果蝇Thor参与宿主免疫防御并将翻译调节因子与先天免疫联系起来

摘要

中的免疫力分析果蝇属其他昆虫越来越显示出与其他生物的相似性，并揭示出先天免疫是一种古老的防御机制（综述见参考文献）。1–4). 昆虫的免疫反应具有细胞和体液成分，其特征分别是血细胞的动员和抗微生物蛋白的产生。专注于体液成分，分子遗传学研究果蝇属已经揭示了伤亡人数背腹侧信号通路不仅用于果蝇属免疫力，但在哺乳动物和植物免疫力方面（综述见参考文献。4).果蝇属区分感染类型和伤亡人数通路对抗真菌防御至关重要，而基因免疫缺陷(国际货币基金组织)对抗菌防御至关重要(5,6). 通过这些途径诱导的抗菌基因也相应地具有抗真菌作用，例如卓霉素，或抗菌，例如抗菌肽,双蝶呤、和防御素，其中许多基因在其他生物体中也有类似的家族成员（有关综述，请参阅参考文献。三和4).

中的情况果蝇属然而，这两种方法都不那么简单伤亡人数和18轮车与哺乳动物白细胞介素-1受体（IL-1R）相似的（18w）也参与抗菌反应(6,7). 此外，反应因个体抗菌蛋白基因而异，诱导程度受细菌类型的调节(8). 此外，一些信号通路成分也在一定程度上被感染上调，例如伤亡人数,18周和NFκB同源物背部的-相关免疫因子(迪夫) (6,7,9). 这些观察表明，对免疫挑战的反应非常复杂和复杂。

为了确定参与免疫反应的新基因，我们在果蝇属设计用于检测细菌感染上调的基因，而不偏倚所选基因的类型或相应突变的表型(10). 我们选择了携带单链抗体的菌株P（P）-元件增强陷阱插入显示感染后B-半乳糖苷酶增加。筛选出一个新基因，命名为托尔，并假设编码非抗菌蛋白(10). 我们现在报告的分子特征和突变表型托尔.

托尔是4E结合蛋白（4E-BP）家族的成员。哺乳动物4E-结合蛋白被定义为控制翻译起始的途径中的关键调节因子（综述见参考文献。11和12). 4E-BP的作用取决于其与真核生物起始因子4E（eIF4E）的结合和隔离。当4E-BP绑定到eIF4E时，eIF4E无法适当绑定以形成翻译起始复合体；4E-BP的磷酸化释放eIF4E，然后允许翻译。结果与托尔提供证据4E-BP公司家庭成员参与免疫诱导果蝇属或其他生物。此外，之前还没有发现该翻译起始途径中的基因是免疫诱导的。我们的结果表明，要么在体液免疫中起翻译调节的作用，要么在4E-BP公司类型基因。

材料和方法

结果

分子鉴定和表达托尔.

这个托尔该基因最初根据P{lacW}公司插入位于细胞学位置23F-24A，显示报告基因表达增加，以应对细菌感染(10). 为了确定托尔，我们使用了质粒拯救(13)分离侧翼基因组DNA片段P{lacW}公司插入，共14kb（图。​（图11A类). 该DNA的限制性内切酶片段用于组织就地与整个胚胎杂交以确定编码区域的候选者托尔只有在插入物下游1.7 kb处发生杂交，并且在中枢神经系统中表达，与增强子陷阱的B-半乳糖苷酶定位相同(10). 然后在Northern blot分析中对该DNA片段进行测试，比较有无细菌感染的野生型成年人的RNA。检测到一条0.85 kb的条带，该条带没有感染，并且由感染强烈诱导（图。​（图22A类). DNA测序分析显示，1.7kb的基因确实包含了托尔一个423 bp的内含子中断了编码117-aa蛋白的ORF（图。​（图11B和C).飞基克隆GH19868为全长托尔cDNA，从图的14号碱基开始，到1139号碱基结束。​图11B，Clot 7548是一组部分托尔cDNA。这个托尔该蛋白类似于哺乳动物的翻译调节因子4E-BP（图。​（图11C). 在斑马鱼（黏菌）中也发现了与4E-BP相对应的序列盘状网柄菌和寄生虫曼氏血吸虫（图。​（图11C). THOR与小鼠PHAS-II和人类4E-BP2最为相似，分别具有39%和38%的同源性，两者的相似性为67.5%。重要的是，THOR在中部区域具有高度保守性，残基为34-59，因为这包括4E-BP与eIF4E的结合区域。THOR与该区域的所有序列具有66.5-70%的同一性，除了D.盘状体有55.5%的认同度。

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图1

特性托尔序列。(A类)基因组DNA的限制性图谱托尔P-元素插入(P-lacW公司)位于多烯染色体23F–24A位置。还指出了转录区的排列以及TATA盒序列和起始密码子之间插入的位置。限制性内切酶缩写：G(Bgl公司二） ，P(Pst（磅/平方英尺）一） ，H(Hin公司dIII），B(巴姆HI）和E(生态RI）。(B)THOR的核苷酸序列（顶行）和预测氨基酸序列（底行）。开始和结束密码以粗体显示，内含子由虚线表示。预测的PolyA信号序列下划线。GenBank登录号。｛“type”：“entrez nucleotide”，“attrs”：｛“text”：“AF244353”，“term_id”：“9049773”，“term_text”：“AF244353”｝｝AF244353型. (C)THOR与4E-BP序列的氨基酸比对。其他GenBank登录号用于人类4E-BP:h4E-BP1（NM004095）、h4E-BP2（NM00409）和h4E-BP 3（NM003732）；用于鼠标PHAS-I({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“U28656”，“term_id”：“881557”，“term_text”：“U28656“}}U28656号机组.1）和PHAS-II({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“U75530”，“term_id”：“1658515”，“term_text”：“U75530“}}U75530型); 斑马鱼：zf4E-BP3({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“AI722723”，“term_id”：“5041052”，“term_text”：“A1722723“}}AI722723号);盘状网柄菌({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“C94507”，“term_id”：“3219122”，“term_text”：“C94507“}}C94507年); 和曼氏血吸虫({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“AI014205”，“term_id”：“3228037”，“term_text”：“A1014205“}}AI014205号).

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图2

Northern分析托尔表达式。(A类)俄勒冈州R成人未治疗（−）、受伤（w）和感染（+）。显示受伤和感染的控制探针是抗菌肽（Cec）。这个托尔探针是由1.7kb的DNA探针制成Bgl公司II碎片下游P{lacW}公司插入，如图。​图11A类。反义RNA探针给出与DNA探针相同的结果，RNA探针用于显示的结果B和C。加载控制探针用于肌动蛋白*是指最初注意到的抄本，因为它改变了其中一个肌动蛋白乐队。重组确认杂交托尔到这个2-kb的成绩单(B和C). (B)俄勒冈州R和突变体托尔¹成人未经治疗（−）和感染（+）。(C)的发展概况托尔俄勒冈州的表达。阶段为：0-6小时(6)，6-12小时(12)和12–24小时(24)胚胎；第一个(1)，秒(2)、和第三个(三)龄幼虫；蛹（p）；和成年人（a）。污点被重新涂上第49页作为加载控制。

在小鼠和人类中，分别鉴定出两种和三种4E-BP。标准基因组Southerns不建议在果蝇属（数据未显示），然而，我们对Northern印迹上显示的2kb转录物没有解释托尔探针（图。​（图2）。2). 可能是2-kb转录物来自差异剪接，或反映了来自序列相似的不同位点转录物的交叉杂交。然而，这个转录本显然不是由感染引起的（图。​（图2）。2). 相比之下，0.85-kb托尔转录本不仅是由感染诱导的，它还通过创伤以较小的程度上调，正如其他免疫调节基因所发现的那样（图。​（图22A类). 诱导免疫反应的主要部位是脂肪体，与哺乳动物的肝脏相对应（综述见参考文献。三)，我们发现托尔通过比较有感染和无感染的解剖的三龄幼虫脂肪体，脂肪体中也上调（数据未显示）。

野生型的发展概况托尔表达显示转录物存在于发育的所有阶段，在幼虫阶段，尤其是三龄阶段显著增加（图。​（图22C). 我们之前已经证明B-半乳糖苷酶在P{lacW}雷神菌株定位于胚胎神经系统和幼虫和成人的许多组织(10). 我们在组织中也发现了同样的结果就地与…杂交托尔探测并将分析扩展到生殖系统（图。​（图3）。三). 图。​图3三显示托尔在三龄雄性的睾丸和成年雌性的卵巢中表达。睾丸和卵巢滋养细胞中的这种表达是女性和男性生殖系统中更复杂的表达模式的一部分（B.Andruss、S.Meller和D.a.K.，未发表的观察结果）。的一般表达式托尔尤其是卵巢的表达，在卵巢中有复杂的翻译调控系统(17)，与角色一致托尔作为4E-BP，但4E-BP在免疫应答中的作用与当前免疫观点不一致或不预测。因此，两个重要的初始关注点是：(我)是托尔诱导调节细胞生长作为免疫反应的次要效应？以及(ii（ii）)是托尔诱导特异性免疫诱导？

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图3

组织特异性定位托尔表达式。托尔只在胚胎的中枢神经系统中检测到表达(A类)但在幼虫和成虫的许多组织中，例如脂肪体(B)，睾丸(B和环形压盖(C)三龄幼虫和卵巢滋养细胞(D类)成年女性。的探针A类-C地高辛标记，而D类显示核B-半乳糖苷酶染色托尔-增强子陷阱，因为这更清楚地表明，早在第4阶段，护理细胞就表达托尔.

eIF4E免疫诱导试验。

关于以下可能性的一个重要问题托尔诱导是否参与细胞生长调节电子IF4E也是由感染引起的。在哺乳动物细胞中电子IF4E与恶性转化和伴随的4E-BP公司已经证明可以消除这种过度生长（审查见参考文献。18). 在果蝇属免疫反应，产生大量抗菌蛋白，一种可能性是电子IF4E可以上调翻译量。在这种情况下，托尔上调将具有产生更多4E-BP的稳态功能，以保持生长调节平衡。因此，我们测试了以下假设：电子IF4E细菌感染也使其表达上调。我们发现情况并非如此，因为托尔感染后上调，而电子IF4EmRNA保持不变（图。​（图4）。4). 因此，如果这两种成分被协同调节，它就不处于转录水平。

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图4

免疫诱导试验电子IF4E.俄勒冈州R成人未经治疗（−）和感染（+）的RNA的Northern印迹被连续清洗和复制，用于电子IF4E,托尔作为装载控制，肌动蛋白.

托尔-促销员分析。

研究的所有启动子区域果蝇属感染诱导的抗菌基因被发现含有与哺乳动物免疫诱导基因相似的成分（综述见参考文献）。2和三). 5′-侧翼区域的序列分析确定托尔具有这些类型的元素的数组（图。​（图5）。5). 首先托尔启动子具有典型的NFκB识别序列，该序列已被证明对免疫诱导至关重要（有关综述，请参阅参考文献。2和三). 此外，托尔GATA序列与NFκB元件相关吗？NFκ的B元件也被证明对免疫诱导很重要(19)并且在其他果蝇属物种(14). 在的上游发现其他序列果蝇属免疫反应基因也已被鉴定，尤其是那些参与脊椎动物细胞因子调节和肝脏特异性表达的基因（图。​（图5）。5).变形金刚分析(20)发现了更多与肝脏特异性调节相关的序列，如肝细胞核因子/叉头，以及干扰素相关的调节序列（图。​（图5）。5).

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图5

Thor上游区域。TATA框（粗体）的序列5′概述了调控基序。用于识别这些基序的共识序列如下，并在14中引用，除非另有说明：NFκB反应元件，GGGRNTYYYY(31); GATA，WGATAR；IL-6反应元件（NF-IL6）、TKNNGNAAK、（IL-6-RE）CTGGGA；核因子内皮细胞白细胞粘附分子1（NF-Elam1），WCAKCAK；肝细胞核因子5反应元件（HNF5），TRTTTGY。其中一个NFκB元件中的单个错配用小写字母表示。具有核心身份和至少0.8外部核心匹配的附加序列变形金刚数据库(20)也显示了。这些Transfac序列是干扰素调节因子IRF1、SNAAAGY的元件美国汽车协会CC、IRF2、GNAAAGY美国汽车协会SY；干扰素刺激反应元件IRSE，CAGTTT公司CWCTTTYCC；信号传感器和转录激活剂，果蝇属静态（D-STAT），TTTCCSG美国汽车协会和脊椎动物STAT（V-STAT），TTCCCRKAA公司; 肝核因子HNF1，GGTTA公司ATNWTTAMMN公司；肝细胞核因子/叉头同源物HNF3B，KGNANTRTT公司TRYTTW、HFH1、NAWTGTTT公司ATWT和HFH8，TGTT公司TATNYR公司。核心序列下划线。仅显示NFκB附近的GATA。

突变体的反应托尔苍蝇感染细菌。

免疫反应的最关键测试是感染后的存活率。为了确定托尔我们发现了免疫反应的突变托尔突变，然后受到控制托尔突变苍蝇对不同类型的细菌感染并观察其存活4天。

这个P{lacW}公司导致识别的插入托尔也导致了托尔¹突变。P{lacW}公司插入TATA盒附近，将编码区与启动子区分开（图。​（图11A类)对这种插入的苍蝇进行的Northern分析表明，只有少量的0.85-kb托尔转录本存在，并且在感染后不会增加（图。​（图22B). 这个P（P）-因此，元素插入导致生成托尔¹突变，一种不可诱导的、表达非常弱的亚型。为了控制背景效应，我们使用了托尔¹突变，托尔^1轮是通过精确切除P{lacW}公司插入。确认托尔¹和托尔^1轮苍蝇是托尔，我们还使用了第二个托尔突变，托尔².英寸托尔²,P{lacW}公司也被切除了，但离开了托尔由于不精确的切除，删除了中间的碱基，仍然是突变的P{lacW}公司和第一个B位点（图。​（图11A类).托尔¹和托尔²突变体是纯合子，可以存活和繁殖，在非感染和无菌损伤对照中，存活率与野生型俄勒冈州R型苍蝇相似（10只；数据未显示），托尔^1轮和国际货币基金组织（图。​（图66A类).托尔^1轮像俄勒冈州R一样幸存下来，在这里被称为指定的野生型控制（图中的wt）。​图6）。6). 作为对感染易感性的控制，我们使用国际货币基金组织突变体。在类似的实验中，苍蝇携带内部管理数据已经证明突变对细菌感染高度敏感，并且国际货币基金组织明确控制抗菌基因的诱导(5,6,8).

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图6

成人细菌感染后的存活率。注射不同类型细菌后的存活率（%）托尔苍蝇(托尔¹和托尔²)与…相比国际货币基金组织苍蝇和野生型回复物，托尔^1轮（重量）。(A类)未注射的苍蝇（−）和有无菌伤口的苍蝇（w）作为对照，用于比较感染的影响。使用的细菌是泄殖腔杆菌B₁₂(B)和大肠杆菌(Ec公司). 使用的其他类型的细菌分别在(B),表皮葡萄球菌(硒)、和(C),玫瑰木霉(先生). 将苍蝇保存在29°C下，数据点是20只苍蝇至少5个重复样品的平均值和相应的标准误差。

我们发现突变体的存活托尔成人感染后与野生型成人相似大肠杆菌和泄殖腔杆菌B₁₂（图。​（图66A类). 两种细菌都受到影响国际货币基金组织果蝇如预期，感染后平均存活率为11%泄殖腔杆菌B₁₂1%存活大肠杆菌感染（图。​（图66A类). 感染后（4天）表皮葡萄球菌然而，平均只有46%托尔¹和47%的托尔²苍蝇存活下来（图。​（图66B). 令人惊讶的是，66%的国际货币基金组织苍蝇存活了下来，这比托尔突变体以及先前报道的国际货币基金组织苍蝇，约为8%大肠杆菌感染(6). 使用的测试玫瑰木霉结果表明，即使是野生型苍蝇也易感，平均存活率为47%（图。​（图66C).托尔突变体和国际货币基金组织苍蝇都更容易感染，11%的苍蝇托尔¹，16%用于托尔²，2%用于国际货币基金组织感染后平均存活4天。抗菌反应提供了强有力的防御，突变体的存活失败表明反应的一个关键方面已经被破坏。我们的结果表明托尔突变体是免疫受损的，当受到某些类型的细菌的攻击时，免疫反应的破坏会导致生存失败。

讨论

我们在选择过程中对免疫反应基因进行了初步筛选，没有任何偏见，最终确定了一种与免疫有关的新型基因。托尔是的成员4E-BP公司它是由细菌感染引起的，在较小程度上是由创伤引起的。没有感染，托尔在所有发育阶段都有表达，转录物定位于各种组织。启动子区序列与感染诱导表达托尔在脂肪体中与作为体液反应主要器官的脂肪体相一致，但其他组织也可能上调托尔潜在的干扰素相关调控序列的存在很有趣，特别是考虑到干扰素和翻译调控在病毒感染中的作用。此外，干扰素共识反应元件GAAANN部分托尔干扰素相关的调节序列以前在双蝶呤促进剂，专门用于增强双蝶呤-启动子活性(21).

与体液免疫相反，细胞免疫中的翻译调节已经被指出。例如，在果蝇属，翻译由Watson研究等。在致命（1）异常免疫反应⁸，编码人类S6核糖体蛋白的同源物，并在突变时导致癌症过度生长(22)、和上的6000万美元，RpS6的激酶(23). 在小鼠T细胞中，激活与翻译和转录的变化相关(24). 在免疫抑制剂药物研究中，雷帕霉素被发现可以阻止细胞周期进展，并涉及抑制4E-BP1磷酸化和cap依赖性翻译（参见参考文献。25).

保护作用的范围托尔免疫反应的上调通过使用托尔感染存活实验中的突变体。虽然这种类型的实验看起来很简单，但实际上很难执行，并且没有指出由突变引起的特定缺陷。然而，对感染的整个免疫反应的功能进行了测试，因此这是开始评估托尔在免疫功能方面。我们发现了托尔突变体是免疫受损的，一些细菌类型对生存几乎没有影响，而另一些则会严重降低生存能力。虽然四种细菌类型不足以得出结论，但效果的差异确实与细菌是革兰氏阳性还是革兰氏阴性有关。勒迈特雷等。(8)已经证明了果蝇属对细菌感染类型敏感，对不同的抗菌蛋白基因显示出不同的诱导水平，无论是对单个菌株还是对革兰氏阳性与阴性菌株。国际货币基金组织然而，苍蝇在所有种类中的存活率都很低国际货币基金组织感染后存活良好表皮葡萄球菌而且比以前好多了托尔苍蝇。该结果与观察结果一致，即国际货币基金组织该途径优先被革兰氏阴性菌激活(8)因此，革兰氏阳性菌菌株在国际货币基金组织突变体。托尔苍蝇则相反，它们对革兰氏阴性细菌的抗性更强。

的序列相似性托尔具有4E-BP公司和保护4E-BP公司家族成员暗示了在免疫反应中翻译调节的作用。最直接的假设涉及基于与eIF4E结合的角色，因为这是最保守的区域，并定义了其他系统中已知的家族。事实上电子IF4E就这些基因在调节细胞生长和现在对感染的反应中的相对功能而言，不受感染的上调是令人感兴趣的。因为一个4E-BP公司或其他翻译成分之前未发现由感染诱导，我们的结果是托尔表明免疫反应中有一个意想不到的系统在起作用。作为的死亡国际货币基金组织苍蝇似乎反映了诱导国际货币基金组织-调节基因(5,6),托尔可以假设致死性，以反映特定类型细菌感染相关免疫转录物翻译的必要性。因此托尔在免疫学中可能优先翻译免疫转录物。病毒破坏细胞翻译机制的主要方式是通过使用特定的5′-非翻译区序列、内部核糖体进入位点和eIF4E去磷酸化，以5′-cap依赖的方式启动翻译(26,27). 因此，其他研究的一个模型是，THOR将通过eIF4E抑制cap依赖性翻译，并促进cap依赖型翻译。鉴于在免疫反应中需要大量生产抗菌蛋白，这导致了一个可检验的假设，即免疫转录物的翻译涉及cap依赖机制。此外，编码具有反作用蛋白质的mRNA的翻译也可能受到抑制。或者，如果托尔在免疫诱导后延迟，则THOR可以阻止翻译，从而关闭免疫反应。

托尔可能在免疫记忆中起作用。已经观察到第二次感染比第一次感染产生更强的反应(28)，以及托尔可能提供了解释这种形式的免疫记忆的机制。例如，这可以通过隔离免疫转录物或阻止翻译来实现，如上所述，免疫转录物在以后的翻译中保持稳定。免疫记忆和优先翻译也不是相互排斥的。例如，Dif公司具有典型的5′-非翻译区，用于交替翻译调节，以及迪夫已经有人假设上调是为了解释更强的第二反应(9).

就其他模型而言，在许多生物体中研究的热休克反应提供了一个极好的转录和翻译调控模型，用于与果蝇属免疫反应。热休克mRNA通过热休克序列启动子元件诱导，非热休克mRNA的翻译受到抑制，而热休克mRNA的翻译是优先的，由特定的5′-非翻译区序列介导，似乎涉及cap依赖性翻译（综述见参考文献。29和30).托尔是一个古老的基本系统的候选成员，该系统已发展用于应对各种类型的压力和感染。

尽管托尔最有可能在免疫反应中发挥4E-BP的作用，可能是托尔具有免疫特异性功能，不一定与翻译调控有关。关于是否增加4E-BP或4E-BP途径中的其他成分也会被发现类似托尔具有免疫功能。然而，考虑到先天免疫的系统发育保守性，预计这一新的免疫成分也将得到保守性。

致谢

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脚注

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