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美国国家科学院院刊。2006年11月14日；103(46): 17337–17342.
2006年11月3日在线发布。 数字对象标识：10.1073/pnas.0607015103
预防性维修识别码：项目经理1859931
PMID：17085592

小dsRNAs诱导人类细胞转录激活

李龙成,* 史蒂文·托基诺, 洪昭, 迪帕·普科特, 罗伯特·F·普莱斯, 村上信治, 伊德基·伊诺基达,和拉杰维尔·达希亚*
作者信息 文章注释 版权和许可证信息 PMC免责声明

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补充资料

摘要

最近的研究表明，小的非编码RNA，如microRNAs和siRNAs，在多个水平上调节基因表达，包括染色质结构、转录、RNA编辑、RNA稳定性和翻译。每种形式的RNA-依赖性调节通常被发现沉默同源序列，统称为RNAi。为了进一步研究小RNA在转录水平上的调控作用，我们设计并合成了针对人类基因E-cadherin，p21的特定启动子区域的21-nt dsRNAWAF1/CIP1（第21页）和VEGF。令人惊讶的是，将这些dsRNAs转染到人类细胞系中会导致靶基因的长期和序列特异性诱导。dsRNA突变研究表明，反义链或“种子”序列的5′端对活性至关重要。从机制上讲，dsRNA诱导的基因激活需要Argonaute 2（Ago2）蛋白，并且与dsRNA靶位点组蛋白3上赖氨酸-9甲基化的缺失有关。总之，我们已经确定了几种dsRNA，它们通过靶向基因启动子中的非编码调控区域来激活基因表达。这些发现揭示了小RNA分子在基因表达调控中比以前认识到的更为多样的作用，并确定了dsRNA在靶向基因激活中的潜在治疗用途。

关键词：基因调控，启动子，Argonaute 2

最初发现小dsRNAs是RNAi的触发因子，这是一种降解同源mRNA导致转录后基因沉默的机制(1,2). dsRNA还通过引导植物DNA甲基化参与转录基因沉默(三,4)以及裂变酵母中异染色质的形成(5)和果蝇属(6). 直到最近才发现哺乳动物中存在转录基因沉默(7,8). 然而，在少数情况下，小RNA正向调节同源序列。例如，从神经干细胞中分离出的一个小RNA可以激活包含NRSE/RE1序列的基因的转录，以刺激成年干细胞中的神经元分化(9). 此外，还发现一种肝脏特异性microRNA通过靶向病毒基因组的5′非编码区来增强病毒复制(10). 30多年前，布里顿和戴维森(11)提出了一种理论，即从冗余基因组区域转录的所谓“激活剂”RNA激活一组蛋白质编码基因。为了进一步研究小RNA在基因转录中的潜在作用，我们用合成的dsRNAs选择性地靶向启动子区域，并鉴定了几种易于在转录水平激活基因表达的dsRNAs。

结果

靶向E-Cadherin启动子的dsRNA诱导基因表达。

我们首先设计并合成了两个21-nt dsRNAs，靶向E-cadherin启动子，序列位置为相对于转录起始位点的−302（dsEcad-302）和−215（dsEcad-215）(图1一). 具有高GC含量或低序列复杂性的区域被排除为dsRNA靶标，例如CpG岛和铝E-cadherin启动子中的重复元件(图1一). 我们还设计了一个21-nt对照dsRNA（dsCon-1），它与所有已知人类序列缺乏显著同源性。我们将这些dsRNA转染到两个人类前列腺癌细胞系PC-3和DU-145中。在PC-3细胞中，我们观察到E-cadherin mRNA的深度诱导(图1B类)和蛋白质表达(图1C类). 时间进程和剂量反应实验表明，E-钙粘蛋白诱导发生在转染后48小时内，dsRNA浓度低至1 nM(图1 D类和电子). 形态学上，模拟转染细胞和dsCon-1转染细胞在转染后保持健康生长，而E-cadherin dsRNA转染的细胞在第3天后逐渐失去活力（图7，作为PNAS网站上的支持信息发布）。这一发现与先前的研究一致，在这些研究中，E-cadherin的强制表达导致细胞生长缓慢(12,13). 我们还测试了PC-3细胞转染的更长时间。令人惊讶的是，在单次转染dsEcad-215后的第10天和第13天，我们检测到E-cadherin表达分别增加了14倍和3.8倍(图1F类). 虽然DU-145细胞通常表达高水平的E-cadherin，但我们也观察到在dsEcad-302和-215治疗后E-cadherin表达适度且持续增加（图8，作为PNAS网站上的支持信息发布）。这些结果在使用三个单独批次合成的dsRNAs的至少五个独立实验中是可重复的。总的来说，在转染模拟或dsCon-1对照的细胞中未检测到E-cadherin表达的变化(图1 B类–F类).

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靶向E-cadherin基因启动子的dsRNA诱导E-cadherinmRNA和蛋白表达。(一)E-cadherin启动子及其CpG岛的示意图，铝重复元件、转录起始位点和dsRNA靶点。(B类)用50 nM dsRNA转染PC-3细胞72 h。用RT-PCR分析E-cadherin和GAPDH的mRNA表达。每个处理的样品一式两份。(C类)通过Western blot分析检测了PC-3细胞中E-cadherin、β-actin和GAPDH蛋白的水平B类. (D类)用指定浓度的dsEcad-215处理PC-3细胞72小时。通过蛋白质印迹检测E-钙粘蛋白和GAPDH的表达。(电子)用50 nM dsEcad-215转染PC-3细胞，转染时间为指定长度。Western blotting检测E-cadherin和β-actin的表达。(F类)在指定的时间段内，用50 nM dsCon-1或dsEcad-215转染PC-3细胞。在没有dsRNA的情况下转染模拟样品。Western blot分析显示单次转染后第10天或第13天PC-3细胞中的E-cadherin蛋白水平。

由于启动子内CpG岛异常甲基化，E-cadherin在HeLa细胞中表观遗传沉默。为了确定E-cadherin dsRNAs是否可以激活来自沉默启动子的E-cadherin表达，我们用dsEcad-302和dsEcad-215转染HeLa细胞。最初，这两种dsRNA分子都未能诱导E-cadherin表达（图9中的第3和第4通道，这是PNAS网站上发布的支持信息）。然而，当细胞与低剂量（1-10μM）的DNA去甲基化剂5-氮杂胞苷（Aza-C）和dsRNA共同处理时，E-cadherin的表达水平升高，远远高于单独使用Aza-C的处理水平（图9，第8-10栏）。事实上，只有在Aza-C和dsEcad-302共同处理后，才能通过Western blot分析检测到E-cadherin蛋白（图9，通道9和10）。这些结果表明，E-cadherin启动子的预先甲基化抑制dsRNA的基因诱导。

Ting之前的研究等。(8)表明以E-cadherin CpG岛为靶点的合成dsRNA对人类细胞中E-cadherin-CpG表达产生沉默作用。随后，我们决定测试另外三种21 nt dsRNA（dsEcad-185、-75和-60），它们靶向E-钙粘蛋白启动子中与Ting靶向区域相似的区域等。(8)（图10一，作为支持信息发布在PNAS网站上）。与上次报告一致(8)，与模拟转染相比，dsEcad-185、-75和-60没有诱导基因表达，而是导致E-钙粘蛋白水平的轻微下降（图10B类和C类). 这些数据表明dsRNA-induced gene activation（RNAs）对靶点位置敏感。

靶向p21和VEGF启动子的dsRNA诱导基因表达。

我们进一步检测了另外两个基因p21的RNAWAF1/CIP1（p21）和血管内皮生长因子（VEGF）。设计了两个dsRNA；其中一个（dsP21–322）将p21启动子定位在−322位置(图2一)而另一个（dsVEGF-706）将VEGF启动子定位在位置−706(图3一). 我们将dsP21-322和对照dsRNA（dsCon-2）转染到PC-3细胞、HeLa细胞和人类乳腺癌细胞系MCF-7中。dsCon-2控制也与所有已知人类序列缺乏显著同源性，其目的是进一步拓宽我们的控制dsRNA分子来源。转染48小时后，与转染dsCon-2的细胞相比，转染dsP21–322的所有细胞系的生长速度较慢（图11，作为PNAS网站上的支持信息发布）。72小时时，dsP21-322显著诱导p21 mRNA表达(图2B类). 与模拟转染相比，PC-3、HeLa和MCF-7细胞的诱导率分别为12.5、10.1和2.4倍(图2C类). 蛋白质印迹分析进一步证实了p21的诱导作用(图2D类). p21蛋白水平的升高与p21 mRNA表达的增加密切相关。

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dsRNAs在不同的人类细胞系中诱导p21表达。用50 nM dsRNA转染细胞72 h。分别用RT-PCR和Western blotting分析mRNA和蛋白质水平。(一)p21启动子及其CpG岛、SP1位点、TATA信号、转录起始位点和dsRNA靶点的示意图。(B类)模拟、dsCon-2或dsP21-322转染后，PC-3、MCF-7和HeLa细胞中p21和GAPDH mRNA的表达水平。(C类)p21 mRNA表达水平被标准化为GAPDH。结果显示为两个独立实验的平均值±SEM（每个实验中重复两个样本）。(D类)在PC-3、MCF-7和HeLa细胞中通过Western blot分析证实p21蛋白表达的诱导。还检测到GAPDH水平，并作为负荷控制。(电子)在HEK293、J82、LNCaP和T24细胞中转染mock、dsCon-2或dsP21-322后对p21和GAPDH进行Western blot分析。

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dsRNAs诱导HeLa细胞中VEGF的表达。用50 nM dsRNA转染细胞72 h。通过RT-PCR分析mRNA水平。(一)VEGF启动子和dsRNA靶点位置的示意图。(B类)模拟、dsCon-2或dsVEGF-706转染后HeLa细胞中两种VEGF亚型（VEGF-189和-165）和GAPDH的mRNA表达。(C类)VEGF mRNA表达水平按GAPDH标准化。结果显示为两个独立实验的平均值±SEM，每个样品重复两次。

在另外四种人类细胞系中也进行了dsP21-322的转染，包括胚胎肾细胞系HEK293、前列腺癌细胞系LNCaP和两种膀胱癌细胞系J82和T24。如所示图2电子，dsP21–322转染导致每个细胞系中不同程度的p21诱导。

将dsVEGF-706转染HeLa细胞导致VEGF诱导(图3B类). 与模拟转染相比，两种VEGF mRNA亚型VEGF-165和-189在HeLa细胞中的表达分别增加了4倍和3.7倍(图3C类).

干扰素应答与dsRNA-诱导的转录激活无关。

双链RNA分子已被证明通过启动I型干扰素的产生来诱导干扰素调节基因的表达(14–16). 这种效应部分由dsRNA-依赖性蛋白激酶PKR的磷酸化依赖性激活介导。为了排除非特异性干扰素应答可能导致基因诱导的可能性，我们分析了两个经典干扰素调节基因OAS1和OAS3的表达，并评估了转染dsRNA的细胞中PKR的激活。如图12所示一–C类dsRNA没有诱导OAS1或OAS3的表达，也没有促进PKR磷酸化。此外，I型IFN-α2a治疗对E-cadherin或p21的表达没有影响（图12D类). 综上所述，这些结果表明dsRNA的基因诱导并不是通过非特异性IFN反应发生的。

RNA抗体的dsRNA序列要求。

为了评估dsRNA长度对RNAs的影响，我们从dsEcad-215双链的3′端（相对于反义链）截短5 bp，得到16-nt dsRNA（dsEcad-25-16）（图13一，作为支持信息发布在PNAS网站上）。我们还将dsEcad-215和-302扩展到26 nt（dsEcad-25–26和dsEcad-302–26）（图13一). 有趣的是，缩短和延长的dsRNA都没有诱导E-cadherin转录（图13B类和C类). 这些结果表明，大小约为21 nt的dsRNAs更适合于RNAs。

为了表征RNA的序列要求和特异性，我们基于dsEcad-215分析了突变的dsRNA(图4一)和dsP21–322(图4D类). 对dsEcad-215双链的前5 bp的突变在反义RNA链的3′端和目标DNA之间造成了5个不匹配(图4一). 令人惊讶的是，dsEcad-215-G3′在诱导E-cadherin表达方面仍然有效(图4 B类和C类). 然而，dsEcad-215双链最后5 bp的突变(图4一)几乎完全消除了E-钙粘蛋白的激活(图4 B类和C类). 我们还在PC-3和HeLa细胞中检测了来自dsP21–322的三个突变dsRNA，包括5′端的一个5 bp突变（dsP21-322-G5′，相对于反义链）、3′端的1个5 bp突变体（dsP21-322-G3′）和中部的一个5bp突变（dsP21–32 2-m）(图4D类). 与E-cadherin dsRNA突变分析的结果一致，dsP21–322反义链（dsP21-322-G5′）5′端的突变破坏了其在PC-3和HeLa细胞中激活p21表达的能力(图4电子). 3′端或中间区的突变在不同程度上保留了激活p21的能力(图4电子). 这些结果表明，dsEcad-215和dsP21-322中反义链的5′部分对启动转录激活至关重要，而3′末端或中间区域的错配是可以容忍的。

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RNAs的序列特异性。(一)E-cadherin dsRNA dsEcad-215的序列。反义（导向）链以蓝色显示。dsEcad-215双链的第一个和最后一个5 bp突变分别导致dsEcad-235-G3′和dsEcad-25-G5′。突变的碱基为红色(B类)用50 nM的dsRNA分子转染PC-3细胞72 h。通过Western blot分析评估E-cadherin和β-actin的表达。(C类)相应Western blot中的E-钙粘蛋白水平归一化为β-肌动蛋白，并表示为两个独立实验的平均值±SEM。(D类)dsP21-322的序列及其相应的突变dsRNA。(电子)用50 nM的dsRNA分子转染PC-3和HeLa细胞72 h。通过Western blot分析评估p21和GAPDH的表达水平。

RNAa需要精氨酸（Ago）2蛋白。

因为我们的研究结果表明，RNAa和RNAi对触发dsRNA有相似的要求，例如“种子”序列的重要性和21nt的优选大小，所以我们决定确定RNAa是否也需要RNAi途径的成分。我们合成了针对Ago1-4（siAgo1、siAgo2、siAgo3和siAgo4）的特异性siRNA(17)以及一个对照siRNA（siAgo-C）。我们使用每一个Ago-siRNAs单独或与p21-特异性dsRNA dsP21-322结合在PC-3细胞中进行转染。如所示图5一和B类，每个Ago蛋白的表达都被其相应的siRNA成功地敲低。当每个Ago-siRNA与dsP21–322共转染时，只有siAgo2-siRNA完全阻止了p21的诱导(图5 C类–电子). 敲除Ago1、3和4分别导致dsRNA诱导的p21表达减少≈0.3-、≈0.4-和≈0.3倍(图5 C类–电子). 我们还用siAgo2单独或与dsEcad-215联合转染PC-3细胞。同样，在与siAgo2共转染的细胞中，E-cadherin诱导几乎完全被消除（图14，作为PNAS网站上的支持信息发布）。虽然其他Ago家族成员可能在RNAs中起支持作用，但Ago2对RNAs是不可或缺的。

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RNAa需要Ago2蛋白。(一)用50 nM的dsRNA分子转染PC-3细胞72 h。通过RT-PCR评估Ago1-4的mRNA表达。每个Ago家族成员都被其相应的Ago-siRNA（siAgo1、2、3或4）击倒。(B类)RT-PCR结果归一化为GAPDH表达水平，并以两个独立实验的平均值±SEM表示。(C类和D类)用50 nM的每种显示的dsRNA转染PC-3细胞72 h。p21和GAPDH mRNA均转染(C类)和蛋白质(D类)分别通过RT-PCR和Western blot分析测定其含量。(电子)p21 mRNA水平归一化为GAPDH，并表示为至少两个独立实验的平均值±SEM（每个实验包含两个重复样本）。

赖氨酸-9组蛋白3甲基化缺失与基因激活相关。

为了解决启动子靶向dsRNA分子如何增加基因表达，我们进行了ChIP分析，通过使用赖氨酸-4（H3m2K4）和赖氨酸-9（H3m2 K9）处二甲基化组蛋白3特异性抗体来确定E-cadherin启动子处组蛋白甲基化的状态。两个启动子区域对应于dsEcad-302（区域1）和dsEcad-215（区域2）的靶点(图6一). 在模拟和dsCon-1转染的PC-3细胞中，E-cadherin启动子与H3m2K4和H3m2K9都相关(图6 B类和C类). 我们观察到dsEcad-302（区域2下降74%）或dsEcad-215（区域2降低80%）转染后dsRNA靶位点的H3m2K9显著下降(图6 B类和C类). 尽管区域2的下降更为明显，但区域1中的H3m2K9也下降得较小(图6 B类和C类). 我们没有观察到任何dsRNA处理的细胞中H3m2K4的显著变化(图6 B类和C类). 由于dsEcad-215引起H3m2K9的最大下降，我们还进行了ChIP测定，以确定赖氨酸-9处三甲基化组蛋白3（H3m3K9）的状态。如所示图6 D类和电子dsEcad-215转染后，靶位点发生H3m3K9缺失。虽然目前还不清楚RNA与组蛋白去甲基化的关系，但这些发现表明H3-K9甲基化减少，这是一种组蛋白修饰，可以抑制E-cadherin转录(18)与dsRNA诱导的E-cadherin表达相关。

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dsRNA诱导的转录激活与组蛋白3在赖氨酸-9甲基化的丢失有关。用50 nM的所示dsRNA分子转染PC-3细胞72 h。通过使用抗H3m2K9、H3m2K4和H3m3K9的抗体进行ChIP分析，以拉下相关DNA。沉淀的DNA通过PCR扩增，使用区域1和区域2特异的两组引物。作为对照，扩增输入DNA。(一)E-cadherin启动子的示意图以及ChIP PCR区域1和2的位置（双箭头线）。(B类和C类)用H3m2K9和H3m2K 4抗体沉淀DNA的PCR扩增。(D类和电子)用H3m3K9抗体沉淀DNA进行PCR扩增。

dsRNA靶位点不发生DNA甲基化变化。

我们还使用亚硫酸氢盐基因组测序技术分析了E-钙粘蛋白启动子上的DNA甲基化状态。E-cadherin CpG岛和dsRNA靶区仅在PC-3和DU-145细胞中偶尔甲基化（图15，作为PNAS网站上的支持信息发布）。dsEcad-302和dsEcad-215导致CpG甲基化略有增加，仅限于dsRNA靶区（图15）。然而，这种增加在统计学上并不显著，这表明DNA甲基化在RNAs中不起作用。这一结果与先前研究转录沉默的报道类似，在转录沉默中，靶向启动子区域的dsRNA不会诱导哺乳动物细胞中的DNA甲基化(8,19,20).

讨论

dsRNA（如siRNA和microRNA）触发的RNAi与靶mRNA序列的沉默有关。在类似的方面，一些研究小组也报道了用dsRNAs靶向启动子区域通过触发组蛋白修饰和/或DNA甲基化诱导转录沉默(7,8,21). 在这些报告中，dsRNAs被有意设计用于靶向基因启动子内富含CpG的区域或CpG岛，因此具有异常高的GC含量。在本研究中，我们通过严格遵循合理的siRNA设计规则，采取了不同的dsRNA设计方法(22). 我们从每个目标基因中扫描了1 kb的启动子序列，并选择了那些不位于CpG岛且最符合功能性siRNA设计规则的候选基因（即GC含量低、缺少重复或反转序列、在感觉链3′末端偏向于低内部稳定性等）。因此，我们的dsRNA避开了富含CpG的区域。通过转染候选dsRNA，我们发现了四种激活靶基因E-cadherin、p21或VEGF表达的dsRNA。dsRNA处理后的基因表达诱导通常相当稳健；常规检测到mRNA和蛋白质水平增加2到10倍。转染细胞还获得了与靶基因过度表达相关的表型变化，例如在转染了靶向E-cadherin和p21启动子的dsRNA的细胞中观察到生长停滞。

与这些观察结果相关，其他一些证据表明，dsRNA诱导的基因对靶向启动子位点具有序列特异性。首先，对加利福尼亚大学（Santa Cruz）基因组数据库中的每个激活物dsRNA进行BLAST搜索，以确保其与人类基因组中除其预期靶位点以外的任何序列没有同源性。第二，两个控制dsRNA分子（dsCon-1和dsCon-2）故意设计为与所有已知人类序列缺乏显著同源性，并不影响任何评估基因的表达。第三，dsRNA突变实验表明，dsRNA双链中反义链或种子序列的5′端对靶基因诱导至关重要。第四，dsRNA治疗没有诱导IFN反应，E-cadherin或p21表达也不易受到IFN暴露的影响。综上所述，这一证据表明，启动子靶向dsRNAs的基因诱导具有序列特异性。

通过siRNA转染的经典RNAi被认为寿命相对较短，仅持续5-7天(23). 有趣的是，我们观察到dsRNA单次转染后基因持续激活；dsEcad-215转染13天后，E-cadherin诱导仍可检测到(图1F类). ChIP分析显示E-cadherin dsRNA能够诱导与活性基因相关的表观遗传变化。这可能为更持久的影响提供了一个解释，因为人们认为表观遗传标志物可以在细胞分裂中遗传(24).

Ago蛋白家族是RNA沉默的关键调节器。人类共有四种紧密相关的Ago蛋白（Ago1-4），它们与触发dsRNA相互作用，并在目标识别中发挥作用；然而，Ago2是唯一具有RNA切割活性的家族成员(17,25). 我们的dsRNA突变分析表明，目标序列和dsRNA之间的不匹配仍然能够诱导基因表达，因此表明RNAs不会发生目标序列的断裂。Ago2需要通过切割和丢弃乘客链将siRNA分子加工成活性形式(26,27). 也许Ago2以类似的方式将我们的dsRNA转化为活性形式。虽然我们不知道我们的dsRNAs是否与互补DNA相互作用或靶向隐秘启动子转录物，但Ago2也可能参与靶向识别以形成一个假定的效应物复合体。

需要指出的是，并非所有与启动子序列互补的dsRNA都激活了基因表达。例如，分别在−48、−294和−45位置靶向p27、PTEN和APC的dsRNA分子未能增加基因转录（数据未显示）。在其他情况下，一些细胞株对特定的dsRNA具有耐药性，而对其他细胞株则敏感。将dsEcad-215转染到HeLa细胞最初未能激活E-cadherin表达。同样，dsVEGF-706不能诱导HEK293细胞中VEGF的表达（数据未显示）。然而，这两种细胞系都对dsP21-322诱导的p21敏感，这表明它不是对RNAa的全局抗性，而是靶基因启动子的特定条件使其无反应。基因启动子中异常的DNA甲基化可能是一些启动子对RNAs产生耐药性的机制之一。为了支持这一观点，我们表明只有在存在DNA-去甲基化剂Aza-C的情况下，dsRNA才能激活HeLa细胞中的E-cadherin。靶点定位也可能有助于RNA的功能成功。例如，靶向E-cadherin启动子中CpG岛的dsRNA（dsEcad-185、-75和-60）未能诱导基因表达。

总之，通过靶向三个基因的启动子区，我们已经鉴定了几种以序列特异性方式诱导基因转录的dsRNA。这种RNA介导的过程需要Ago2蛋白，并且与与基因激活相关的组蛋白变化有关。尽管目前尚不清楚确切的机制，但这种现象的识别仍可能具有重要的治疗潜力。RNAi的使用目前正在作为分子医学的基因特异性方法实施。根据同样的原理，RNAs对沉默的肿瘤抑制基因（例如p21）或其他常见失调基因（例如e-cadherin）的特异性激活可能进一步促进基于dsRNA的药物在癌症和其他疾病治疗中日益增长的治疗潜力。这一信息还揭示了RNAi的一个新的复杂性，即siRNAs可能会不良地诱导非靶基因的表达。

材料和方法

dsRNA设计与合成。

对于每个基因，我们检索了1 kb的启动子序列，并根据合理的siRNA设计规则扫描其dsRNA靶点(22). 我们选择了那些位于转录起始位点附近并且最符合功能性siRNA设计规则的候选基因。对加州大学圣克鲁斯分校基因组数据库进行了BLAST搜索(http://genome.ucsc.edu)排除那些与非特异性人类序列同源的靶点。两个对照dsRNA（dsCon-1和dcCon-2）被专门设计为与所有已知人类序列缺乏同源性。dsRNAs由Invitrogen（Carlsbad，CA）与dTdT 3′悬链化学合成。Ago-特异性siRNAs的合成如前所述(17). 控制siRNA（siAgo-C）也被设计为与Ago基因缺乏同源性。表1列出了所有dsRNA序列，作为PNAS网站上的支持信息发布。

细胞培养和转染。

PC-3、DU-145和LNCaP保存在添加10%FBS、2 mM的RPMI培养基1640中我-谷氨酰胺、青霉素（100单位/ml）和链霉素（100μg/ml），在5%CO的增湿空气中2保持在37°C。将HeLa、J82、T24、HEK293和MCF-7细胞维持在补充有2mM的Eagle最低必需培养基中我-谷氨酰胺、厄尔平衡盐溶液、青霉素、链霉素和10%胎牛血清。向MCF-7和HeLa细胞补充额外的1 mM丙酮酸钠和0.01 mg/ml牛胰岛素。转染细胞的前一天，将其置于不含抗生素的培养基中，密度为50-60%。根据制造商的方案，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）对dsRNA进行转染，转染持续72小时（时间过程实验中出现例外情况）。

核酸提取。

使用TriRegent（俄亥俄州辛辛那提市分子研究中心）或RNeasy RNA分离试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚市齐根市）提取总细胞RNA。用三试剂分离基因组DNA。

Western Blot分析。

用PBS清洗培养细胞，并用M-PER蛋白提取缓冲液（皮尔斯，罗克福德，伊利诺伊州）溶解。将细胞裂解物离心10分钟，收集上清液。等量的蛋白质在7.5-15%SDS/PAGE凝胶上溶解，并通过电压梯度转移转移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%脱脂干乳隔夜封闭产生的斑点。使用增强化学发光检测（SuperSignal West Dura Lumino/增强剂溶液；Pierce），用适当的抗体检测特定蛋白质。使用的免疫印迹抗体有：抗β-肌动蛋白（Sigma，St.Louis，MO）、抗GAPDH（Chemicon，Temecula，CA）、抗E-钙粘蛋白（Zymed，South San Francisco，CA）、抗p21（Upstate Biotechnology，Lake Placid，NY）、抗PKR和抗磷酸化PKR（Cell Signaling Technology，Boston，MA）。

DNA亚硫酸氢盐修饰、PCR扩增和克隆。

亚硫酸氢盐基因组测序PCR（表1）的引物是使用我们实验室开发的在线程序MethPrimer设计的(28). 使用CpGenome DNA修饰试剂盒（Chemicon）对DNA（1μg）进行亚硫酸氢修饰。亚硫酸氢盐修饰的DNA如前所述进行扩增(29). PCR产物被克隆到pCR2.1质粒（Invitrogen）并转化到TOP10细胞（Invit罗gen）。从每个反应中随机挑选10个阳性克隆，并在2 ml LB培养基中培养过夜。然后分离质粒DNA并测序以供分析。

ChIP分析。

根据制造商的说明，使用ChIP分析试剂盒（Upstate Biotechnology）进行ChIP分析。使用识别H3m2K9、H3m3K9和H3m2K4（上游生物技术）的抗体检测组蛋白甲基化模式的特定变化。免疫沉淀DNA反向交联、纯化，并通过PCR进行25–32个周期的分析。用于ChIP分析的PCR引物如表1所示。

半定量RT-PCR。

使用SuperScript逆转录酶（Invitrogen）和寡核苷酸（dT）引物逆转录1微克总RNA。使用E-cadherin、p21、VEGF、Ago1-4、GAPDH、OAS1或OAS3特异性引物通过PCR扩增得到的cDNA样本（表1）。GAPDH的扩增起到了加载控制的作用。

补充材料

支持信息：

致谢

我们感谢G.R.Deng、R.Erickson和K.Greene对手稿的批判性阅读，感谢Y.Shi的有益讨论。这项工作得到了美国国立卫生研究院R01 AG21418和R01 CA1018447以及退伍军人事务研究促进奖计划和绩效评估拨款的支持。

缩写

以前Argonaute公司
Aza-C公司5-氮杂胞苷
核糖核酸dsRNA诱导的基因激活。

脚注

作者声明没有利益冲突。

这篇文章是PNAS直接提交的。

工具书类

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文章来自美国国家科学院院刊由以下人员提供美国国家科学院