内脏。2006年4月；55(4): 463–468.
根除幽门螺杆菌感染逆转E-cadherin启动子高甲基化
阿奥·陈,J Z彭,S K Lam公司,K C Lai公司,M F Yuen先生,H K L Cheung先生,Y L Kwong先生,陈可辛,B C‐Y Wong先生香港大学医学系
拉希德德克萨斯大学病理学系，美国德克萨斯州休斯顿安德森癌症中心医学博士
致：B C‐Y Wong博士
香港大学医学系，香港玛丽女王医院；bcywong@hku.hk
2005年8月24日修订；2005年9月20日接受。
摘要
背景
钙粘蛋白甲基化在胃癌发生中起重要作用。逆转超甲基化可能会阻止致癌过程。我们之前曾报道过幽门螺杆菌慢性胃炎患者感染与E-cadherin甲基化有关。
目标
检查是否根除幽门螺杆菌可以逆转E-cadherin甲基化。
方法
消化不良患者幽门螺杆菌感染，粘膜活检显示慢性活动性胃炎，随机接受幽门螺杆菌根除治疗（组1，n=41）或不治疗（组2，n=40），并进行前瞻性随访。在第0周（治疗前）和第6周（治疗后）取胃粘膜进行甲基化检测。肠化生存档标本幽门螺杆菌检索感染（n=22）和未感染（n=19）进行甲基化分析。使用甲基化特异性聚合酶链反应和测序评估甲基化。
结果
在第0周和第6周，第1组中分别有46%（19/41）和17%（7/41）的患者检测到E-钙粘蛋白甲基化（p=0.004）；78.9%（15/19）的标本在根治后未甲基化幽门螺杆菌在第6周，粘膜活检显示35名患者患有慢性非活动性胃炎，1名患者患有肠化生，5名患者的粘膜正常。在第0周和第6周，第2组分别有47.5%（19/40）和52.5%（21/40）的患者检测到甲基化（P=0.5）。所有病例的胃粘膜活检均显示持续性慢性活动性胃炎。甲基化频率在幽门螺杆菌肠化生标本阳性或阴性（72.7%v（v）63%; p=0.5）。
结论
幽门螺杆菌根除治疗可以逆转慢性胃炎患者的甲基化。这证明了环境对甲基化的影响。
关键词：钙粘蛋白甲基化、胃癌、肠化生、幽门螺杆菌
胃癌的发生是一个多步骤的过程，涉及多种遗传和表观遗传事件，在形态学进展过程中存在假定的肠化生-异型增生-侵袭性癌序列。1幽门螺杆菌感染是胃癌的一个重要病因危险因素，世界卫生组织国际癌症研究机构已将其归类为I类或明确致癌物。2
钙粘蛋白是一种粘附分子，在所有上皮细胞上表达。三,4它是一种重要的肿瘤抑制和侵袭抑制基因。在胃癌发生过程中，家族性胃癌与E-cadherin基因的种系突变有关，这一观察结果强调了E-cadherin的关键作用。5,6此外，约50%的弥漫组织型胃癌中发现E-cadherin的体细胞突变。7最后，在两个家族性胃癌和种系E-cadherin突变的家系中，发现启动子CpG超甲基化是消除E-cadherin表达的第二个“基因打击”。8现在越来越多的人认识到，启动子CpG超甲基化对基因表达的表观遗传沉默是灭活癌症中肿瘤抑制基因和肿瘤相关基因的重要替代机制，9,10胃癌及其前体。11,12
我们之前已经证明，E-cadherin蛋白在胃癌癌前病变的早期表达降低，提示E-cadherin可能在胃癌的早期发挥作用。13E-cadherin的甲基化在胃癌癌前病变早期被发现，在31%的慢性胃炎胃粘膜中发现。14更重要的是，幽门螺杆菌是与消化不良患者非病变胃粘膜中E-cadherin甲基化相关的独立危险因素。14
靶向发生在恶性肿瘤发生之前的表观遗传变化作为化学预防干预提供了最大的影响。10,15因此，在胃癌中，在坦率的胃癌发展之前，早期逆转癌前病变的启动子甲基化可能会阻止胃癌的发生。我们假设幽门螺杆菌感染可能是导致E-cadherin甲基化和根除幽门螺杆菌可能逆转甲基化钙粘蛋白我们通过检测无胃癌患者在根除胃癌前后慢性胃炎胃粘膜中E-cadherin基因的甲基化来验证这一假设幽门螺杆菌以及有或无肠化生的患者幽门螺杆菌感染。
材料和方法
患者和标本
研究了两组患者。构成本研究大多数患者的第一组队列来自一项前瞻性随机对照研究。来自香港玛丽皇后医院内科的90名患者接受了上消化道内窥镜检查，确诊为幽门螺杆菌研究招募了阳性受试者。以下人员的在场幽门螺杆菌通过快速尿素酶试验和随后使用苏木精-伊红和改良的Giemsa染色进行的组织学分析确认感染。平衡病例被排除在分析之外。这种方法以前在我们中心已经过验证。16取胃窦粘膜活检进行组织学分析、E-cadherin免疫组化染色和甲基化研究（第0周）。血红素-伊红染色载玻片评估是否存在慢性胃炎、肠化生或异型增生。组织学评估根据悉尼分类进行分类。
只有在确认以下情况后，胃粘膜组织学显示慢性活动性胃炎，患者才被纳入研究幽门螺杆菌感染。然后将患者随机分为两组：第1组受试者接受幽门螺杆菌第2组不接受任何治疗。幽门螺杆菌根除治疗包括阿莫西林1000mg两次/天、克拉霉素500mg两次/每天和奥美拉唑20mg两次/d，为期一周。所有患者均进行了为期六周的前瞻性随访。在六周（第6周）结束时再次进行上内窥镜检查。的状态幽门螺杆菌用同样的方法重新评估感染情况。再次进行胃窦粘膜活检，进行组织学、免疫染色和甲基化分析。
为了评估胃窦甲基化的一致程度，在第0周对10名患者中的每一位进行了另外五次随机胃窦粘膜活检。一致甲基化被定义为每个患者至少四个活检样本中E-cadherin基因的相同甲基化状态（阴性或阳性）。所有患者都获得了组织采购的知情同意。
第二个队列包括存档的胃窦活检标本，其中记录了来自以下患者的肠化生：幽门螺杆菌阳性（n=22）幽门螺杆菌阴性（n=19）作为对照。这项研究得到了我们机构审查委员会的批准。
甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）
如前所述，胃粘膜组织通过显微解剖从5μm厚的苏木精-伊红染色石蜡包埋组织切片中获得，无需盖玻片，然后进行DNA提取。17甲基化状态E‐钙粘蛋白如前所述，启动子是通过亚硫酸氢钠处理DNA后再进行MSP来确定的。18MSP是由一名不知道标本临床数据的操作员进行的。简单地说，2μg DNA在37°C下用2 M NaOH变性10分钟，然后在50°C下与3 M亚硫酸氢钠（pH 5.0）孵育16小时。然后纯化亚硫酸氢盐处理的DNA（DNA清理试剂盒；美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加），在室温下用3 M NaOH孵育5分钟，用10 M醋酸铵和100%乙醇沉淀，用70%乙醇洗涤，并在20μl蒸馏水中重新悬浮。然后使用Herman及其同事描述的引物，通过聚合酶链反应（PCR）为E-cadherin基因扩增DNA（2μm）（表1).18CpGenome Universal Methylated DNA（Intergen，Purchase，New York，USA）和试剂空白在每个实验中用作阳性和阴性对照。所有试验重复进行。如前所述，为了确认MSP的特异性，对甲基化和非甲基化引物的PCR产物进行凝胶纯化和测序。19
表1 E-cadherin、DAPK、MGMT、hMLH1、p16和ORβ的引物和聚合酶链反应条件
| 基因座 | 阿勒 | Sense引物 | 反义引物 | 退火温度（°C） |
|---|
| E‐钙粘蛋白 | 甲基化 | 5〃‐TTAGGTTAGAGGGTTATCGCGT‐3〃 | 5′-tacactaaaattcacctaccgac‐3′ | 57 |
| 未甲基化 | 5′‐TAATTTTAGGTTAGAGGTTATTGT‐3′ | 5′‐CACAACAACATCAACAACACAA‐3′ | 53 |
| DAPK（DAPK） | 甲基化 | 5′‐GGATAGTCTCGAGTTAACGTC‐3′ | 5′‐CCCTCCCAAACGCGA‐3′ | 60 |
| 未甲基化 | 5′‐GGAGGATAGTGGATTGAGTTAATGTT‐3′ | 5′‐CAAATCCCCCACAACACACACACA‐3′ | 60 |
| MGMT公司 | 甲基化 | 5′‐TTTCGACGTTCGTAGGTTTCGC‐3′ | 5′-gactcttccgaaacgaaacg-3′ | 59 |
| 未甲基化 | 5′‐TTTGTTTTGATGTTGTGTGTGTTTGTGT‐3′ | 5′‐AACTCCAACCACTCTTCCAAAAAAAACA‐3′ | 59 |
| hMLH1型 | 甲基化 | 5′‐TATATCGTCGTAGTATTCGT‐3′ | 5′‐TCCGACCCGAATAAACCCAA‐3′ | 60 |
| 未甲基化 | 5′‐TTTTGATGTAGTTTTTTTATTAGGTGT‐3′ | 5′‐ACCACCTCATCATAACTACCCACA‐3′ | 60 |
| 第16页 | 甲基化 | 5′‐TTATTAGAGGGTGGGGGCGCGC‐3′ | 5′‐GACCCCGAACCGACCGTAA‐3′ | 65 |
| 未甲基化 | 5′‐TTATTAGAGGGTGGGGGTGTT‐3′ | 5′‐CAACCCAAAACCACAACACCATAA‐3′ | 60 |
| ORβ | 甲基化 | 5′‐TTTGGAAGGTGGGTTTGGTC‐3′ | 5′‐CGCATACAAAATATAAAACTAACAACG‐3′ | 49 |
| 未甲基化 | 5′‐TTTGGAAGGTGGGTTTGGTT‐3′ | 5′‐CACATACAAAATAATAACAACA‐3′ | 45 |
事前和事后幽门螺杆菌在DAP激酶（DAPK）、O6甲基鸟嘌呤甲基转移酶（MGMT）、人类Mut L同源物（hMLH1）、p16基因，20和雌激素受体β（表1).21
E-cadherin的免疫组织化学染色
如前所述，使用亲和素-生物素复合物免疫过氧化物酶法通过免疫染色检查E-cadherin的表达。13简言之，将4μm厚的组织载玻片在二甲苯中脱蜡，并用酒精和水连续复水。用3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶10分钟，然后在95°C的10 mM柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）中微波抗原回收9分钟。然后将载玻片与亲和素结合的单克隆抗E‐钙粘蛋白抗体（HECD‐1，1:500稀释于磷酸盐缓冲盐水中；Zymed Laboratories Inc.，South San Francisco，USA）在37°C的湿室中孵育1小时。结合抗体通过生物素化二级抗体和亲和素-生物素复合物免疫过氧化物酶法检测（Dako Corp.，Carpindia，California，USA）。最后用迈尔苏木精对载玻片进行复染。作为阴性对照，用小鼠IgG替换一级抗体。将结肠粘膜正常的载玻片作为阳性对照。当细胞质和/或膜染色减少或缺失时，E-cadherin染色被分类为改变。
统计分析
χ2测试用于比较分类关联和学生的吨持续关联测试。采用双侧试验计算p值。
结果
消化不良患者的人口统计学数据
第一组中的两名患者被排除在研究之外，因为最初的胃粘膜活检显示有肠化生的证据。其余88名患者随机分为第1组和第2组。第1组中的3名患者和第2组中的4名患者未能进行第二次上消化道内窥镜检查，因此被排除在最终分析之外。第1组有9名男性和32名女性，第2组有11名男性和29名女性（p=0.6）。第1组患者的平均年龄为51（11）岁，第2组为47（16）岁（p=0.2）。
启动子甲基化E‐钙粘蛋白第1组患者在第0周和第6周
在第0周，所有标本均出现慢性活动性胃炎。46%（19/41）的胃黏膜标本中存在E-钙粘蛋白的启动子甲基化（图1A中的例子). 胃粘膜甲基化患者的平均年龄（51（9）岁）与非甲基化患者（51（11）岁）之间没有差异（p=0.8）。之后第6周幽门螺杆菌根除治疗，没有患者表现出持续性幽门螺杆菌感染。5名患者的胃窦活检标本组织学正常，35例活检标本显示慢性非活动性胃炎，1例标本显示肠化生（图2). 启动子甲基化E‐钙粘蛋白仅在17%（7/41）的胃粘膜标本中存在，这与根除前的标本显著不同（p=0.004）（表2; 图1B中的示例)-也就是说，在之前被甲基化的19个标本中幽门螺杆菌根除，15个（78.9%）在根除治疗后变得非甲基化（图2). 14名患者的E-cadherin启动子甲基化消失与慢性活动性胃炎逆转为非活动性胃肠炎以及1名患者的正常粘膜逆转相关。有三个未甲基化的标本在根除治疗后甲基化（图2). 其中一个显示了从慢性活动性胃炎到肠化生的组织学变化（图2). 通过DNA测序证实E-钙粘蛋白甲基化的特异性（图1C、1D). 术后出现或未出现E-cadherin甲基化的患者幽门螺杆菌根除在平均年龄上没有差异（50（8）v（v）52（11）年；p=0.5）。
图1 消化不良患者胃粘膜E-cadherin基因的CpG岛甲基化模式。MW，分子量标记；U、 非甲基化带；M、 甲基化带。（A） 在根除之前的第0周幽门螺杆菌，3号、5号和6号患者存在甲基化。（B） 根除后第6周幽门螺杆菌，甲基化在任何患者中都不存在。（C） 在根除之前的第0周幽门螺杆菌，通过使用相同的甲基化引物进行测序，确认甲基化产物。未甲基化胞嘧啶转化为胸腺嘧啶（红色），而甲基化胞苷保持不变（蓝色）。（D） 根除后第6周幽门螺杆菌，通过使用相同的甲基化引物进行测序，再次确认甲基化产物。未发现甲基化胞嘧啶。
图2 第1组41名患者的甲基化和组织学状态总结幽门螺杆菌根除。
表2 E‐钙粘蛋白胃粘膜标本甲基化前后的变化幽门螺杆菌根除
| E-钙粘蛋白甲基化 | E-cadherin非甲基化 |
|---|
| 之前幽门螺杆菌根除 | 19 | 22 |
| 之后幽门螺杆菌根除 | 7* | 34 |
第2组患者第0周和第6周E-cadherin启动子甲基化
第0周时，所有标本均出现慢性活动性胃炎。启动子甲基化E‐钙粘蛋白在47.5%（19/40）的胃粘膜标本中存在（图3A中的示例). 胃粘膜甲基化阳性和阴性患者的平均年龄分别为53（10）岁和43（14）岁（p=0.05）。在第6周，所有标本均未显示出活动性胃炎或正常胃上皮。启动子甲基化E‐钙粘蛋白在52.5%（21/40）的样本中观察到（图3B中的示例)与第0周相比，甲基化频率无差异（p=0.5）。甲基化状态E‐钙粘蛋白在第0周和第6周通过测序确认（图3C、3D). 第0周甲基化阴性的三个标本在第6周呈阳性。一个在第0周甲基化阳性的样本在第6周变成阴性。
图3 未接受治疗的消化不良患者胃粘膜中E-cadherin基因的CpG岛甲基化幽门螺杆菌根除治疗。MW，分子量标记；U、 非甲基化带；M、 甲基化带。（A） 在第0周，2号、5号和6号患者出现甲基化。（B） 在第6周，2号、5号和6号患者仍然存在甲基化。C.在第0周，通过使用相同的甲基化引物进行测序，确认甲基化产物。出现甲基化胞嘧啶。（D） 在第6周，使用相同的甲基化引物进行测序后，仍然可以观察到甲基化胞嘧啶。
第1组10名患者在第0周和第6周其他基因的启动子甲基化
表3总结了这些基因在第0周和第6周的甲基化模式在这些基因中未观察到甲基化消失。
表3 10名第1组患者在第0周和第6周DAPK、MGMT、hMLH1、ORβ和p16的启动子甲基化
| 第0周（n=10）（否（%）） | 第6周（n=10）（否（%）） |
|---|
| DAPK（DAPK） | 2 (20) | 1 (10) |
| MGMT公司 | 0 | 2 (20) |
| hMLH1基因 | 1 (10) | 1 (10) |
| ORβ | 6 (60) | 5 (50) |
| 第16页 | 0 | 0 |
| E‐钙粘蛋白 | 5 (50) | 2 (20) |
一致甲基化的存在分析
这10名患者中的每一位都进行了五次额外的胃窦活检。8例显示一致的甲基化：4例显示一致阳性的E-cadherin甲基化（这些患者中至少有4/5的活检结果为E-cadherine甲基化阳性），4例显示相同的阴性甲基化（每个患者的所有五个活检结果均为E-cadtherin甲基化阴性）。
E-cadherin的免疫染色
第1组和第2组患者的胃粘膜免疫染色显示胃上皮有较强的膜性染色，并且在染色前和染色后没有差异幽门螺杆菌第1组患者根除。
肠化生标本中E-cadherin启动子甲基化
在第二组患者中，19名患者中幽门螺杆菌阴性标本，63%（12）显示钙粘蛋白甲基化。在22人中幽门螺杆菌阳性标本中，72.7%（16）的标本被甲基化（p＝0.5）。
讨论
我们的研究表明，通过根除幽门螺杆菌非胃癌患者慢性胃炎早期感染，启动子甲基化E‐钙粘蛋白在高比例的患者中消失。
E-cadherin基因在胃癌发生中的重要性已得到充分证明，5,6,7因此，E‐钙粘蛋白在根除前和根除后的甲基化模式幽门螺杆菌对我们的研究特别感兴趣。我们还研究了其他据报道在慢性胃炎患者中甲基化的基因。20我们选择的基因涉及细胞周期调节（p16）、DNA修复或保护（hMLH1、MGMT）和凋亡（DAP激酶）。
除了钙粘蛋白在胃癌中的重要作用外，我们在之前的工作中还证明了钙粘蛋白启动子的甲基化与胃癌相关，并提出了一个与钙粘蛋白甲基化相关的假说，幽门螺杆菌感染、肠化生和胃癌。13,14目前的研究再次表明幽门螺杆菌在没有胃癌的消化不良受试者中，感染与胃黏膜E-钙粘蛋白甲基化有关。尽管事实上，这些消化不良患者胃上皮中E-cadherin甲基化在胃癌未来发展中的作用尚不明确，但针对恶性肿瘤发生之前发生的表观遗传变化作为化学预防干预可能会产生最大的影响。因此，这些消化不良患者中E-cadherin甲基化的消失可能对预防胃癌的未来发展很重要。
在当前的研究中，我们观察到E-钙粘蛋白甲基化在幽门螺杆菌根据悉尼分类，根除与慢性胃炎活动减少相关。甲基化过程逆转的潜在机制尚不明确。我们推测这可能与术后炎症减少有关幽门螺杆菌根除。众所周知，启动子甲基化与炎症性肠病、，22,23Barrett食管炎患者的食管粘膜，24,25以及慢性肝炎的肝组织中。26在当前的研究中，我们还观察到，在肠化生存在的情况下，E-cadherin甲基化与幽门螺杆菌感染。这支持了E-cadherin甲基化的存在与潜在的慢性炎症状态有关的事实。相反，据报道，白细胞介素1β可以通过一氧化氮的作用诱导甲基化依赖性基因沉默。27最近也有报道称幽门螺杆菌上调人胃上皮细胞中可诱导精胺氧化酶的mRNA表达、启动子活性和酶活性，导致DNA损伤和凋亡。28因此，慢性胃炎阶段甲基化的消失也可能与以下因素引起的氧化应激的消除直接相关幽门螺杆菌。目前的观察结果令人感兴趣，需要进一步广泛的研究来确认潜在的机制。
此外，我们还评估了10名患者的胃窦内是否存在一致的甲基化。我们发现80%的一致甲基化状态。这意味着第0周和第6周E-cadherin甲基化的差异不太可能是由于随机活检错误造成的。
尽管我们观察到E-cadherin甲基化在前和后的差异幽门螺杆菌在胃粘膜中，我们没有观察到这些标本中E-cadherin的免疫染色有任何差异。我们假设这可能是因为MSP是检测甲基化的一种非常敏感的方法。MSP的灵敏度为10−3（结果未显示）。另一方面，免疫组织化学染色是一种定性方法，在检测基因甲基化的细胞亚群以及E-cadherin的下调方面不如PCR敏感。在通过免疫染色反映这一点之前，可能需要对大量细胞进行甲基化。
其他基因的甲基化分析也在10对预处理和后处理中进行幽门螺杆菌被根除的标本。然而，这些基因的甲基化没有观察到差异。这可能是由于样本量较小。另一方面，根据Kang及其同事的研究，胃粘膜中DAPK、MGMT、hMLH1和p16基因的甲基化频率分别为41%、18.7%、10.9%和4.1%，20它没有E-cadherin中观察到的高，这也可能是差异的原因。
目前的研究证实了我们小组在一项前瞻性随机对照研究中的观察结果，该研究表明幽门螺杆菌在慢性胃炎患者中预防胃癌，但在那些存在前驱病变（如肠化生）的患者中没有预防胃癌。29目前的研究可能部分解释了临床观察结果。消化不良患者胃粘膜上皮钙粘蛋白甲基化的消失是否能最终阻止胃癌的发展仍需进一步研究。
致谢
这项研究得到了香港嘉道理慈善基金会Michael Kadoorie癌症遗传学研究项目和香港大学Gordon YH Chiu胃癌研究基金的支持。
缩写
PCR-聚合酶链反应
MSP甲基化特异性聚合酶链反应
脚注
利益冲突：未声明。
该摘要于2004年5月在美国新奥尔良消化疾病周美国胃肠道肿瘤学全体会议：临床医学和转化研究前沿，AGA杰出摘要全体会议上口头发表。
工具书类
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