个阵列由于背景噪声而存在质量问题，因此被排除在后续分析之外。制造商设计的控制功能和至少一个阵列上饱和的功能被删除。对于每个阵列，将稳定方差的标准化函数应用于平均前景Cy5和Cy3强度，得出每个特征的“广义对数比”值，然后对阵列进行分位数标准化。使用BioConductor提供的安捷伦人类1A（V2）注释数据（hgug4110b）包将这些特征映射到Entrez基因ID。使用中位数汇总每个Entrez基因ID的重复点的值。结果数据矩阵包含16476个基因的46个对数比值。分别比较黑色素瘤和健康样本中每种细胞类型的阵列数据以及不同组合的数据。对于两种或两种以上细胞类型的每种组合，将0.01的较低阈值用于第页-F检验的值比较了每个基因的细胞类型，因此只有在涉及的细胞类型中表达水平相似的基因才包括在比较中。随后的非特异性筛选选择了IQR在所有相关阵列中排名前1000的基因。对于每个选定的基因，基于排列的未调整基因第页-价值估算[14]从Bioconductor的multtest软件包中maxT函数的输出中提取原始成分。这个第页-然后使用错误发现率控制方法调整值以进行多次比较[15].

实时定量PCR

使用Sensiscript（样本总RNA<50ng）或Omniscript（样本0.05–2μg总RNA）逆转录酶（Qiagen）和10μM锚定寡核苷酸（dT）逆转录未扩增总RNA₂₃根据制造商的协议，在37°C下，将底漆和10μM随机非均聚物以20μl的总体积混合1小时。使用SYBR Green Real Time PCR mix（Qiagen）和300 nM特异性引物，将1μl cDNA作为qPCR反应的模板，重复或三次进行qPCR反应。PCR引物(表S1)使用Oligo 6.86软件（Molecular Biology Insights，网址：http://www.oligo.net)具有同等的熔化温度。每对至少有一个引物跨越一个外显子-内含子连接。这些引物由Elim生物制药公司合成(网址：http://www.elimbio.com). 使用iCycler-iQ实时检测系统（Bio-Read Laboratories，http://www.bio-rad.com)在以下条件下：95°C初始变性15min，95°C 40次循环30s，56°C 30s，72°C 30 s，然后进行熔融分析。

实时定量PCR数据分析

每个基因的表达被归一化为看家基因泛素C（UBC）使用双侧Wilcoxon秩和检验比较健康人群和黑色素瘤人群。

STAT1-pY701的干扰素刺激和检测

PBMC用CD8、CD4和CD19抗体染色30分钟，洗涤并重新悬浮至5×10⁶RPMI 5%人血清中每次试验的细胞数，并在37°C 7%CO下休息₂持续2 h。IFN-α、IFN-β或IFN-γ（NIAID参考试剂库，http://www.kamtekinc.com/niaid.php; 和研发系统，网址：http://www.rndsystems.com)添加至最终浓度1000 IU/ml，并在37°C和7%CO下培养细胞₂在37°C和7%CO条件下，通过添加Cytofix缓冲液（BD Biosciences）将细胞固定15分钟₂，并在冰上在Perm Buffer III（BD Biosciences）中渗透30分钟。将细胞在染色缓冲液（1×PBS，2%NCS，0.09%叠氮化钠）中洗涤，并重新悬浮至20μl。细胞在室温下用5μl抗STAT1-pY701 Alexa Fluor 647抗体染色30分钟，在染色缓冲液中洗涤两次，并使用FACS Aria进行分析。

抗CD3抗CD28刺激T细胞及T细胞活化的测定

用Dynabeads CD3/CD28 T细胞扩增珠（Invitrogen）刺激淋巴细胞，珠与T细胞的比例为1:10，用于测量CD69、CD25和CD71，细胞内细胞因子染色为1:1，温度为37°C和7%CO₂24小时。为了测量CD69、CD25和CD71，用CD8、CD4、CD45RA、CD27、CD19、CD69、CD25和CD7130分钟的抗体对细胞进行染色。对于细胞内细胞因子染色，在最后22小时的培养中向细胞中添加5μg/ml布雷费尔丁A。用CD8、CD4和CD19抗体对细胞进行染色，然后将其固定在2%多聚甲醛中，清洗并在含有0.1%皂苷和0.01M Hepes的Hank平衡盐溶液中渗透。用白细胞介素（IL）-2、肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ抗体对细胞进行染色。使用FACS Aria对细胞进行清洗和分析。

T细胞存活率的测定

使用膜联蛋白V:PE细胞凋亡检测试剂盒（BD Biosciences）测量细胞存活率。细胞用CD8、CD4、CD45RA、CD27和CD19抗体染色30分钟，并在Annexin V结合缓冲液中洗涤。在室温下将膜联蛋白V-PE和7-氨基放线菌素D（7-AAD）添加到细胞中15分钟。细胞在Annexin V结合缓冲液中稀释，并使用FACS Aria进行分析。

与健康对照组相比，黑色素瘤患者T细胞和B细胞（但非NK细胞）的基因表达变化

开源R软件包(http://www.r-project.org)和BioConductor的工具(http://www.bioconductor.org)用于处理微阵列数据，如方法对于CD8 T细胞、CD4 T细胞和B细胞，与健康对照相比，具有IFN共同调节的一组相似基因在黑色素瘤患者中显示出表达降低。因此，将这三种细胞类型的数据结合起来，以提高分析的统计能力。调整后排名前25位的基因第页-值，17由IFN调节(表1). 干扰素刺激基因（ISG）的产物负责干扰素的抗病毒、抗增殖和免疫调节作用。

表1

CD8 T细胞、CD4 T细胞和B细胞联合微阵列数据中显示黑色素瘤患者和健康对照者差异表达的基因

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在1000个被用作多重测试程序输入的基因中，25个是ISG；这25个基因中的17个基因有一个调整第页-值<0.05，而975个非干扰素刺激基因中有8个具有调节第页-值<0.05。在区分黑色素瘤淋巴细胞和健康对照的基因组中，使用超几何检验来评估ISG的过度表达。产生的结果第页-值小于10⁻²⁷强烈表明，黑色素瘤患者淋巴细胞与健康对照组淋巴细胞之间ISG的表达降低具有高度显著差异。通过基因交互程序对T细胞和B细胞的差异表达如何相关进行了广泛研究（Nacu等人，未发表的技术报告，2006年，斯坦福大学统计系）。

使用R中的热图函数对微阵列数据进行分层聚类，对前十个ISG进行调整第页-CD8 T细胞、CD4 T细胞和B细胞的值。该聚类将样本分为两个主要组，一组是ISG低表达的黑色素瘤患者，另一组是表达较高的健康献血者(图1A和第3章A–第3章C） ●●●●。来自两对黑色素瘤患者的三个阵列属于一个中间亚群，包含表达介于低ISG表达黑色素瘤和高ISG表达健康样本之间的健康样本(图1A） 。

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图1

基于ISG的微阵列数据分层聚类

使用调整后最低的10个ISG对微阵列数据进行分层聚类第页-黑色素瘤患者与健康对照组的B细胞、CD8 T细胞、CD4 T细胞（A）和CD56dim NK细胞（B）的综合数据值。白色表示最高表达，红色表示最低表达，黄色/橙色表示黑色素瘤相对于健康对照的中间表达。

有趣的是，与健康对照组相比，黑色素瘤患者的NK细胞之间没有检测到基因表达的显著变化。这组ISG没有区分来自黑色素瘤的NK细胞和健康样本(图1B） ●●●●。此外，NK细胞排名靠前的基因也无法区分两组(图S3D） 进一步证实了黑色素瘤患者NK细胞的基因表达谱没有改变。

用定量PCR验证微阵列数据

通过实时定量PCR（qPCR）对这些基因进行分析，验证了微阵列实验中观察到的黑色素瘤患者T和B细胞中ISG表达的改变，该分析使用了微阵列分析之前保留的原始分选样本中的未扩增RNA。qPCR分析显示，与健康对照组相比，黑色素瘤患者CD8 T细胞、CD4 T细胞和B细胞中ISG的表达降低，验证了微阵列数据(第页每个基因<0.05，表2). 黑色素瘤和健康样本之间这些基因表达的平均倍数变化范围为1.544×HERC5系列至3.005×国际单项体育联合会44(表2).HERC5系列基因调控尚不清楚，但HERC5系列是对干扰素-α（未公布的数据）的反应而诱导的。与健康对照组相比，黑色素瘤患者淋巴细胞中的另外两个非干扰素调节基因的表达也发生了显著变化：灯3表达减少FREQ公司表达增加(表1). 这些表达变化也通过qPCR进行了验证第页-0.006和0.054的值灯3和FREQ（频率），分别。从黑色素瘤和ISG患者的NK细胞中选择一组顶级基因进行qPCR分析。黑色素瘤患者和健康对照组NK细胞中这两组基因的表达没有显著差异(表S2).

表2

黑色素瘤患者与健康对照者CD8 T细胞、CD4 T细胞和B细胞差异表达基因的实时定量PCR分析

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淋巴细胞中STAT1-酪氨酸磷酸化

的减少表达STAT1（状态1）黑色素瘤患者T细胞和B细胞中的ISG表明这些患者免疫系统中的IFN信号受到干扰。为了验证这一假设，通过测量STAT1磷酸化来评估淋巴细胞对干扰素刺激的功能反应，这是干扰素信号转导中的一个基本事件。用1000 IU/ml IFN-α、IFN-β或IFN-γ（或未经刺激）刺激9名黑色素瘤患者和9名健康对照者的PBMC，并使用Phosflow（BD Biosciences）测量酪氨酸701处STAT1的磷酸化。与其他方法相比，Phosflow方法具有更高的灵敏度和更高的定量，并且它允许在小型临床样本中同时分析多个人群。选择1000 IU/ml的浓度有两个原因：（i）该浓度产生了STAT1-pY701的最大诱导作用，以便通过滴定实验中的检测进行检测；（ii）这大约是在2×10的高剂量治疗方案中静脉输注IFN-α2b后人类血清中IFN-α2 b的浓度⁷单位/米²（未发布的数据）。IFN-α刺激诱导的磷酸化STAT1-阳性淋巴细胞的中位数百分比显著降低（Δ=16.28%；95%CI，0.98-33.35，图2A） 在黑色素瘤患者中(n个=9）与健康对照组相比(n个= 9). 在淋巴细胞群中，CD8（Δ=10.18%）和CD4 T细胞（Δ=8.71%）亚群中观察到减少，但B细胞中没有减少（Δ=0.33%）(图2B–2D） ●●●●。在IFN-β刺激下，观察到STAT1-pY701阳性淋巴细胞的中位数百分比也有类似的降低模式(图2E–2H） ●●●●。对于IFN-γ刺激的反应，与对照组相比，黑色素瘤患者样本中STAT1的磷酸化没有显著差异(图2I–2五十） ●●●●。这些结果还表明，有两组患者：IFN-α应答率高（3/9）和低（6/9）。

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图2

黑色素瘤患者和健康对照者淋巴细胞中STAT1-pY701-阳性细胞对干扰素刺激反应的百分比

用1000 IU/ml IFN-α、IFN-β或IFN-γ刺激黑色素瘤患者和健康对照者的PBMC。通过Phosflow测定STAT1-pY701阳性细胞的百分比。第页-使用Wilcoxon秩和检验（单侧）计算值。中位数由每个散点列中的条指示。H、 健康；M、 黑色素瘤。

（A–D）IFN-α刺激的PBMC。淋巴细胞（A）；CD8 T细胞（B）；CD4 T细胞（C）；B细胞（D）。

（E–H）IFN-β刺激的PBMC。淋巴细胞（E）；CD8 T细胞（F）；（G） CD4 T细胞（G）；B细胞（H）。

（I–L）IFN-γ刺激的PBMC。淋巴细胞（I）；CD8 T细胞（J）；CD4 T细胞（K）；B细胞（L）。

Flowjo中的概率装箱（Chi[T]）函数[19]用于比较STAT1-pY701染色细胞在IFN-α刺激的淋巴细胞和相应的非刺激对照中的分布。黑色素瘤样本的平均Chi较低²（T） STAT1-pY701的值（3830±978.5）比健康人（6398±1453）低，进一步表明通过IFN-α刺激在黑色素瘤中对STAT1-pY701的诱导低于健康人。

对受刺激细胞与非刺激细胞中STAT1-pY701染色平均荧光强度的倍数变化进行了两项比较：受刺激细胞和非刺激细胞的总倍数变化，以及STAT1-pY701阳性细胞与非模拟细胞的倍数变化。IFN-α和IFN-β中STAT1-pY701染色在受刺激细胞与非受刺激细胞中的总倍数变化（而不是IFN-γ）在CD8（健康[H]，2.76×；黑色素瘤[M]，1.84×）和CD4 T细胞（H，3.32×；M，2.9×）亚群以及整个淋巴细胞群（H，2.84×；M(图3A–三C） 支持淋巴细胞对I型干扰素反应降低的结果。在健康（3.95×）和黑色素瘤（3.95×）淋巴细胞之间，STAT1-Y701阳性细胞与未刺激细胞的平均荧光强度的倍数变化没有显著差异(图3D） ●●●●。这些结果表明，这些细胞能够对黑色素瘤样本中的干扰素产生反应，达到与健康淋巴细胞相似的水平。在黑色素瘤组中，STAT1-pY701阳性细胞的折叠变化与对IFN-α的反应中STAT1-pY701阳性的细胞百分比显著相关(第页= 0.8841,第页= 0.0016). 相比之下，相关性较低且不显著(第页= 0.5785,第页=0.1027）。这一结果表明，黑色素瘤患者组中对IFN-α应答的细胞百分比较低，与这些细胞群中对IFN-α应答的程度较低有关。总的来说，这些功能检测表明黑色素瘤患者T细胞中的I型干扰素信号存在缺陷。

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图3

IFN刺激对黑色素瘤患者和健康对照者淋巴细胞STAT1-pY701-Alexa Fluor 647平均荧光强度的影响

通过Phosflow在干扰素刺激（1000 IU/ml）和非刺激细胞中测量STAT1-pY701-Alexa Fluor 647染色的平均荧光强度（MFI）。总倍数变化=MFI刺激的细胞/MFI未刺激的细胞；阳性细胞折叠变化=MFI STAT1-pY701-阳性细胞/MFI-未刺激细胞。第页-使用Wilcoxon秩和检验（单侧）计算值。中位数由每个散点列中的条指示。健康（□；n个= 9); 黑色素瘤(▪;n个= 9).

（A） 干扰素-α刺激细胞。

（B） 干扰素β刺激细胞。

（C） IFN-γ刺激细胞。

（D） 淋巴细胞中的阳性细胞折叠改变。

干扰素刺激后淋巴细胞中ISG的表达

STAT1磷酸化降低可能会损害细胞诱导ISG下游表达的能力。为了验证这一假设，来自黑色素瘤患者和健康对照的淋巴细胞用1000IU/ml IFN-α刺激或不刺激14小时，之后将细胞在TRIzol中匀浆以分离RNA，然后合成cDNA。对微阵列数据中显示显著下调的四个ISG进行实时qPCR：STAT1、IFIT1、IFI44、，和MX2型.这些基因在干扰素中的表达水平-黑色素瘤组的α刺激细胞低于健康组，尽管四个基因中的三个基因的表达差异在统计学上并不显著(图4A） ●●●●。这表明长期暴露于高剂量干扰素可以部分克服黑色素瘤患者淋巴细胞中干扰素信号的缺陷。表达的折叠变化STAT1、IFI44、，和MX2型刺激细胞与非刺激细胞（使用Pfaffl方法计算[20])黑色素瘤患者样本中含量较高(图4B） ●●●●。尽管这些患者的中位倍数变化较高，但这些ISG的表达水平没有达到在健康样本中观察到的水平(图4A） ●●●●。这些基因基础表达最低的患者对干扰素-α的反应倍数变化最低；例如，2号和11号黑色素瘤患者的基础表达STAT1、IFIT1、IFI44、，和MX2型在黑素瘤患者组中，Phosflow分析显示这些基因的倍数变化最低，对IFN-α的反应最低，进一步表明其中一些患者是IFN-低反应者。与健康组相似，这些基因基础表达较高的患者这些ISG的表达发生了较高的倍数变化，这表明其他患者对IFN有反应。患者反应的差异可能解释了为什么一些黑色素瘤患者对高剂量干扰素-α2b治疗有反应，而其他患者没有反应。

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图4

IFN-α刺激黑色素瘤患者和健康献血者淋巴细胞ISG的表达

用1000 IU/ml刺激黑色素瘤患者和健康对照者的淋巴细胞14小时STAT1、IFIT1、IFI44、，和MX2型用qPCR检测。数据显示在日志中₂比例尺。介质由每个散点列中的条形图表示。第页-数值来自单侧Wilcoxon秩和检验。H、 健康；M、 黑色素瘤。

（A） IFN-α刺激细胞中的基因表达，样本大小为n个=13（H）和n个=每个基因12（M）。

（B） IFN-α刺激细胞与非刺激对照细胞中基因表达的折叠变化。统计1：n个=13（高），n个=11（M）；IFIT1：n个=12（高），n个=12（M）；IFI44：n个=13（H）时，n个=11（M）；MX2：n个=12（高），n个=12（M）。

我们感谢安德鲁·帕克（Andrew Park）的技术援助，感谢大卫·帕克斯（David Parks）博士对FACS Aria的帮助，感谢马克·科拉姆（Marc Coram）博士的宝贵讨论。SN和SH的部分资金来自国家科学基金会拨款DMS 0241246。