RNAi最初被描述为一种转录后基因沉默机制，其中长双链RNA（dsRNAs）的实验性引入诱导同源mRNAs的序列特异性破坏（参考文献。1). 当Dicer将dsRNAs加工成21–26个核苷酸的siRNAs时，RNAi途径启动。siRNAs被纳入效应复合物RISC。在RISC中，siRNA由精氨酸蛋白结合，精氨酸蛋白质利用siRNA的序列来选择和切割互补底物（参考文献。8).
RISC还可以通过阻止蛋白质合成来抑制基因表达。遗传研究秀丽隐杆线虫Dicer的突变体伪造了之前已知的一类小调控RNA、stRNAs和RNAi途径之间的最初联系9–13随后的研究表明，stRNAs是一大类调控RNA的原型，称为miRNAs（参考文献。14). 尽管miRNA和siRNA途径可以在生化上进行划分，但这两种类型的RNA都进入RISC，与精氨酸蛋白结合，并以概念上相似的方式确定其沉默靶点。它们的不同之处在于，至少在动物中，miRNAs通常与其靶基因不完全配对，因此无法指导精氨酸介导的卵裂15相反，miRNAs以非裂解方式抑制蛋白质合成8,14,15.
miRNAs抑制其靶mRNAs翻译的机制尚不清楚。可以想象，RISC可以通过几种方式之一阻止miRNA靶点的蛋白质合成。RISC可能影响翻译，就其本身而言通过核糖体改变起始速度或伸长速度。或者，翻译可以在新生多肽被降解的情况下不受影响地进行。第三种可能性是靶mRNA可能以某种方式与翻译机制隔离。
为了研究第三种模型，我们评估了一种体外表达的、带有Myc标记的人类精氨酸蛋白Myc–Ago2的定位，该蛋白对siRNA介导的沉默具有完全功能16免疫荧光显示Myc–Ago2在离散细胞质病灶中的定位模式，尽管一些Ago2也可能分布在细胞质中(). 单个病灶的大小和数量在单个细胞之间都有所不同，每个细胞平均有4到9个清晰病灶。在病灶中也可以检测到内源性Ago2，每个细胞的平均病灶数为3至6个(). 值得注意的是，当抗体用于染色野生型而非Ago2突变小鼠胚胎成纤维细胞时，观察到这些病灶16，表明该模式真实反映了内源性Ago2蛋白的定位（数据未显示）。表观病灶数量的差异可能是由于抗Ago2抗体比识别表位标记蛋白的单克隆抗体发出的信号弱。
精氨酸蛋白定位于哺乳动物的P体。(一)Myc-tagged Ago2蛋白在U2-OS细胞中表达。通过FITC-偶联抗Myc染色，Ago2蛋白定位于离散的细胞质病灶。(b条)用兔抗Ago2抗体染色，将内源性Ago2蛋白定位于U2-OS细胞。(c（c）)精氨酸蛋白与GFP或标记的Dcp1a共定位，这是哺乳动物P-体的特征成分。使用罗丹明红结合的抗Myc抗体对精氨酸蛋白进行可视化。Dcp1a可通过GFP或FITC-偶联抗标记物进行可视化。
Ago2出现在病灶中，而与其切割靶RNA的能力无关，正如催化功能不全突变体的定位所证明的那样（见补充信息，图S1). 所有其他已证明能结合miRNAs的哺乳动物精氨酸蛋白（Ago1、-3和-4；参见补充信息，图S2). 相反，第二个Argonaute亚家族Piwi家族的成员没有被证明与miRNAs相互作用，并且在体外表达时不会定位于细胞质病灶（例如Hiwi；数据未显示）。
含有Argonaute的病灶的模式和大小让人想起以前在酵母和动物细胞中观察到的细胞质P体（也称为Dcp体或GW体）2–5,7,17为了测试含精氨酸的病灶是P体的可能性，我们询问Ago蛋白是否与已知的P体成分共定位。Dcp1a是去盖酶的一种成分，已被证明存在于酵母和哺乳动物的P体中2–5,7将Myc–Ago1或Myc–Ago2的定位模式与Flag表位或绿色荧光蛋白（GFP）标记的Dcp1a的定位模式进行比较，显示出显著的重叠(). 在某些情况下，单个病灶中Dcp1a和Ago蛋白的相对强度不同，但仔细检查发现，基本上所有Dcp1a和Ago病灶都重叠。
由于精氨酸蛋白定位于P体，我们询问是否可以观察到Ago和其他P体成分之间的生化相互作用。我们可以很容易地检测到Myc标记的Ago1或Ago2的免疫沉淀中GFP或Flag标记的Dcp1a的存在(). 此外，当Dcp1a–GFP与GFP抗体免疫沉淀时，Ago1和Ago2共同免疫沉淀(). 此外，还观察到Myc–Ago1/Myc–Ago2与去盖酶的第二亚单位Dcp2之间的相互作用(). 精氨酸与Dcp1a或Dcp2蛋白质之间的物理相互作用可能是蛋白质-蛋白质相互作用，也可能是这些蛋白质与普通mRNA或P-体结构相互作用的结果。为了区分这些可能性，我们在免疫沉淀之前用RNaseA处理裂解产物，RNaseA既降解mRNA又破坏P-体完整性6,18即使经过这样的处理，Myc–Ago2和GFP–Dcp1a或Flag–Dcp2之间的相互作用仍然保持(). 这些结果表明，哺乳动物Ago亚家族蛋白不仅集中在P小体中，而且以独立于核糖核蛋白（RNP）或P小体完整性的方式与P小体成分Dcp1a和Dcp2进行物理相互作用。
精氨酸蛋白结合哺乳动物P体的成分。将Myc-tagged Ago1或Ago2与GFP-tagged Dcp1a或Flag-taged Dcp2表达质粒联合转染人293T细胞（如图所示）。(一)如图所示，用抗Myc或抗GFP抗体对Ago1或Ago2（抗Myc）或Dcp1a（抗GFP）免疫沉淀物进行免疫印迹。(b条)Ago1或Ago2（抗Myc）或Dcp2（抗标记）免疫沉淀物用所示的抗Myc或抗标记抗体进行免疫印迹。(c（c）)在Ago2（抗Myc）或Dcp1a（抗GFP）免疫沉淀之前，用RNaseA处理提取物。免疫复合物用所示的抗Myc或抗GFP抗体进行免疫印迹。(d日)在Ago2（抗Myc）或Dcp2（抗Flag）免疫沉淀之前，用RNaseA处理提取物。免疫复合物用所示的抗Myc或抗Flag抗体进行免疫印迹。
由于蛋白质与蛋白质的相互作用，精氨酸蛋白质可以在P体中积累，这与它们在RNAi中的功能无关。或者，精氨酸蛋白可以以一种依赖于与小RNA的完整相互作用或甚至成功的miRNA-mRNA识别的方式靶向P体。我们利用人类Ago1-PAZ结构域与siRNA-like双链结合的晶体结构作为指导，生成了两种突变的Ago2蛋白19这些突变体Ago2-PAZ9和Ago2-PAZ10在Ago2的PAZ结构域内含有9点或10点突变。这两种突变体与小RNA相互作用或切割靶mRNA的能力都显著降低(). 值得注意的是，这两个突变体都未能在P体中积累(). 这些结果与Argonaute需要与小RNA相互作用才能在P体中积累的概念一致。这一结果可能表明，通过一个介导P-体定位的因子，可以对装载有miRNA/siRNAs的Ago蛋白进行特异性识别，无论是否含有靶mRNAs。或者，这些突变可能显著改变了Ago2蛋白的整体结构，使其完全失去功能。与后一种可能性相反，Ago2-PAZ9和Ago2-PAZ10突变体均以正常水平表达，并保留与Dcp1a和Dcp2相互作用的能力(). 后一个观察结果表明，Ago–Dcp1a或Ago–D cp2相互作用不足以将Ago蛋白招募到哺乳动物P体中。因此，对Ago2-PAZ9或Ago2-PA Z10定位于P小体失败的最简单解释是，在P小体中积累Ago2需要miRNA与Ago2结合。
精氨酸蛋白在P小体中的积累需要一个完整的siRNA-结合域。(一)野生型和突变型Ago2蛋白Ago2-PAZ9和Ago2-PAZ10（如图所示）在转染荧光素酶siRNA的细胞中以Myc表位融合的形式表达。使用抗Myc抗体的Western blotting检测蛋白表达（上图）。通过免疫复合物中提取的RNA的northern印迹法测量小RNA结合（中间面板）。还针对互补底物（底部面板）测量了核酸酶活性。(b条)通过抗Myc抗体的免疫染色测定野生型和非小RNA结合突变Ago2蛋白的亚细胞定位。(c（c）)Myc标记的野生型或突变型Ago2蛋白与GFP标记的Dcp1a共表达。如图所示，用抗Myc或抗GFP抗体进行免疫印迹分析Ago2（抗Myc）或Dcp1a（抗GFP）免疫沉淀物。
P小体中存在精氨酸蛋白表明，miRNA-介导的蛋白质合成抑制可能导致miRNA-mRNA复合物靶向P小体。为了验证这一假设，我们询问miRNA靶向翻译抑制的mRNA是否会在P小体内积聚。我们生成了荧光素酶mRNA表达结构，其中含有或不含有秀丽线虫lin-413′UTR，这是let-7miRNA。两者都是let-7靶蛋白及其对照物在其3′UTR中还含有24个MS2外壳蛋白的结合位点(). 这些MS2结合位点允许我们通过共同表达MS2–YFP–NLS融合蛋白来跟踪这些mRNA的定位。在缺乏靶mRNA的细胞中，融合蛋白仍局限于细胞核，降低了背景细胞质荧光。然而，在含有适当结合位点的mRNA存在的情况下，融合蛋白的一部分被带入细胞质，其定位报告了靶mRNA的位置20.
靶mRNAs对哺乳动物P体的miRNA-依赖性定位。(一)将表达let-7靶点、Myc–Ago2蛋白和MS2–YFP–NLS的质粒共转染到U2-OS细胞中。使用融合蛋白间接观察报告者mRNA。使用罗丹明红结合的抗Myc抗体观察Ago2蛋白。(b条)分析与中的相同一但靶mRNA不含lin-41 3′UTR片段。(c（c）)CXCR4靶点与MS2–YFP–NLS和Myc–Ago2共同表达。检测与中相同一. (d日)CXCR4报告基因与MS2–YFP–NLS以及（上部）或（下部）Myc–Ago2在同样转染了CXCR4系列小干扰RNA。用兔抗Ago2抗体观察内源性Ago2。图表表示目标显示在每个面板的旁边。
的表达式let-7靶向U2-OS细胞，其内源性表达丰富的内源性let-7miRNA提供了两个观察结果。首先，包含林-413′UTR片段产生的荧光素酶比不含该位点的对照转录本少约两倍。报告基因的位点依赖性和变化幅度与先前观察到的类似报告基因的调节一致let-7（参考。21). 第二个关键的观察是，当let-7靶点在U2-OS细胞中表达，我们观察到与Myc–Ago2共定位的MS2–YFP–NLS融合蛋白的离散细胞质病灶(). Colocalization并非Ago2所独有，但在其他Argonaute亚科成员中也观察到了Colocalidation（参见补充信息，图S3). 这一观察表明let-7靶mRNA集中在细胞质P小体中。值得注意的是，缺乏let-7结合位点显示MS2–YFP–NLS蛋白没有细胞质病灶，表明该mRNA不集中在P小体中().
上述数据表明，mRNA可以以依赖于miRNA-结合位点存在的方式定位于P-体。然而，因为let-7是内源性表达的，我们不能确保定位是miRNA导向的。因此，我们构建了一个同时包含MS2结合区和多个不完全补体的靶CXCR4系列已证明作为miRNA模拟物的siRNA，在没有切片器切割的情况下抑制靶表达22(). CXCR4靶点与荧光MS2蛋白在缺乏细胞因子的情况下的共表达CXCR4系列siRNA无明显病灶(). 然而，当siRNA共同递送时，我们观察到CXCR4靶点集中在与Myc–Ago2、Myc–Ago3和内源性Ago2蛋白共定位的细胞质病灶中(并参见补充信息，图S3). 随着其在P体中的定位，报告者的表达减少了两到三倍（数据未显示）。综合考虑，我们的结果表明，miRNA-调节的mRNAs可以以一种既依赖于小RNA的存在又依赖于靶mRNA中适当识别位点的存在的方式在哺乳动物P体中积累。
这项工作中的一些观察结果表明，哺乳动物的P小体和miRNA调节的mRNA抑制之间存在联系。首先，精氨酸蛋白定位于P体。第二，Ago2定位到P-体需要结合miRNAs的能力。第三，两种不同的报告mRNA-一种是内源性let-7miRNA和一个人工miRNA模拟物的靶点-以依赖于miRNA或miRNA-结合位点的方式在P体中积累。第四，Ago1和Ago2与P-体成分Dcp1a和Dcp2共同免疫沉淀。此外，由于Dcp–Ago相互作用对RNaseA具有耐药性，并且与不定位于P-体的Ago2突变体发生相互作用，这种相互作用可能发生在P-体内外，并且可能在miRNA靶向P-体方面发挥早期作用。综上所述，基于这些观察结果的一个简单假设是，接受miRNA-介导的翻译抑制的mRNAs与Argonaute–miRNA复合物一起积聚在P小体内。
我们的结果与之前的几项研究一致，这些研究表明P-体和RNAi机制之间存在联系。Xrn1p是一种集中在P小体中的5′至3′核酸外切酶，在植物和黑腹果蝇S2细胞降解小RNA定向切割mRNA产生的3′产物23,24引人注目的是，Xrn1p是有效RNAi所必需的秀丽隐杆线虫25此外，Xrn4在拟南芥诱导对某些转基因的RNAi反应，可能是由于异常RNA的积累26我们的结果也可能为哺乳动物中拟议miRNA靶点丰度的非切片依赖性减少提供解释27翻译抑制的mRNA序列向P-体的转移以及精氨酸和Dcp1/Dcp2复合物之间的直接相互作用可能会促进靶点去盖，从而增强其降解，这也可能解释富含AU元素（ARE）的mRNA的mRNA衰变中miRNA依赖性增加的原因28.
一个有待解决的问题是miRNA-介导的调控与P-体之间功能联系的确切性质。在一个模型中，miRNAs可能与精氨酸蛋白结合，通过影响翻译的某些方面来抑制目标基因的翻译，就其本身而言因此，靶向的mRNA可以被未知的机器识别，并被带到P体进行隔离，或许最终处置。在这方面，应该注意的是，至少在酵母中，翻译延伸的缺陷会阻止信使核糖核酸进入P-体，而翻译起始的缺陷会促进信使核糖核酸进入P-体5–7因此，P小体中miRNA-靶向mRNAs的存在表明，如果RISC直接抑制翻译，则很可能在翻译起始水平上抑制翻译。另一种模型是，P-体的定位是精氨酸蛋白/miRNA复合物与其靶点之间相互作用的直接结果，可能是通过精氨酸促进靶向P-体翻译抑制mRNP的组装。在这个模型中，P体的定位本身负责阻止蛋白质合成，因为在酵母和哺乳动物中，翻译机制都被排除在这个结构之外6,29混合模型表明，RISC介导的翻译抑制涉及翻译的初始抑制就其本身而言从而将mRNA靶向P体，在P体中，翻译机器的隔离加强了沉默。
