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基因发育。2007年5月1日；21(9): 1050–1063.
数字对象标识：10.1101/加德满都1524107
预防性维修识别码：项目经理1855231
PMID：17437993

多梳抑制复合物2介导的基因抑制的药理学破坏选择性诱导癌细胞凋亡

井滩,1,7 杨晓静,1,5,7 李庄,1 夏江,1 魏晨,6 李培冷（Puay Leng Lee）,1 R.K.穆西·卡鲁图里,4 帕特里克·布恩·奥伊·谭,三，6 爱迪生·T·刘,2和羌余1,8
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

多梳抑制复合物2（PRC2）介导的组蛋白甲基化在异常癌症基因沉默中起着重要作用，是癌症治疗的潜在靶点。在这里，我们发现S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂3-脱氧核苷酸A（DZNep）在癌细胞中诱导有效的凋亡细胞死亡，但在正常细胞中不诱导。我们发现DZNep有效地降低了PRC2组分EZH2、SUZ12和EED的细胞水平，并抑制相关组蛋白H3 Lys 27甲基化（但不抑制H3 Lys9甲基化）。通过整合RNA干扰（RNAi）、全基因组表达分析和染色质免疫沉淀（ChIP）研究，我们确定了一组乳腺癌中PRC2选择性抑制的显著基因，这些基因可以被DZNep重新激活。我们进一步证明，DZNep优先激活一组这些基因，包括一个新的凋亡影响因子，FBXO32型有助于DZNep诱导乳腺癌细胞凋亡。我们的结果证明了DZNep作为一种新型染色质重塑化合物的独特特性，并表明通过药物逆转DZNepPRC2介导的基因阻遏可能构成癌症治疗的新途径。

关键词：EZH2、PRC2、凋亡、乳腺癌、组蛋白甲基化

表观遗传改变在癌症发展中起着重要作用。这些改变包括DNA超甲基化和染色质修饰，如组蛋白甲基化和脱乙酰化(琼斯和拜林2002;范伯格和泰科2004;Fraga等人，2005年;Baylin和Ohm 2006). 许多肿瘤抑制因子被表观遗传沉默所灭活，为癌细胞的克隆扩增和生长提供了选择性优势(Baylin和Ohm 2006). 与含有致残基因突变的基因不同，表观遗传沉默的抑癌基因可以被重新激活，导致细胞凋亡或衰老。这种特征使得表观遗传修饰成为癌症治疗干预的理想靶点。旨在激活沉默基因的治疗药物包括DNA去甲基化剂5-氮胞苷及其脱氧类似物5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-AzaC），以及组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACI）(Marks等人，2004年;Nebbioso等人，2005年;Yoo和Jones 2006). 研究表明，DNA甲基化的特异性抑制剂5-氮杂胞苷及其脱氧类似物5-AzaC可以抑制DNA依赖性甲基转移酶（DNMT）活性并逆转抑癌基因的抑制。这种疗法已被用于治疗血液系统恶性肿瘤(琼斯和拜林2002). 对于干扰组蛋白修饰酶的药物，如HDACI，也正在进行临床试验(Marks等人，2004年;Nebbioso等人，2005年).

众所周知，多梳群（PcG）蛋白具有通过染色质结构的表观遗传修饰促进基因阻遏的能力(肯尼森1995;Levine等人，2004年;Lund和van Lohuizen 2004;Pirrotta 2006年). PcG高度保守果蝇属对人类(肯尼森1995;Pirrotta 1999年;Kennison 2004年)并形成多聚簇抑制复合物（PRC）。PRC含有固有组蛋白甲基转移酶（HMTase）活性，并通过核心组蛋白的甲基化维持基因抑制(Beisel等人，2002年;曹等人，2002年;Milne等人，2002年;Muller等人，2002年;Nakamura等人，2002年). 在PcG蛋白中，PRC2特别重要，因为它与干细胞生物学和癌症有关(Kleer等人，2003年;Gil等人，2005年;Bernstein等人，2006年;Boyer等人，2006年;Bracken等人，2006年;霍尔顿2006;Kalantry等人，2006年;Kamminga等人，2006年;Lee等人，2006年). PRC2包含三个核心组件：EZH2、SUZ12和EED(Levine等人，2004年;Kuzmichev等人，2005年). EZH2包含HMTase活动，此活动需要SUZ12和EED(曹和张2004;Pasini等人，2004年;Montgomery等人，2005年). EZH2催化组蛋白H3-Lys27（H3-K27）甲基化，是PRC2介导的基因抑制所必需的(曹等人，2002年;Muller等人，2002年;Kirmizis等人，2004年;Kuzmichev等人，2005年).

人类EZH2（及其相关的H3-K27甲基转移酶[MTase]活性）与癌症有关。在转移性前列腺癌和乳腺癌中过度表达(Sellers和Loda 2002;Varambally等人，2002年;Bracken等人，2003年;Kleer等人，2003年;Rhodes等人，2003年)并且与乳腺癌的侵袭性有关(Kleer等人，2003年). 除EZH2外，SUZ12在一些人类肿瘤中也上调，包括结肠、乳腺和肝脏肿瘤(Kirmizis等人，2003年,2004). 在培养细胞中，EZH2被发现对细胞增殖至关重要，EZH2的过度表达促进了细胞转化(Varambally等人，2002年;Bracken等人，2003年). 因此，作为抑癌基因的潜在阻遏物，PRC2复合物似乎是治疗干预的一个有吸引力的靶点。然而，PRC2复合物促进肿瘤进展的机制尚未明确，部分原因是对癌细胞中特异性抑制的PRC2靶基因知之甚少。此外，到目前为止，还没有发现任何药物可以干扰PRC2介导的基因沉默以用于潜在的癌症表观遗传治疗。

3-脱氮腺苷类似物是S-腺苷同型半胱氨酸（AdoHcy）水解酶的有效抑制剂(蒋介石与坎通尼1979;Liu等人，1992年). 抑制AdoHcy水解酶导致AdoHcy的细胞积累，进而导致S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性MTases的副产物抑制(Chiang和Cantoni 1979). 尽管已经观察到3-脱氮核苷的各种生物效应(蒋介石1981;Razin等人，1988年;Chiang等人，1992年)，其对染色质修饰和全局基因表达的影响尚未探索。在这项研究中，我们发现3-去甲肾上腺素A（DZNep）是最有效的AdoHcy水解酶抑制剂之一(Glazer等人，1986年)，可诱导癌细胞发生强烈的凋亡，但在正常细胞中不发生。重要的是，DZNep似乎是一种独特的染色质重塑化合物，可以耗尽细胞PRC2蛋白并抑制相关组蛋白甲基化。我们证明，PRC2-repressed基因的重新激活有助于DZNep诱导的乳腺癌细胞凋亡。

结果

DZNep诱导癌细胞凋亡而非正常细胞凋亡

我们之前已经证明HDAC抑制剂促进E2F1依赖性细胞凋亡(Zhao等人，2005年;Tan等人，2006年). 为了寻找其他类似HDACI的化合物，我们筛选了由近4000种化合物组成的国家癌症研究所图书馆。从中我们确定了一种小分子化合物NSC 617989，它是癌基因E2F1介导的细胞系统凋亡的强激活剂（X.Yang，J.Tan，and Q.Yu，unpubl.）。这种化合物，DZNep(图1A)是已知的AdoHcy水解酶抑制剂(Glazer等人，1986年). 通过碘化丙啶（PI）染色和流式细胞术分析，我们发现5μM的DZNep可诱导乳腺癌MCF-7和结直肠癌HCT116细胞的时间依赖性细胞死亡(图1B). 我们进一步证明DZNep诱导的细胞死亡是通过凋亡进行的。图1C表明DZNep处理MCF-7和HCT116细胞导致线粒体跨膜电位（MTP）显著损失（ΔΨ米)，这是线粒体功能障碍的指标。此外，在DZNep处理的细胞中很容易检测到半胱氨酸蛋白酶3底物聚ADP-核糖聚合酶（PARP）的裂解(图1D). 这些结果表明，DZNep引发凋亡细胞死亡，涉及线粒体功能障碍和caspase激活。

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DZNep优先诱导癌细胞凋亡。(一个)DZNep的化学结构。(B类)用5μM DZNep处理MCF-7和HCT116细胞48和72 h，然后进行PI染色和FACS分析。(C类)用DZNep处理MCF-7和HCT116细胞72h，然后进行JC-1染色和FACS分析。MTP由膜电位较低的细胞（ΔΨ米). (D类)用5μM DZNep处理MCF-7和HCT16细胞48和72 h，并用Western blotting分析全细胞提取物。DZNep处理后检测到PARP断裂。β-肌动蛋白作为负荷对照。(E类)多种癌细胞和正常细胞对DZNep的细胞死亡反应。用5μM DZNep处理指示细胞长达120 h，并通过PI染色和FACS分析测量细胞死亡。数据表示三个独立实验的±SD。

接下来，我们将分析扩展到其他类型的癌细胞，并研究DZNep是否会诱导正常细胞的细胞死亡。正如预期的那样，5μM的DZNep也诱导了多种其他癌细胞系的细胞死亡，包括乳腺癌MB-468细胞、结直肠癌、RKO、SW480、肝癌Hep3B和前列腺癌DU-145细胞(图1E). 相反，DZNep在正常细胞中未诱导明显的细胞死亡，包括非癌乳腺上皮MCF-10A细胞、肺上皮IMR90细胞、原代人肺成纤维细胞MRC-5和人皮肤成纤维细胞T-HFF。因此，DZNep似乎优先诱导癌细胞凋亡。

DZNep耗尽PRC2蛋白并抑制组蛋白H3-K27甲基化

接下来我们研究了DZNep诱导癌细胞凋亡的分子机制。因为在我们的细胞筛选中，DZNep产生了与HDACI相似的表型，PRC2介导的基因抑制依赖于HDAC活性(范德弗拉格和奥特1999;Varambally等人，2002年)，我们探讨了DNZep可能干扰PRC2蛋白和相关组蛋白甲基化的可能性。

如Western blot分析所示(图2A)用5μM DZNep处理MCF-7或HCT116细胞48和72小时，导致三种PRC2成分SUZ12、EZH2和EED的蛋白质水平显著降低。与先前的发现一致，即H3-K27是PRC2 HMTase的特异性底物(曹等人，2002年)在DZNep处理的细胞中，组蛋白3在Lys 27（H3-K27me3）的三甲基化强烈降低。相反，组蛋白H3在Lys 9（H3-K9me3）的三甲基化，这是由另一组蛋白MTase Suv39h1介导的(Rea等人，2000年;Peters等人，2001年;Lehnertz等人，2003年)-不受DZNep治疗的影响。此外，DZNep治疗不影响组蛋白H3乙酰化。DNA MTases的表达水平，已知在DNMT抑制剂治疗后会耗尽(Velicescu等人，2002年;Cheng等人，2004年)，与DZNep保持不变。也与之前的证明一致，即PRC2对H3-K27单甲基化没有影响(曹和张2004;Pasini等人，2004年)，我们发现DZNep没有抑制H3-K27的单甲基化。DZNep治疗还导致另一个抑制性组蛋白标记H4-K20三甲基化的丢失(图2B). 因此，DZNep对H3-K27甲基化的影响是选择性的，但不是特异性的。

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DZNep对PRC2蛋白和组蛋白甲基化的影响。(一个)用5μM DZNep处理MCF-7和HCT116细胞48和72小时，并用检测指示蛋白的抗体采集细胞进行Western blot分析。(B类)用DZNep处理MCF-7细胞48小时，通过Western blot分析检测组蛋白甲基化水平。(C类)用DZNep处理MCF-7细胞指定的时间，并采集细胞进行指定蛋白质的Western blot分析。(D类)MCF-7和HCT116细胞按一个提取总RNA进行RT-PCR分析EZH2型,EED公司、和SUZ12型mRNA水平。(E类)用DZNep处理MCF-7细胞18小时，然后加入蛋白体抑制剂MG132（5μM）、LLNL（50μM）或MG115（20μM）8小时。收获细胞用于EZH2和SUZ12的蛋白质印迹分析。(F类)分别用靶向EZH2、EED或SUZ12的siRNA处理MCF-7细胞。72小时后，收集细胞，通过Western blot分析检测PRC2蛋白和H3-K27me3、H3-K9me3和总H3的水平。(G公司)MCF-7和MCF-10A细胞按F类PI染色和FACS分析检测细胞死亡。数据表示三个独立实验的±SD。

为了了解DZNep治疗后EZH2和H3-K27甲基化变化的动力学，我们进行了时间过程分析(图2C). 我们的数据表明，DZNep在治疗后2小时即诱导EZH2下调，随后在随后的时间点抑制H3-K27me3。相反，H3-K9me3和总H3水平在DZNep治疗的整个过程中保持不变。这些变化发生在诱导凋亡之前，因此不太可能是凋亡反应的结果。

为了研究PRC2蛋白的减少是否是由于PRC2 mRNA表达减少所致，我们进行了RT-PCR分析。图2D显示在DZNep处理后，每个PRC2蛋白的mRNA水平保持不变，表明PRC2组分的减少是转录后机制的结果。众所周知，PRC2复合物会受到蛋白体介导的降解(Pasini等人，2004年). 为了确定DZNep诱导的PRC2复合物耗竭是否由蛋白质降解引起，我们在存在或不存在三种不同蛋白体抑制剂（MG132、LLNL和MG115）的情况下，用DZNeb处理MCF-7细胞。如所示图2E在DZNep作用下，每种蛋白体抑制剂至少部分阻止了EZH2和SUZ12蛋白水平的下调。这些结果表明，DZNep通过增加蛋白质降解来耗尽PRC2蛋白质。

接下来我们探讨了PRC2复合物的减少是否与DZNep诱导的凋亡有关。的表达式级别EZH2型MCF-7细胞的mRNA比MCF-10A细胞高五倍（数据未显示），因此我们使用这两个细胞系来测试PRC2蛋白（EZH2、EED和SUZ12）的敲除是否会导致这些细胞的凋亡。小干扰RNA（siRNA）处理MCF-7细胞72小时后的Western blot分析证实了敲除效率(图2F). 值得注意的是，每个PRC2蛋白的敲除导致其他两个组分的下调，这与之前的发现一致，即每个PRC2组分的蛋白水平取决于复合物其他成员的存在(Pasini等人，2004年). 作为PRC2敲除的预期结果，组蛋白H3-K27三甲基化显著降低，而H3-K9三甲基化和总H3水平保持不变(图2F). 值得注意的是，与接受对照siRNA的MCF-7细胞相比，PRC2 siRNA处理导致MCF-7的细胞显著凋亡，而PRC2 siRNA没有诱导MCF-10A细胞凋亡(图2G). 这些发现表明，DZNep诱导的MCF-7细胞凋亡至少部分是由于PRC2复合物减少所致。

乳腺癌细胞中经DZNep激活的PRC2-repressed基因的鉴定

由于我们的数据表明，DZNep诱导癌细胞凋亡可能是由于释放PRC2介导的转录抑制，我们接下来试图确定一组受PRC2/H3K27me3抑制的共同靶基因，这些靶基因可以在DZNeb治疗后重新激活。我们将这些研究重点放在乳腺癌细胞上，因为MCF-7细胞中EZH2的表达水平是MCF-10A细胞的五倍（数据未显示）。使用与上述相同的siRNA策略，我们首先使用Illumina 24K基因表达芯片分析了PRC2三个核心成分（EZH2、SUZ12和EED）单独敲除后的全球基因表达变化。随后的数据分析显示，在EZH2、EED和SUZ12 siRNA处理后，708、684和572个基因分别上调了两倍以上。总共有1402个基因在敲除至少三分之一的PRC2蛋白后表达增加。包括在内，我们在随后的分析中认为所有1402个基因都是潜在的PRC2靶基因。

接下来，我们进行了阵列分析，以确定DZNep上调的基因。用DZNep处理MCF-7细胞72小时后，751个基因上调了两倍或更多。将该DZNep诱导基因列表与1402候选PRC2靶基因列表进行比较，我们发现140个基因重叠(第页< 0.0001) (图3A). 我们认为这140个基因是PRC2重表达的靶点，可以被DZNep转录激活。由DZNep诱导但显然不受PRC2敲除影响的其余611个基因可能代表被其他MTase抑制的靶标，因为DZNep也会抑制它们的功能。

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乳腺癌细胞中DZNep激活的PRC2靶基因的鉴定。(一个)通气图显示DNZep处理的和PRC2 siRNA处理的MCF-7细胞中重叠基因上调。用DZNep或单个EZH2、EED或SUZ12 siRNA处理细胞72 h，并使用Illumina 24K BeadArray系统进行基因表达。DZNep处理后，基因（751）上调了两倍或更多，在至少三分之一的PRC2敲除条件下，1402个基因上调了两倍或更多。(B类,左边面板）显示PRC2靶点在MCF-7和MCF-10A细胞中差异表达的聚类图。基因按MCF-7细胞相对于MCF-10A细胞的高表达（红色）和低表达（绿色）水平排列。MCF-7细胞中44个靶基因被选择性抑制，并被靶向单个PRC2蛋白的DZNep或siRNAs重新激活正确的面板。(C类)10个PRC2靶基因的RT-PCR验证。(D类)DZNep在MCF-10A细胞与MCF-7细胞中诱导44个PRC2靶点的平均倍数。(E类)基因功能的GO赋值。(F类)原发性乳腺肿瘤（T）和正常乳腺组织（N）中PRC2靶基因的分级聚类。簇I代表PRC2靶基因，与正常组织相比，其在原发性肿瘤中的表达下调。

由于PRC2复合物的抑制在MCF-7细胞中诱导凋亡，但在MCF-10A细胞中不诱导凋亡，我们推断MCF-7中的一些PRC2靶基因可能在癌细胞和非癌细胞之间差异表达，因此对DZNep治疗的反应不同。因此，为了确定乳腺癌细胞中PRC2特异性抑制的基因，我们从未经治疗或用DZNep治疗的非癌MCF-10A细胞中生成了表达数据（补充表S1）。如所示图3B基因聚类结果显示，在MCF-7细胞中对DZNep和PRC2敲除敏感的140个基因中，有44个在MCF-7细胞中的表达至少是MCF-10A细胞的两倍。其余推测的PRC2靶基因在两种细胞类型之间表达水平相似，或在MCF-7细胞中表达水平较高(图3B). 随后对其中10个基因的随机子集进行的RT-PCR分析证实，与MCF-10A细胞相比，它们在MCF-7细胞中的沉默或抑制表达在DZNep或PRC2 siRNAs处理后得到恢复(图3C). 虽然DZNep处理导致MCF-7细胞中这44个基因的平均诱导倍数为4倍，但在MCF-10A细胞中未观察到明显变化（小于1倍）(图3D). 因此，我们发现了一组44个基因在癌组织中被PRC2特异性抑制，而正常乳腺上皮细胞在DZNep治疗后可以重新激活。在这个列表中，可能是负责DZNep在MCF-7细胞上的凋亡反应的基因。

基因本体（GO）分析表明，这些基因因其在生长抑制或凋亡中的作用而显著丰富，如TGFBI公司和IGFBP3型(图3E). 因此，这些基因可能是乳腺癌中PRC2表观遗传沉默或抑制的恶性表型的假定抑癌基因。与正常细胞相比，癌细胞中PRC2-repressed生长控制基因的优先激活可能解释了DZNep的癌症选择性。

为了确定我们在癌细胞系中的发现是否代表原发性乳腺肿瘤，我们查询了28个原发性乳房肿瘤样本和9个正常乳腺组织的基因表达数据集，以了解MCF-7细胞中PRC2特异性抑制的44个基因的表达。在这44个基因中，发现34个独特的探针存在于该Affymetrix阵列数据集中。与一起EZH2型,SUZ12型、和种子，该基因集通过非监督聚类分析清晰地将肿瘤和正常样本分开(图3F). 与正常乳腺组织相比，17个基因的子集（簇I）在乳腺肿瘤中的表达较低，这与较高的EZH2型和SUZ12型在乳腺肿瘤中的表达。这些数据强烈表明，PRC2靶点的这一亚群是临床相关的，其在原发性人类乳腺癌中的表达受到抑制。

DZNep对靶启动子上PRC2和RNA聚合酶II（RNA Pol II）占据率的影响

接下来，我们使用染色质免疫沉淀（ChIP）来确定PRC2是否与上述靶基因启动子结合，以及这种结合是否受到DZNep治疗的影响。为了获得进一步的机制性见解，我们还分析了RNA Pol II的启动子占据情况，因为已知RNA PolⅡ和PRC2以互斥的方式占据基因启动子(Lee等人2006;Vire等人，2006年). 我们推断，DZNep对PRC2的耗竭将导致RNA Pol II向PRC2靶基因启动子的募集增加。我们使用核心启动子区设计的ChIP PCR引物检测了8个候选PRC2靶基因启动子(图4A); 已知95%的PRC2-binding位点位于有或无CpG岛的基因转录起始位点的1kb以内(Lee等人2006). 如使用SUZ12或RNA Pol II抗体进行的ChIP分析所示，未经处理的MCF-7细胞显示SUZ12与所有八个基因启动子都有强结合，而在非特异性IgG或RNA-Pol II下拉样本中只检测到背景或最小结合(图4B). 用DZNep处理48小时后，SUZ12结合显著降低，所有8个启动子上的Pol II结合增加。结合DZNep耗尽PRC2后这些基因的重新表达，这些发现证实PRC2与这些基因启动子结合是转录抑制所必需的。DZNep对PRC2蛋白的破坏降低了这种结合，导致RNA Pol II的招募增加，这些PRC2靶基因的转录激活增加。

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DZNep处理消除了PRC2与其靶基因的结合，并增加了RNA Pol II的结合。(一个)候选PRC2靶基因5′侧翼区域的示意图。箭头指向转录起始位点。竖线表示CpG位点。PCR分析的区域在底部ChIP引物位于所分析基因的核心启动子区域。(B类)ChIPs显示，DZNep处理减少了SUZ12与靶基因启动子的结合，但增加了RNA Pol II与这些基因启动子之间的结合。非特异性IgG用作对照。输入代表基因组DNA。

DZNep对PRC2再表达靶点的再激活并非归因于DNA去甲基化

研究表明，EZH2可以通过向某些PRC2靶基因启动子招募DNMT来直接控制DNA甲基化(Vire等人，2006年). 这增加了DZNep介导的PRC2靶基因的重新激活可能是DNA去甲基化的结果。如果是这样，用DNA脱甲基剂5-AzaC或与HDACI曲古抑菌素A（TSA）联合治疗MCF-7细胞也应该能够重新激活这些基因。为了验证这一假设，我们对单独使用5-AzaC或TSA处理的MCF-7细胞进行了相同的BeadArray表达分析，并将其与之前描述的DZNep处理的MCF-7细胞进行比较。与DZNep相比，我们之前在MCF-7细胞（见上文）中鉴定的140个PRC2-repressed和DZNep-activated基因在5-AzaC或5-AzaC/TSA处理后均未显示出显著激活(图5A，左侧面板）。然而，作为5-AzaC和5-AzaC/TSA治疗的阳性对照，p18INK4C表达表现出强烈的诱导作用（分别为3倍和18倍）(图5A，右侧面板）。联合5-AzaC和TSA治疗后，140个PRC2靶基因中的13个（～10%）增加了三倍或更多（见补充表S2），这表明只有一小部分DZNep诱导的PRC2目标基因可以通过DNA甲基化诱导。然而，其余PRC2靶点似乎并非如此，因为相同的治疗并未诱导其表达。

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DZNep和5-AzaC对PRC2靶基因表达和DNA甲基化状态的影响。(一个)MCF-7细胞未经处理或用DZNep、5-AzaC或5-AzaC+TSA处理，并分离RNA用于基因阵列表达分析。140个PRC2靶点的平均表达水平显示在左边作为阳性对照，5-AzaC或5-AzaC+TSA诱导p18INK4C表达如图所示正确的. (B类)未经处理或经DZNep或5-AzaC处理的MCF-7细胞中六个代表性PRC2靶基因启动子的甲基化状态。每个彩色编码球代表一个CpG位点。红色表示甲基化水平低，黄色表示甲基化程度高。灰色表示缺失数据。通过定量RT-PCR评估DZNep、5-AzaC或5-AzaC+TSA处理后基因表达的相应变化，结果显示在正确的关于每个扩增子的基因组位置和每个扩增子中每个CpG位点的甲基化百分比的详细信息可以在补充表S3中找到。

为了获得支持我们结论的直接证据，我们使用SEQUENOM MassARRAY系统进行了定量DNA甲基化分析，该系统使用MALDI-TOF质谱（MS）分析碱基特异性切割的扩增产物(Ehrich等人，2005年). 我们分析了MCF-7细胞中21个PRC2靶基因的甲基化模式，比较了未经处理的细胞、经DZNep处理的细胞和经5-AzaC处理的细胞之间的甲基化类型（见补充表S3）。结果表明，这些PRC2靶基因中近50%在检测的扩增物中未甲基化。因此，DNA甲基化不太可能导致所有PRC2靶点的沉默表达。图5B显示了六个代表性PRC2靶基因启动子的甲基化模式，这些启动子要么是非甲基化的(TGFBI公司,17韩元、和PPP1R15A型)或高度甲基化(FBXO32型,KRT7型、和IGFBP3型)以及通过实时RT-PCR分析（右侧）测量的上述处理后其表达水平的变化。对于非甲基化基因，很明显，DZNep激活它们与DNA甲基化状态无关。对于FBXO32型和韩元7我们发现DZNep和5-AzaC都诱导了一些CpG位点的去甲基化，这表明DZNeb处理确实可以导致这些基因中的DNA去甲基化。然而，尽管5-AzaC或5-AzaC+TSA治疗未能诱导这些基因的表达，相反，DZNep却强烈激活了它们的表达(图5B). 因此，DNA去甲基化可能不是DZNep诱导的基因重新激活的主要因素。然而，我们并不排除某些PRC2靶基因启动子中的DNA去甲基化事件对实现最佳基因激活具有重要功能的可能性，可能与组蛋白甲基化的变化相协调以产生协同效应。

与DZNep细胞敏感性相关的PRC2靶基因的鉴定

为了确定我们在MCF-7细胞中观察到的DZNep是否与其他乳腺癌细胞株一致，我们用DZNeb处理MDA-MB-468、SK-BR-3、MDA-MB-231、T47D和BT-549细胞株。时间进程分析中的凋亡反应表明，这些细胞株对DZNep表现出不同的敏感性。与MCF-7细胞类似，MDA-MB-468、SK-BR-3和T47D细胞对DZNep诱导的细胞死亡高度敏感。相反，MDA-MB-231和BT-549细胞系的反应与非癌MCF-10A细胞相似；也就是说，它们对DZNep诱导的细胞死亡具有抵抗力(图6A).

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与DZNep敏感性相关的PRC2靶基因的鉴定。(一个)用5μM DZNep处理指示细胞株72、96和120 h，并通过FACS分析测量细胞死亡。给出的数据是三个独立实验的平均值。(B类)在指定的乳腺癌细胞系中对44个PRC2靶点进行无监督聚类。与敏感细胞系相比，绿色突出显示的基因在耐药细胞系中高度表达。(C类)集群程序显示至少三个敏感细胞系中DZNep上调的基因。(D类)用或不用DZNep处理显示的细胞系72小时，并采集细胞检测其mRNA水平FBXO32型,灯3,PLAU公司、和第15页通过定量实时RT–PCR分析。图示为DZNep治疗72小时后的诱导褶皱。(E类)用DZNep处理显示的乳腺癌细胞系48小时，并通过Western blotting测定EZH2和SUZ12蛋白水平。

细胞对DZNep的敏感性可能是这些细胞系之间差异基因激活的结果，因此我们接下来有兴趣确定DZNeb敏感性和耐药性之间的差异。我们在DZNep治疗前后为这些额外的乳腺癌细胞系生成了类似的BeadArray基因表达数据（见补充表S4）。对之前定义的44个对DZNep治疗敏感的癌特异性PRC2-repressed基因（见上文）的无监督聚类分析清楚地将对DZNep诱导的细胞死亡敏感的细胞株与不敏感的细胞系分开，这完全基于未经治疗的细胞中的表达(图6B). 22个基因子集之间的表达差异是导致这种分离的原因；这些基因在DZNep耐药细胞系中的表达水平更高(图6B). 在DZNep治疗后，这22个基因中的4个(FBXO32型,灯3,PLAU公司、和PPP1R15A型)发现在所有四个DZNep敏感细胞系中上调。此外，还有三个额外的基因(TGFBI公司,IGFBP3型,TNS3型)在四个敏感细胞系中的三个中诱导。在耐药细胞系中，这些基因（不包括灯3在BT-549细胞中）已经高度表达，并且在DZNep处理后没有进行显著的进一步诱导(图6C). 实时RT-PCR分析FBXO32型,灯3,PLAU公司、和PPP1R15A型确认阵列数据(图6D). 因此，这七个基因的抑制表达及其被DZNep诱导的程度似乎与乳腺癌细胞对DZNep诱导的细胞死亡的敏感性有关。

耐药细胞表型并非由于DZNep不能耗尽PRC2复合物，因为在所有这些细胞系中都存在明显的耗尽现象(图6E). 此外，在DZNep处理后，抗性细胞系中表达但在敏感细胞系中被抑制的22个基因没有进一步增加。这表明，尽管存在于这些耐药细胞中，但PRC2没有抑制其转录的功能，可能是因为缺乏这些基因表观遗传控制所需的其他因子（例如DNMT和HDAC）。

FBXO32的活化在介导DZNep诱导的细胞凋亡中起着关键作用

为了研究上述7个基因作为DZNep死亡反应的潜在介质的功能意义，我们使用siRNA技术限制其在DZNepMCF-7细胞治疗中的上调。Dharmacon SMARTpool siRNAs在用DZNep治疗前被导入细胞，并在3d后检测细胞凋亡FBXO32型是唯一显著降低DZNep凋亡反应的药物(图7A). 为了进一步验证FBXO32型为了排除RNA干扰（RNAi）的离靶效应，我们合成了一种不同的FBXO32型siRNA，它给出了几乎相同的结果(图7B). 为了进一步证实这一发现，我们建立了来源于MCF-7的细胞系，该细胞系组成性表达一种短发夹RNA（shRNA）靶向FBXO32型或非特异性对照shRNA。两个独立、稳定的克隆系表达FBXO32型shRNA大大降低了FBXO32型DZNep治疗后的再激活(图7C). 因此，与shRNA对照MCF-7细胞系相比，DZNep在这些细胞中诱导的凋亡受到强烈抑制。通过三种独立的方法测量细胞凋亡的减少：通过荧光激活细胞分选（FACS）分析测量G1以下人群或MTP(图7D、E)和通过PARP切割使用Western blot分析(图7F). 这些实验强烈表明FBXO32型在MCF-7细胞中，需要DZNep有效诱导细胞凋亡。尽管去除了其他与凋亡相关的PRC2靶点，如TGFBI公司和IGFBP3型在MCF-7细胞中，单用DZNep似乎并不能显著抑制其诱导的凋亡，在不同的细胞环境下，它们的协同和集体激活可能仍有助于DZNep诱导的凋亡过程。我们的数据表明FBXO32型在乳腺癌细胞中，与其他PRC2靶点以及DZNep诱导的程度似乎是DZNep诱导乳腺癌细胞凋亡的重要决定因素。

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FBXO32在功能上是DZNep诱导凋亡所必需的。(一个)将每个指示的Dharmacon SMARTpool siRNA转染到MCF-7细胞中24 h，然后进行5μM DZNep处理72 h。通过FACS分析测定细胞凋亡。仅限FBXO32型siRNA能够减少DZNep诱导的细胞凋亡。(B类)A类FBXO32型靶向不同区域的siRNAFBXO32型与非靶向siRNA对照（NC）相比，还抑制了DNZep诱导的MCF-7细胞凋亡。显示了三个独立实验的结果。击倒FBXO32型信使核糖核酸的表达通过RT–PCR在底部. (C类)的级别FBXO32型用实时RT-PCR法测定了两个表达FBXO32 shRNA或非靶向对照shRNA（NC shRNA）的MCF-7稳定克隆的mRNA。该图显示了FBXO32型DZNep处理后，每个稳定克隆中的mRNA如图所示。(D类)用DZNep处理表达FBXO32 shRNA或NC shRNA的MCF-7细胞72h，通过PI染色和FACS分析检测细胞死亡情况。(E类)细胞被视为D类JC-1染色。(F类)细胞被视为D类并进行蛋白质印迹分析以检测PARP切割。

讨论

通过表观遗传抑制导致肿瘤抑制因子丢失是人类癌症的一个特征。因此，逆转表观遗传基因沉默的策略可能在癌症治疗中有用。在本研究中，我们描述了AdoHcy水解酶抑制剂DZNep对染色质重塑的影响，以及其优先诱导癌细胞凋亡的能力。我们提供证据表明，DZNep诱导的细胞凋亡至少部分是由于PRC2复合物的下调。使用这种DZNep化合物以及RNAi、基因表达分析和ChIP，我们发现了一组基因，这些基因通过PRC2介导的抑制作用在人类乳腺癌细胞中被抑制，但在使用DZNeb治疗后被重新激活。我们进一步确定了与DZNep诱导的凋亡相关的关键PRC2靶基因。

作为AdoHcy水解酶抑制剂，DZNep干扰AdoMet-AdoHcy代谢，并可间接导致甲基化反应降低(Glazer等人，1986年). 不像DNA低甲基化试剂，如5′-AzaC和斑马线，会耗尽DNMT(Velicescu等人，2002年;Cheng等人，2004年)，该化合物似乎对DNMT没有影响，但可诱导PRC2蛋白的有效耗竭和相关组蛋白H3-K27的甲基化。有趣的是，DZNep似乎对Suv39h1和相关的H3-K9甲基化没有影响，尽管其原因尚待确定。由于DZNep处理不会影响PRC2蛋白的mRNA水平，因此DZNeb处理后的PRC2蛋白耗竭不是通过转录抑制实现的。相反，它至少部分是通过蛋白质体降解介导的，因为蛋白质体抑制剂可以恢复PRC2蛋白的表达。不同于5-AzaC和斑马线，它们通过合并DNMT并将其捕获到替代的DNA中而耗尽DNMT(Cheng等人，2004年)，DZNep未磷酸化且未并入DNA(Glazer等人，1986年;Tseng等人，1989年). 因此，DZNep通过类似机制耗尽PRC2蛋白的可能性很小。目前尚不清楚DZNep处理后三种PRC2蛋白是如何降解的。然而，众所周知，一个PRC2组分的下调可能导致复合物中另外两个组分的降解，因为该复合物的完整性取决于每个组分的存在(Bracken等人，2003年;Pasini等人，2004年;Montgomery等人，2005年). 因此，DZNep对AdoHcy水解酶的抑制可能会影响PRC2的核心成分之一，导致整个复合物的不稳定性，并随后抑制H3-K27甲基化。

由于AdoMet依赖性甲基化涉及许多细胞过程(Chiang等人，1996年)DZNep以AdoHcy水解酶为靶点，有望抑制多种MTase的活性。事实上，我们发现DZNep治疗还抑制了另一个抑制性组蛋白标记H4-K20甲基化，这表明其他组蛋白MTases也可能容易受到DZNeb的抑制。这可能解释了为什么751个DZNep激活基因中只有140个似乎受EZH2调控。其余基因的诱导可能是除EZH2外的MTases抑制的结果，它们也可能参与DZNep诱导的细胞凋亡。然而，DZNep对PRC2和H3-K27甲基化的直接影响以及凋亡的靶基因激活表明，DZNep诱导的凋亡至少部分与其抑制PRC2通路的能力有关。迄今为止，DZNep已被用于抗病毒治疗(De Clercq等人，1989年)并且已经证明在体内毒性最小(Bray等人，2000年). 不管确切的机制如何，它在癌细胞中而非正常细胞中具有诱人的凋亡活性，以及它影响的重要癌症表观遗传途径，使其成为一种有希望的抗癌治疗药物候选。

在药理学、基因组学和功能分析的指导下，我们确定了一组PRC2靶点，这些靶点在乳腺癌细胞和原发性乳腺肿瘤中均受到抑制。对显示对DZNep耐药或敏感反应的乳腺癌细胞株的进一步分析，确定了一组与细胞对DZNep敏感性相关的PRC2靶基因。其中包括TGFBI公司,IGFBP3型、和PPPIR15A型之前已知参与细胞凋亡或生长控制。特别是，我们在功能上验证了一种新型细胞死亡调节器，FBXO32型其活化似乎是DZNep有效诱导细胞凋亡所必需的。FBXO32型编码MAFbx（肌肉萎缩F-box蛋白，也称为atrogin-1），属于F-box蛋白家族，是SCF泛素蛋白E3连接酶复合物的一部分。的作用FBXO32型先前的一项研究表明，PI3K/Akt通路可以抑制其表达(Stitt等人，2004年). 重要的是，我们证实了FBXO32型与正常组织相比，原发性乳腺肿瘤。最近，F-box家族的另外两个成员FBXW7和FBX4被证明通过靶向多种致癌蛋白（如Myc、cyclin E或cyclin D1）发挥抑癌作用，从而降解泛素依赖性蛋白(Welcker等人，2004年;Minella和Clurman 2005;Fujii等人，2006年;Lin等人，2006年). 因此，FBXO32型似乎是PRC2抑制的靶基因，具有潜在的肿瘤抑制功能。

尽管单独敲除其他与细胞凋亡相关的PRC2靶点似乎不足以抑制DZNep诱导的细胞凋亡，但不应排除它们以集体或协调的方式对这种细胞凋亡过程的贡献，这取决于细胞环境。这一小组基因可能作为预测DZNep对乳腺癌细胞反应的替代标记物，并指导未来选择PRC2靶向治疗的乳腺癌患者子集。我们的研究表明，一些癌细胞中生长控制PRC2靶基因的表达缺失可能会产生“表观遗传成瘾”，其中癌细胞依赖其沉默表达获得生长优势。这些基因的恢复表达将导致生长抑制或凋亡，这意味着一种新的治疗方法可以优先杀死肿瘤细胞而不是非肿瘤细胞。此外，鉴于PRC2和组蛋白甲基化在干细胞维护中的作用(Sparmann和van Lohuizen 2006年)可以想象，抑制PRC2和相关组蛋白甲基化也可能与靶向肿瘤干细胞有关。

除了催化H3-K27甲基化外，PRC2还招募DNMT到某些PRC2靶基因启动子区CpG位点的甲基化胞嘧啶(Vire等人，2006年). 虽然DZNep可能可以抑制多重甲基化反应，但我们发现其激活PRC2重表达基因的能力可能不是一般抑制DNA甲基化的结果。这一结论得到了药理学和DNA甲基化分析的支持。DNMT抑制剂5′-AzaC或5′-AzaC加HDAC抑制剂TSA只能诱导约10%的PRC2靶基因，这表明PRC2-连锁DNA超甲基化似乎只在一定比例的PRC2目标中起作用。此外，我们在MCF-7细胞中检测的许多PRC2靶点在我们检测的CpG位点中被发现是低甲基化的。对于少量高度甲基化的PRC2靶点，DZNep确实在一些CpG位点诱导了它们的去甲基化，但这种去甲基化事件本身不足以使DZNeb诱导的强大的基因激活，因为5′-AzaC或5′-AzaC加TSA对相同CpG位点进行去甲基化并没有激活它们的表达。因此，DZNep对染色质的影响与其他染色质重塑剂（如DNMT和HDAC抑制剂）是不同的，DZNep似乎是第一个能够通过调节PRC2和相关组蛋白甲基化来重新激活基因表达的化合物。此外，DZNep对染色质重塑的独特作用使其与其他染色质重塑剂联合使用成为协同修复癌症中异常沉默基因的一种有吸引力的方法。

总之，我们的工作强调了PRC2介导的基因抑制在维持癌细胞生存中的重要性。我们鉴定了AdoHcy水解酶抑制剂DZNep，该抑制剂可以逆转PRC2和组蛋白甲基化介导的基因沉默，并有效诱导癌细胞死亡，从而打开了抑制这种表观遗传调节物的治疗潜力。我们预计PRC2和组蛋白甲基化导向治疗的治疗指数天生就很高，因为与肿瘤细胞相比，正常细胞似乎对PRC2复合物的抑制作用较弱。

材料和方法

细胞和药物治疗

本研究中使用的细胞系购自美国类型培养库。细胞保存在补充有10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺和5000 U/mL青霉素/链霉素的DMEM中，并在37°C和5%CO的条件下保存2对于药物治疗，在药物治疗前一天接种细胞。用5μM DZNep或2μM 5-AzaC（Sigma）处理细胞72 h，并用100 nM的TSA（SigmaC）处理细胞24 h。对于5-AzaC-处理，每隔24 h用新添加的5-AzaC/替换培养基。对于5-AzaC和TSA共处理细胞，先添加5-AzaC48 h，然后添加TSA 24 h。

RNA干扰

靶向EZH2、SUZ12和EED mRNA的特异性siRNA寡核苷酸如前所述(曹和张2004;Kirmizis等人，2004年;Bracken等人，2006年). 选定PRC2靶点和非靶点对照的SMARTpool siRNA试剂购自Dharmacon。从Sigma-Poligo中获得了一个单独的靶向序列5′-GTCCACATCCTTTCCTGGAA-3′的FBXO32 siRNA。按照制造商的指示，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）将最终浓度为50 nM的siRNA双链体转染细胞。为了生成FBXO32 shRNA稳定的细胞，根据制造商的说明，将FBXO32-siRNA序列或非靶向对照siRNA序列克隆到pSIREN-RestroQ逆转录病毒表达载体（BD Bioscience）中。在含有2μg/mL嘌呤霉素的培养基中选择病毒感染的细胞，收集、合并和扩增单个耐药克隆。

免疫印迹分析

如前所述，在RIPA缓冲液中刮取、收集和溶解细胞(Kho等人，2004年). 为了从染色质中释放组蛋白，使用XL2000 Microson超声波处理器（Misonix）进一步对细胞裂解液进行超声波处理15秒。在SDS–聚丙烯酰胺凝胶上分离等量的蛋白质（50μg），并转移至PVDF膜。用抗EED（07-368）、SUZ12（07-379）、SUV39H1（07-550）、三甲基化H3-K27（07-449）、三甲基化H3-K9（07-442）、单甲基化H3-K27（07-448）、二甲基化H3-K27（07-452）和乙酰组蛋白H3（06-599）的抗体探测印迹，这些抗体购自Upstate Biotechnology。三甲基化H4-K20（ab9053）来自Abcam。EZH2（AC22）和组蛋白H3（3H1）来自细胞信号。抗DNMT1和DNMT3B的抗体购自Alexis生化公司。

流式细胞术分析

收集细胞并将其固定在70%乙醇中。固定细胞经RNase（100μg/mL）处理后，用PI（50μg/mL）染色。用FACS在FACSCalibur（Becton Dickinson仪器）中分析染色细胞的DNA含量。使用CellQuest软件（Becton Dickinson）量化细胞周期分数。为了测量MTP，根据制造商的说明（BD Bioscience）用JC-1对细胞进行染色，并使用CellQuest软件（BD biosciences）对JC-1检测阳性的细胞进行测量。

微阵列分析和定量实时PCR

使用Trizol（Invitrogen）从细胞系中分离出总RNA，并使用RNEasy Mini Kit（Qiagen）进行纯化。使用RNA扩增试剂盒（Ambion）进行逆转录。使用Illumina基因表达芯片（Illumia）进行微阵列杂交，并使用安捷伦科技公司的GeneSpring软件进行数据分析。按照制造商的说明，使用Affymetrix U133A基因芯片（Affymetix）对正常和原发性乳腺肿瘤样本进行基因表达。通过中位数居中对单个阵列的基因表达数据进行归一化，并使用Cluster和Treeview软件进行平均连锁层次聚类(http://rana.lbl.gov/EisenSoftware.htm). 使用TaqMan探针（Applied Biosystems）在PRISM 7900序列检测系统上进行定量实时PCR。样品被归一化为18S核糖体RNA水平。

ChIP分析

如前所述进行ChIP分析(Zhao等人，2005年). 用DZNep（5μM）处理MCF-7细胞48小时7用抗SUZ12（07-379，Upstate Biotechnology）、抗RNA聚合酶II（sc-899，Santa Cruz Biotechnology）和非特异性IgG（sc-2027，Santa Cruz Bietechnologies）免疫沉淀MCF7细胞。对ChIP沉淀DNA和输入DNA进行PCR分析。PCR引物见补充表S5。

DNA甲基化分析

DNA甲基化分析的客户服务由Sequenom，Inc.使用MassARRAY系统执行，如前所述(Ehrich等人，2005年).

致谢

我们感谢保罗·罗布森博士批判性地审阅了手稿。这项工作得到了新加坡科学、技术和研究机构的支持。我们感谢美国国家癌症研究所提供化合物库和DZNep。

脚注

补充材料可在网址：http://www.genesdev.org.

文章在印刷前在线发布。文章和发布日期在线http://www.genesdev.org/cgi/doi/10.101/1524107

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文章来自基因与发育由以下人员提供冷泉港实验室出版社