如今，肝细胞移植已成为肝器官移植治疗人类肝脏疾病的切实替代品。然而，肝细胞只能从数量有限的供体器官中获得，通常是未分配用于器官移植的边缘肝脏。1,2,三然而，成人肝细胞的增殖潜能较差，可能不足以有效地重新填充宿主肝脏。4因此，必须建立可移植细胞的新来源，以应对供体器官日益短缺和成熟肝细胞适用性有限的问题。
成人造血干细胞和非造血干细胞可以分化为肝细胞样细胞。在人肝衰竭（富马酸乙酯水解酶（FAH）缺乏）小鼠模型中，系统注射成人骨髓细胞5或将骨髓移植到致死性辐射小鼠中，挽救了患病表型6通过在来源于骨髓造血干细胞（HSC）的肝细胞中提供野生型FAH。然而，关于HSC源性肝细胞是否起源于肝细胞分化仍存在争议7,8或干细胞与宿主肝细胞融合。9,10,11,12
然而，除了HSC外，骨髓还含有大量多能干细胞CD34和CD45阴性的间充质干细胞，13它可以在体外繁殖并分化为具有中胚层表型的细胞。移植后，这些细胞植入不同的器官并分化为相应的器官特异性细胞类型。14这种能力，以及它们在体外容易获得和扩展的潜力，使间充质干细胞（MSCs）成为临床上有吸引力的资源。15,16,17现在有证据表明，MSCs的一个亚群，即多能干成体祖细胞（MAPC），能够在体外进行肝源性和胆道分化，尽管缺乏其在体内功能转化的证据。18,19最近，来自大鼠、小鼠和人类骨髓的MSCs在体外条件处理后的不同肝细胞标记物的表达证实了其肝细胞分化潜能。20,21,22脂肪组织等其他来源MSCs的肝源性分化23或脐带血24在体外也能实现，但在体内也没有足够的表型证明。然而，将人MSCs直接注射到烯丙醇中毒大鼠的肝脏中，导致表达特定人类肝细胞标记物的肝细胞样细胞暂时植入。25
在这里，我们报告了来源于人类骨髓的间充质干细胞（hBM‐MSCs）可以在体外预处理，以显示功能性肝细胞表型。部分肝切除后，在免疫缺陷小鼠中预处理hBM‐MSCs的脾内输送导致肝再生小鼠模型中hBM−MSC衍生细胞的宿主肝脏区域整合和重新填充。植入细胞在体内继续显示肝细胞特异性功能。因此，hBM-MSC可能具有长期功能性再生宿主肝脏的潜力，并可能成为可移植肝细胞的替代来源。
材料和方法
人骨髓间充质干细胞的分离、增殖和单细胞衍生培养
根据机构伦理审查委员会的批准，从自愿捐赠者的人类骨髓（hBM）抽吸物中分离出hBM‐MSCs。所有人骨髓间充质干细胞捐赠者均获得书面知情同意；研究人员（LPM）有签署的同意书。将从髂骨嵴中抽出的柠檬酸-hBM（20 ml）离心（10 min，500×克)，将颗粒重新悬浮在1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，施加密度梯度（Biocoll，1.047 g/ml；生物色度）并再次离心（30 min，500×克). 将含有hBM单核细胞（hBM-MNC）的界面重新悬浮在生长培养基中，离心（5 min，500×克)将单个细胞以1×10的密度放置在纤维连接蛋白涂层组织培养瓶上的生长培养基中5 hBM‐跨国公司/cm2在达到汇合点时，用胰蛋白酶/EDTA分离细胞，并以10至100个细胞/cm的密度进行替换2或通过冷冻保存来储存。
为了研究克隆条件下MSCs的特性，通过限制稀释获得单细胞衍生培养物。将100个细胞在20 ml生长培养基中的最终悬浮液以200μl等分试样的形式接种在96孔板中。光镜下观察单个细胞的生长。
生长培养基：60%DMEM、40%MCDB、5μg/ml载脂转铁蛋白、5 ng/ml亚硒酸、5μg/ml亚油酸、5µg/ml牛胰岛素、100μM抗坏血酸2-磷酸盐、1 nM地塞米松、10 ng/ml PDGF-BB、10 ng/ml EGF（全西格玛）、100 U/ml青霉素/10μg/ml链霉素和2%胎牛血清（FCS）（全Invitrogen）。
流式细胞术
使用以下鼠抗人抗体进行流式细胞术：抗CD11 PE、抗CD13 PE、抗-CD14 FITC、抗CD45 FITC、反HLA‐DR FITC（均为Beckton Dickinson）、抗CD29 PE、抗CD‐34 FITC、防CD44 PE、抗-CD166 PE、抗糖蛋白PE（均为BD PharMinen）、抗-CD105 FITC（Serotec）。将细胞与相应抗体在4°C下孵育15分钟，然后用PBS清洗，并用FACS‐Calibur和CellQuest软件（Becton Dickinson）进行分析。
体外分化
新鲜或冷冻保存的细胞以100至200个细胞/cm的密度播种2采集未分化细胞样本，或将其固定在50%的汇合处进行进一步分析。分化细胞生长到100%融合。
成骨分化培养基（ODM）：含有200μM抗坏血酸2-磷酸盐、1μM地塞米松、10 mM甘油-3磷酸盐（全Sigma）和10%FCS（Invitrogen）的DMEM。在10至20天内，每4至5天更换一次培养基。
成脂分化培养基（ADM）：含有50μM地塞米松、10μg/ml牛胰岛素、100μM吲哚美辛、500μM 3-异丁基1-甲基黄嘌呤（全西格玛）、5μM罗格列酮（亚历克斯）和10%FCS（Invitrogen）的DMEM。在14天内，每3天更换一次培养基。
肝细胞分化：用20μM的5′-氮杂胞苷处理细胞24小时。此后，生长培养基被补充有2%FCS、HGF和EGF的人肝细胞维持培养基（HHMM）取代，如前所述。26细胞按指定时间培养，培养基每四天更换一次。
人骨髓间充质干细胞的细胞化学
通过分别用茜素红S pH4染色钙沉积或用油红染色（全Sigma）染色细胞内脂滴来验证成骨分化和成脂分化。福尔马林固定细胞用PBS洗涤，然后染色5至15分钟，然后用蒸馏水洗涤2至3步。
逆转录聚合酶链反应（RT–PCR）
用1.2 ml TRIzol（Gibco BRL Life Technologies）溶解细胞，并根据制造商的说明分离总RNA。使用GeneAmp RNA PCR试剂盒（Applied Biosystems）对成骨和成脂转录物进行RT-PCR。使用M‐MLV逆转录酶（H‐）（Promega）对肝细胞转录物进行RT-PCR。根据制造商的说明，使用cDNA、引物对和PCR Master Mix（MBI发酵剂）进行后续PCR反应。所用引物列于表1中.
表1 用于PCR反应检测分化hBM-MSCs中肝细胞、脂肪细胞和骨细胞特异性基因表达的引物对
| 感兴趣的基因 | 底漆对 | 产品长度（碱基对） | 退火温度（°C） |
|---|
| CK 18型 | 5′‐GAAGGACCATGCAAGCTG‐3′ | 400 | 62 |
| 5′‐CATGAGAGCAGCTCCTTG‐3′ | | |
| CK 19型 | 5′‐CGAACCAAGTTGAGACGAAC‐3′ | 600 | 62 |
| 5′‐CCGCTGGTACTCGTATTCTGC-3′ | | |
| 对照7 | 5′-tcatcgacaaggtgcgttc‐3′ | 400 | 62 |
| 5′-CTGCAGCTCTGTCAACTCCGTC‐3′ | | |
| CX 32型 | 5′‐GGCGTGAACCGATTCTAC‐3′ | 400 | 61 |
| 5′‐ACAACAGCCGGAACACACCG‐3′ | | |
| CX 43型 | 5′‐TGGCCTTCTTGCTGATCCAG‐3′ | 400 | 58 |
| 5′‐TTGCGGCAGAGAGAATATTTTC‐3′ | | |
| 甲胎蛋白 | 5′‐TTGCCCAGTTGTTCAAGAGC‐3′ | 400 | 59 |
| 5′‐CGAGCAGCAAAAGAGAATTG‐3′ | | |
| 转铁蛋白 | 5′‐GTGGCCTTTTGTCAAGCA‐3′ | 565 | 52 |
| 5′‐CTCCATCCAGCTCATG‐3′ | | |
| 白蛋白 | 5′‐GATGTCTCCTGGGCA‐3′ | 645 | 52 |
| 5′‐CTTGGGCTTTGTTTCAC‐3′ | | |
| PCK1型 | 5′‐GGCGCACCATGTG‐3′ | 398 | 58 |
| 5′‐AGGATCAGATGTGCTC‐3′ | | |
| CPS公司 | 5′‐CTGTAAAAGCCATGAAGG‐3′ | 399 | 60 |
| 5′‐CAATGGTGTCTGCTGCC‐3′ | | |
| CYP3A4年 | 5′‐TCTCATCCCAGACTTGGCCAT‐3′ | 300 | 55 |
| 5′‐GGAGACAGAATAACATTCTTT‐3′ | | |
| GAPDH公司 | 5′‐CCA TGG AGA AGG CTG GGG‐3′ | 195 | 63 |
| 5′‐CAA AGT TGT CAT GGA TGA CC | | |
| 低密度脂蛋白 | 5′-ATG GAG AGC AAA GCC CTG CTC‐3′ | 299 | 63 |
| 5′-TAC AGG GCG GCC ACA AGT TTT‐3′ | | |
| PPAR‐γ2 | 5′‐GCT GTT ATG GGT GAA ACT CTG‐3′ | 351 | 63 |
| 5′-ATA AGG TGG AGA TGC AGG CTC‐3′ | | |
| 骨钙素 | 5′‐GTG CAG AGT CCA GCA AAG GT‐3′ | 274 | 60 |
| 5′-CTG GAG AGC AGC ACT GG-3′ | | |
| 骨结合蛋白 | 5′‐GTG CAG AGG AAA CCG AAG AG‐3′ | 202 | 63 |
| 5′-AAG TGG CAG GAA GAG TCG AA-3′ | | |
人骨髓间充质干细胞移植于Pfp/Rag2小鼠
所有动物实验程序均符合德国动物保护法规。Pfp/Rag2型−/−在8个月大时从欧洲Taconic获得小鼠（NK细胞功能障碍、T细胞和B细胞耗竭）。移植前，用每毫升饮用水0.1毫克盐酸丙醇（Schwarz Pharma）治疗小鼠24小时，可暂时抑制肝再生。肝部分切除术后，1×106 如前所述，在HHMM中预处理14天的hBM‐MSCs通过脾内注射给药。在7周和12周后取出肝脏，并在异丙醇中冷冻并储存在−80°C或固定在3%甲醛中以进行进一步分析。
免疫细胞化学
在−20°C下用丙酮/甲醇（v/v，1:1）固定细胞20分钟。在含有5%BSA和0.5%吐温20的PBS中封闭20分钟后，在37°C下用一级抗体和二级抗体孵育细胞过夜，并孵育1小时。在每个步骤之间，用PBS中1%的BSA清洗细胞。使用以下主要抗体：抗CK18抗体（1:100，Progen Biotechtick）、抗CX32（1:5000，Sigma）和抗HepPar1（1:50，DakoCytomation）。针对磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PCK1）的兔多克隆抗体针对包含大鼠细胞溶质形式的酶（Eurogentec）氨基酸385至399的肽。Alexa Fluor488山羊抗鼠抗体（1:400，分子探针）和抗兔FITC偶联抗体（1:860，Sigma）用作次级抗体。
免疫组织化学
从福尔马林固定肝脏的1μm连续切片中去除石蜡后，将切片置于pH 6.0的10 mM柠檬酸盐缓冲液中，在96°C下培养10分钟；在室温下用0.3%过氧化氢在甲醇中灭活内源过氧化物酶30min，并在37℃下用5%牛血清白蛋白和0.1%吐温20在磷酸盐缓冲液中封闭1h。将抗HepPar1（1:50）、抗PCK1（1:100）、抗CX32（1:500）和抗人血清白蛋白（1:1000；Abcam，UK）抗体添加到封闭培养基中，并在37°C下培养2小时。将溶解在封闭缓冲液中的标记二级抗体（HRP标记的抗鼠抗体，1:400，BD Transduction Laboratories或HRP标记抗兔抗体，1:860，BD Traduction Laboritories）在37°C下添加1小时，然后在室温下将DAB Chromogen（DAKO）孵育10分钟。使用Vectastain Elite ABC试剂盒（抗兔）（Vectorlabs）对人白蛋白进行染色。
人Alu序列和小鼠主要卫星DNA的荧光原位杂交
切片在二甲苯中脱蜡，并在分级乙醇系列中再水化。在微波炉中使用pH 6.0的0.01M柠檬酸盐缓冲液进行表位检索。冷却后，同时添加荧光素标记的Alu（BioGenex，San Ramon，CA，USA）和DIG标记的小鼠主要卫星DNA（O Brüstle博士的礼物）探针，用盖玻片覆盖玻片并用橡胶胶密封。切片在杂交器（丹麦DakoCytomation）上在95°C下变性10分钟，然后在30°C下杂交过夜。去除橡胶胶结物和盖玻片，并使用含0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）的SSC对截面进行严格清洗：2×SSC/0.1%SDS，室温下2×5分钟，0.1×SSC，40°C下10分钟，2×SSC/0.1%SDS5分钟，室温下5分钟。按照制造商的方案，在室温下用3%BSA/1×PBS/0.1%吐温20封闭载玻片1小时，然后用亲和素-生物素封闭（Vector Lab.，Burlingame，USA；SP‐2001）。使用生物素化抗荧光素抗体（Vector Lab.；BA‐0601；稀释度1:100）和链霉亲和素‐Cy2（Jackson ImmunoResearch Baltimore，MD，USA；016‐220‐084；稀释度1-100）检测人类探针。使用抗DIG的Cy3偶联二级抗体对小鼠特异性探针进行可视化（Jackson ImmunoResearch；200‐162‐156；稀释度1:250）。每种抗体孵育后，用pH 7.4的PBS清洗载玻片三次。使用浓度为2.3μg/ml的4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）（分子探针）对细胞核进行复染。使用激光扫描共聚焦显微镜（LSM 510；Zeiss，Oberkochen，Germany）在543 nm（氦/氖，红Cy3免疫荧光）和488的激发波长下检测免疫荧光nm（氩，黄绿色Cy2免疫荧光）。
工具和分析
在用10%SDS–聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）电泳分离40μg可溶性蛋白并使用以下抗体稀释液转移到PVDF膜后，进行Western blot分析：抗HepPar1（1:300）、抗CX32（1:500）、抗CK18（1:200，Santa Cruz）和抗PCK1（1:500。在4°C下培养过夜后，用辣根过氧化物酶结合二级抗体（BD Biosciences Pharmingen）和ECL检测系统（Amersham Biosscience）检测免疫复合物。
通过常规周期性酸-希夫（PAS）染色，在丙酮/甲醇固定的细胞中观察糖原沉积。
根据Wybenga，使用比色二乙酰单肟法测定培养基中的尿素浓度等.27
hMSC与人原代肝细胞的转染
根据说明书，将分化的hBM‐MSCs和培养24小时的人肝细胞瞬时转染Effectene（Qiagen）。细胞密度为2×104 细胞/厘米2，0.8μg报告质粒（pDsRed2‐N1，Invitrogen/Clontech Laboratories），在人类PCK1启动子的控制下表达红色荧光蛋白（RFP）28已添加。17小时后，培养基换成新鲜HHMM；此后每四天更换一次培养基。
结果
人骨髓间充质干细胞（hBM-MSCs）的特征
通过塑料粘附从人骨髓单个核细胞组分中选择的细胞显示出MSCs的典型特征，特别是各自的体外生长模式、流式细胞术评估的表型和多重分化潜能。
培养5天后，分离的单细胞开始生长为成纤维细胞样细胞的集落，从而呈现为典型的集落形成单位成纤维细胞（CFU‐Fs）。培养12天后，流式细胞仪显示出具有特征性非造血表型的均质细胞群。CFU‐Fs表达CD13、CD29、CD44、CD105和CD166，但CD11c、CD14、CD45、CD34、糖蛋白-A和HLA-DR呈阴性（图1A).
图1 人骨髓间充质干细胞的特征（A）第一代人骨髓间质干细胞表型。用相应的FITC或PE标记抗体培养细胞，并通过流式细胞术（平均通道荧光直方图）进行分析。数据来自10个独立实验的一个分析代表。填充曲线特异性抗体，未填充曲线同型对照。（B） 非克隆人骨髓基质干细胞的多重分化潜能。传代一次后，融合细胞在（未分化）或与成骨或成脂分化培养基孵育后用茜素和油红染色。缩微照片（原始放大倍数×100）代表10个独立实验中的一个实验结果。（C） 克隆人骨髓基质干细胞的多重分化潜能。从单个细胞生长的融合hBM‐MSC培养物的总RNA在成骨（O）或成脂（A）分化之前和之后采集，并通过RT-PCR分析各个谱系分化的基因或组成性表达的基因（GAPDH）。所示数据代表了三个具有类似结果的独立实验。
通过在非克隆细胞培养和单细胞培养中诱导成骨和成脂分化，证明了CFU‐F的多重分化潜能。油红染色显示，脂肪分化导致细胞内脂滴积聚。成骨分化产生细胞外沉淀物，通过茜素染色鉴定为钙沉积（图1B).
为了证明克隆细胞培养的多重分化潜能，从单个细胞中产生了hBM‐MSC群体。与非克隆分化hBM-MSC群体一样，诱导成脂分化和成骨分化后，分别观察到脂滴积聚和钙沉积（未发表数据）。此外，分化细胞表达对脂肪细胞（如PPAR‐γ2和LPL）或成骨细胞（如骨钙素）特异的基因。如前所述，13在单细胞来源的hBM‐MSCs的未分化培养物以及成骨或脂肪分化细胞培养物中可以检测到早期成骨分化的基因转录物，如骨连接蛋白（图1C).
hBM‐MSCs的体外肝源性预处理
hBM‐MSC体外肝源性分化的主要决定因素是生长细胞汇合，以及使用含有HGF和EGF的培养基改变培养条件，从繁殖到分化。经过15天的培养，细胞形态从纺锤形变为多边形，通常与成人肝细胞有关（图2A). 细胞角蛋白18（CK18）是一种主要在上皮细胞中表达的中间丝蛋白，与转化相关，其表达上调，如免疫细胞化学和蛋白质印迹分析所示（图2B). 未分化细胞中几乎不表达的功能性体外标记物的出现进一步证实了细胞的肝细胞表型。诱导后2至3周，分化细胞表达肝缝隙连接蛋白连接蛋白32（CX32）、肝细胞特异性抗原HepPar1和糖异生的胞浆关键控制酶磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PCK1）（图2B). 在22天的培养期内，通过RT-PCR分析MSCs向肝细胞样细胞的分化过程（图2C). 除了肝干细胞特异性缝隙连接蛋白CX43的mRNA表达外，29它已经在未分化细胞中高度表达，是早期肝源性分化标志物的mRNA，如甲胎蛋白（AFP）、CK19和CK729在培养7天内上调，随后逐渐减少或消失。相反，分化良好的肝细胞标记物的转录物，如外源性代谢酶细胞色素P450 3A4亚型（CYP3A4）、糖异生PCK1、尿素循环酶氨甲酰磷酸合成酶（CPS）、肝细胞特异性缝隙连接蛋白CX32、，上皮标记物CK18和分泌性血浆蛋白白蛋白和转铁蛋白（TFN）呈时间依赖性上调，在诱导后第2周和第3周高表达。因此，使用所述培养条件，hBM-MSCs产生了上皮细胞和肝细胞特异性表型，我们称之为hBM-MSCs的肝细胞预处理。然而，细胞的体外分化依赖于细胞间的接触。尽管在HHMM培养基中培养，但MSCs在未生长到汇合的培养基中没有获得肝细胞特异性特征（未发表的数据）。
图2 hBM‐MSC体外肝细胞预处理。（A） 形态变化。在分化过程中，随着培养的进行（第7天和第15天），hBM‐MSCs从成纤维细胞样纺锤形（未分化）变为肝细胞样多边形。（B） 肝细胞特异性蛋白的检测。分化前（u）和在分化培养基中不同培养日（分别为第21天（上部）和第4、11、31天（底部））的细胞中CK18、CX32、HepPar1和PCK1的免疫细胞化学染色（上部面板）和Western blot（底部面板）检测。（C） 肝细胞特异性RNA转录物的表达。在分化前（u）和分化培养基中不同培养时间（第7、15、22天）从hBM‐MSCs中提取总RNA。RNA转录物通常在早期（AFP、CK19、CK7、CX43）和晚期（CYP3A4、ALB、CPS、CK18、CX32、PCK1、TFN）分化的肝细胞中表达，在正常化到GAPDH转录物数量作为内部标准（未显示）后通过RT-PCR检测。WB、Western blot。
为了证明hBM‐MSC肝细胞分化的诱导是否依赖于HHMM中特定因子的存在，而不是一种默认机制，将细胞在生长培养基中培养3周。RT-PCR检测特异性标记的表达。细胞生长融合并表达CK7，但不表达CK19和AFP（肝细胞祖细胞标记物）。他们也不表达白蛋白和CYP3A4（分化的肝细胞标记物）。因此，hBM‐MSCs的肝细胞分化不是默认机制，而是取决于特定诱导肝细胞表型的因素的提供（数据未显示）。此外，无论是生长融合还是单独使用HHMM治疗（见上文）都不足以将hBM‐MSCs分化为具有肝细胞特异性特征的细胞。
肝细胞预处理hBM‐MSCs的体外代谢功能
肝细胞特异性代谢功能，即糖原储存、尿素合成和PCK1肝细胞特异启动子激活，在分化的hBM-MSCs中测定。虽然PAS染色在未分化细胞中只检测到低水平的糖原，但与成纤维细胞的染色相当（图3A，I对比图3A、III)–培养21天后分化的hBM‐MSCs糖原高度阳性，其染色模式与用作阳性对照的原代人类肝细胞相同（图3A，II与图3A、IV相比).
图3 体外预处理后人骨髓间充质干细胞的肝细胞特异性功能。（A） 糖原沉积。分化前（I）和分化培养21天后（II）用PAS染色检测细胞中的糖原。为了进行比较，用3T3成纤维细胞（III）和培养的原代人肝细胞（IV）进行PAS染色。（B） 尿素合成。如图所示，在分化前（u）和分化培养基中培养的不同时间点，在培养hBM‐MSCs的培养上清液中测定尿素。（C） 激活PCK1基因启动子。在分化培养基中培养15天后，预处理的hBM‐MSCs转染来自肝细胞特异性PCK1启动子表达RFP的报告基因质粒。培养24小时后检测到红色荧光（II）。为了进行比较，转染培养的原代人肝细胞（I）。两个实验的转染效率均为0.1%。
肝细胞的另一个主要代谢功能是通过测量上清液中的尿素分泌来评估尿素循环中尿素合成对氨的解毒作用。在未分化的hBM-MSC中，尿素的产生最小，但在培养35天后增加了10倍，证实了hBM-MSC的时间依赖性肝细胞分化（图3B).
通过糖异生作用形成的葡萄糖在肝脏中受PCK基因（PCK1）胞浆形式上调的调节。诱导后15天，在人PCK1基因启动子的控制下，用表达RFP的报告基因构建体转染hBM-MSC。两天后，显微镜下检测到红色荧光细胞，显示PCK1基因启动子在相应细胞中激活。尽管通过CMV启动子的RFP表达监测转染效率为0.1%，但只有10%的转染细胞通过激活的PCK1基因启动子表达RFP（图3C，II). 然而，用相同的构建物转染原代人肝细胞的转染效率相似，为0.1%，同样只有10%的转染肝细胞用PCK1基因启动子表达RFP（图3C，I).
肝细胞预处理hBM‐MSCs在小鼠肝脏中的功能性植入
部分肝切除通过刺激残留肝细胞的增殖来刺激肝再生。30为了使移植的肝细胞预处理hMB‐MSCs比宿主肝细胞具有生长优势，免疫缺陷Pfp/Rag2−/−在部分肝切除术前用β受体拮抗剂普萘洛尔治疗小鼠，以阻止残留肝细胞的增殖。31,32脾内给药后，肝细胞预处理的hBM‐MSCs通过门静脉输送至小鼠肝脏。12周后，处死动物，用免疫组织化学方法检测肝细胞特异性蛋白的表达。通过抗人HepPar1抗体染色在小鼠肝脏背景中检测到人类细胞，该抗体与小鼠抗原没有相关的交叉反应性。在相应的连续切片中，PCK1、CX32、人白蛋白和糖原沉积被用作移植肝源性hMB‐MSCs功能活性的标记物。HepPar1与门脉周围标志酶PCK1共定位，33从而在低倍镜下显示出移植的人类细胞主要是门脉周围植入的（图4A). 高倍镜证实HepPar1与糖异生的关键控制酶PCK1和缝隙连接蛋白CX32共同表达，作为分化肝细胞的标记物（图4B). 肝源性hMB‐MSCs中人白蛋白的储存可通过无交叉反应的抗人抗体进行特异性识别（图4C)而通过PAS染色可以在HepPar1阳性细胞中检测到糖原沉积（图4D). 在移植到小鼠肝脏后，肝细胞预处理的hBM‐MSCs继续具有人类肝细胞表型和相关能力，表明移植细胞在小鼠肝脏内的功能整合。
图4 体外预处理后移植hBM-MSCs的肝细胞特异性功能。（A） 主要的门脉周围植入。hBM‐MSCs在体外预处理14天。然后从培养皿中分离分化的hBM‐MSCs，并将106个细胞输送至Pfp/Rag2的肝脏−/−小鼠脾内注射。移植后12周处死动物。通过肝细胞特异性HepPar1（I）的表达对移植的人类细胞进行免疫组织化学检测。在连续切片中检测PCK1的表达，以确定肝脏的门脉周围区域（II，箭头）（原始放大倍数×100）。（B） 肝细胞特异性蛋白的表达。移植细胞通过人类肝细胞特异性HepPar1（II，IV）的表达进行鉴定，通过免疫组织化学方法在连续切片中与PCK1（III）和CX32（V）的表达共同定位（箭头，原始放大倍数×400）。在（BI）中，显示了省略一级抗体的阴性对照。（C） 白蛋白的表达。通过抗人白蛋白特异性抗体检测白蛋白的表达来鉴定移植细胞（III）。在（I）中，非移植动物的小鼠肝脏切片和（II）中，人类肝脏切片分别显示为阴性或阳性对照，用人类抗人白蛋白特异性抗体染色。（D） 糖原沉积。移植细胞通过HepPar1（I）的表达进行鉴定，该表达与糖原（II）通过PAS方法染色的连续切片共定位（原始放大倍数×400）。
细胞融合已被证明是移植造血干细胞在FAH缺乏小鼠模型中获得肝细胞特征的主要机制。9在本研究中，通过荧光原位杂交（FISH）未观察到人类Alu序列和小鼠主要卫星DNA的共定位。在对三只动物进行分析的九个肝脏切片中，未发现移植肝细胞预处理hBM‐MSCs与小鼠宿主肝细胞融合的证据，这表明细胞融合不是常见事件（图5).
图5 未经细胞融合在小鼠肝脏中移植预处理hBM‐MSCs。移植后3周用FISH检测小鼠主要卫星DNA和人类Alu序列。非移植动物（A）和人类肝脏（B）的小鼠肝脏分别与Alu（绿色荧光）和小鼠主要卫星DNA（粉红色荧光）探针孵育，以证明与各自DNA序列的特异性杂交，而无需交叉杂交。当探针同时应用于移植动物的组织切片时，通过来自小鼠主要卫星DNA（粉红色信号）和人类Alu序列（绿色信号）（C）的特定杂交信号来识别小鼠和人类细胞核。未观察到信号的共定位，表明细胞融合是一种罕见的事件。（棒材10μm）
讨论
来自hBM‐MSCs的肝细胞
来源于人类骨髓的MSCs显示出两个显著特征：（1）在培养中，它们在塑料支架上克隆生长，允许选择不受造血细胞污染的细胞；（II）它们在体外分化为多种细胞系，包括成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞和肝细胞（有关综述，请参阅34,35). 最近，来自脂肪组织等其他来源的MSCs的肝源性分化23和脐带血8,24已经在体外和体内得到证实。我们在此提供的数据支持并建立在这些发现的基础上。用于选择MSCs的方案产生了高度纯化的细胞，根据其表型特征，未被造血干细胞污染，并且能够进行成骨和成脂分化。MSCs还分化为具有拓扑整合（CK18）和细胞-细胞通讯（CX32）以及代谢（CYP3A4、PCK1、CPS）和分泌（ALB、TFN）功能相关特定特征的肝细胞样细胞。事实上，以时间依赖的方式，分化的MSCs开始产生尿素（这需要尿素循环的复杂代谢网络）并激活PCK1基因启动子（这反映了激活启动子所需的几个转录因子的相互作用）。36,37此外，细胞储存糖原，这是肝细胞在葡萄糖稳态中发挥重要作用的基本但重要的条件。
特异性抗原HepPar1、CX32、PCK1、白蛋白的表达和糖原的沉积表明，将细胞移植到免疫缺陷小鼠的肝脏后，肝细胞表型和功能保持不变。到目前为止，只有两份报告描述了MSC移植的类似实验，都依赖于干细胞的体内分化。在第一项研究中，将人类脂肪基质细胞注入CCl的尾静脉4治疗NOD/SCID小鼠。2310天后，通过人类白蛋白的表达将植入细胞定位在肝脏中，但仅限于醉酒动物，这表明移植的干细胞也需要比宿主肝细胞更具生长优势。在第二项研究中，在异基因大鼠模型中，在烯丙醇中毒后，将人CD34阴性MSCs直接注入肝脏。再次，即使在移植后，也会持续给予毒素，以诱导移植细胞的高选择性移植和分化压力。25在这两个实验中，干细胞衍生的肝细胞占总肝质量的比例均不超过1%。虽然尚未进行定量分析，但从粗略估计的百分比可以得出结论，该数值与我们使用体外分化MSCs的研究中的数值相同。因此，体内干细胞增殖和分化似乎不利于成功的细胞移植。然而，使用体外预处理的干细胞衍生肝细胞代替未分化的细胞可以避免高选择压力的需要，从而使该方法的临床传播更加可行。
据报道，与宿主肝细胞的细胞融合是骨髓移植造血干细胞向肝细胞分化的主要机制。9,38然而，它似乎仅限于具有高选择性压力的FAH小鼠模型。此后，许多研究表明，在各种不同的动物模型中，造血干细胞和间充质干细胞在没有细胞融合的情况下向肝细胞分化。7,8,25,39同样，在我们的研究中，没有明显的证据表明这一过程（图5).
肝细胞预处理hBM‐MSCs的分化
使用人多能成体祖细胞（MAPCs）（MSC的一个亚群）进行的初步实验表明，这些细胞需要35次群体倍增才能达到肝源性分化。19不太严格的条件（即培养扩增五代）已被用于实现脂肪组织和骨髓来源MSCs的肝源性分化。23,25在本研究中，我们只使用了一次传代的细胞。在更多传代后，MSCs开始表达CK18，反映了从干细胞向早期分化上皮细胞的转变（未公布的数据）。在长时间培养过程中，单独的塑料粘附或细胞-细胞接触可能会启动这种上皮分化，事实上，只有在融合培养中才能实现肝源性分化，这强调了细胞间通讯对分化过程的相关性。19
在我们的研究中，利用培养条件和先前建立的生长因子milieus（HGF，EGF）启动肝细胞分化，以在长期培养中保持人类原代肝细胞的分化表型。26HGF和EGF的结合也被证明是一种有效的肝功能刺激物，例如卵圆形细胞衍生肝细胞中白蛋白和尿素的生成。40因此，生长因子的这种特定组合似乎是前体/干细胞分化为肝细胞的关键因素。经生长因子处理后，hBM‐MSCs在体外按明显的时间顺序分化，首先表达AFP、CK7和CK19等早期分化的肝源性谱系标记。培养2周后，这些被成熟肝细胞的标记物取代，如白蛋白、CK18或P450酶CYP3A4。因此，体外hBM‐MSC的肝源性分化是否遵循肝器官发生过程中前体细胞的肝细胞谱系尚有待推测。事实上，我们自己的初步结果表明，hBM‐MSCs在存在FGF‐4而非EGF的情况下生长，表达肝祖细胞标记物（如AFP、CK7和CK19）的强度更高，持续时间更长（数据未显示），这与FGF4在原肠内胚层模式中的作用相一致。41体外和体内均报告了肝发生后hBM‐MSCs的时间分化，19,25并建议将脐血来源的MSCs体外分化为肝细胞样细胞。24
hBM‐MSC衍生肝细胞的临床意义
过去30年来，肝细胞移植被认为是全肝移植的替代方案。42一个主要障碍一直是可用肝细胞植入不良。如今，供体器官的日益短缺也加剧了可移植肝细胞的短缺，并使干细胞衍生肝细胞成为一种有吸引力的替代资源。由于临床和伦理上的反对，成人干细胞比胚胎干细胞更适合作为起始细胞材料。骨髓、脂肪组织间充质干细胞23或脐带血43易于接近，可以在体外扩张，并且可以在无污染的情况下回收。如前所述，它们具有分化为功能性肝细胞样细胞的潜力。然而，关于其分化和肝脏再生机制的可用数据有限。在CCl中4经治疗的纤维化小鼠，注射小鼠Flk1+骨髓间充质干细胞改善了病理血清参数和肝脏组织学。21在这里介绍的研究中，部分肝切除模型用于评估移植细胞在肝再生中的参与。然而，分化的hBM‐MSC并没有实现再生器官的有效再生。至少2.5%到5%的人类肝脏需要由健康细胞替代，以扭转病理状况。44我们研究中的低再生效率很可能是异种移植的结果，小鼠肝脏无法提供有效整合人类细胞所需的适当细胞-细胞或细胞-基质通信。然而，现有数据表明MSC衍生肝细胞具有功能性植入。未来研究的目标是提高MSC成功替代病变肝组织的能力。
