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肿瘤。2007年4月；9(4): 349–357.
数字对象标识：10.1593/新07133
预防性维修识别码：项目经理1854851
PMID：17460779

肿瘤囊泡相关CD147调节内皮细胞的血管生成能力1

丹尼尔·米利马吉,1 玛丽安娜·玛丽,* 桑德拉·达森佐,* Eleonora Carosa公司,* 埃马纽埃勒·安吉洛·詹尼尼,* 斯坦利·祖克,† 加斯帕尔·卡塔,‡ 安东尼奥·帕万,*§和文森扎·多洛*
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

细胞外基质的基质金属蛋白酶（MMP）降解被认为在侵袭、血管生成、肿瘤生长和转移中起重要作用。一些研究表明，CD147/细胞外基质金属蛋白酶诱导剂是一种在肿瘤细胞中高度表达的跨膜分子，可能通过调节瘤周基质细胞中基质金属蛋白酶的表达而参与恶性肿瘤的进展。在本研究中，我们发现CD147在上皮性卵巢癌细胞衍生的微泡中表达，并且CD147阳性小泡可能促进内皮细胞的血管生成表型在体外人卵巢癌细胞系OVCAR3、SKOV3和A2780分泌的囊泡表达不同水平的CD147，并以CD147依赖方式刺激人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的促血管生成活性（OVCAR3>SKOV3>A2780）。此外，CD147低表达的卵巢癌细胞系CABA I分泌的小泡对HUVEC血管生成表型的发展没有显著影响。用抗CD147的小干扰RNA处理OVCAR3细胞可抑制OVCAR3-衍生微泡的血管生成潜能。然而，将CD147 cDNA转染到CABA I细胞系可以使CABA I衍生的小泡诱导血管生成并促进HUVEC中MMP基因的表达。因此，我们得出结论，卵巢癌细胞分泌的小泡可能通过CD147介导的机制诱导HUVEC的促血管生成活性。

关键词：棚膜微泡，CD147，卵巢癌，血管生成，基质金属蛋白酶

介绍

CD147，也称为细胞外基质金属蛋白酶（MMP）诱导物或basigin，是一种富含许多恶性肿瘤细胞表面的质膜糖蛋白[1–3]. 到目前为止，一些研究已经令人信服地证明，CD147通过调节基质细胞中血管内皮生长因子（VEGF）和基质金属蛋白酶的表达，在恶性肿瘤的进展中起着关键作用[1,4]. 因此，先前已经证明CD147与成纤维细胞相互作用并刺激其产生MMP-1、MMP-2、MMP-3和膜型1 MMP（MT1-MMP）[5,6]. CD147还被认为通过旁分泌方式作用于基质细胞以调节基质金属蛋白酶的产生，参与肿瘤与其基质微环境的相互作用[4]. 有趣的是，最近的研究提供了证据表明，肿瘤细胞释放CD147的微泡可能通过上调基质金属蛋白酶的产生在肿瘤与基质的相互作用中发挥作用[7,8]. 此外，已知CD147也能刺激人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中MMPs的产生[9].

细胞外基质的基质金属蛋白酶降解被认为在侵袭、血管生成、肿瘤生长和转移中起重要作用[10]. 在这方面，肿瘤侵袭性的增强与MMP表达的增强有关在体外和体内[11]. 由于基质细胞是迄今为止所分析的大多数人类癌症中基质金属蛋白酶的主要来源，CD147被认为是癌症生长和扩散的关键决定因素[9,10,12]. 与这种可能性相一致，CD147在人类乳腺癌和卵巢癌中的表达与更具侵袭性的表型有关[3,13–15]. 此外，用CD147 cDNA转染的人乳腺癌细胞在异种移植物模型中显示出显著更高的肿瘤生长率[11].

膜泡脱落是真核细胞中常见的一种重要现象，可能与血管生成、血栓形成、炎症和免疫等多种病理生理过程有关[16,17]. 在以前的研究中，描述了两种类型的膜泡，称为微泡和外泌体[17–19]. 值得注意的是，微泡和外泌体是通过不同的细胞机制释放的，即微泡通过表面脱落和多泡体胞吐释放[18–20].

我们之前已经证明肿瘤微泡可能携带肿瘤相关的表面抗原，并且可能在卵巢癌患者的血清和腹水中检测到[21]. 此外，肿瘤恶性程度与囊泡数量和囊泡相关MMP-2活性显著正相关。因此，人类肿瘤组成性地释放微泡，运输广泛的生物活性分子，包括细胞表面受体、粘附分子和基质金属蛋白酶[22–26]. 人们越来越关注肿瘤释放的微泡，因为它们具有调节侵袭能力的能力[27–29]促进血管生成[30–32]. 以前的研究表明，人类癌细胞（包括肺癌、结肠癌和胰腺癌）产生大量CD147阳性微泡[7,8]. 然而，CD147阳性小泡的病理生理作用尚未完全了解。根据这些假设，我们的研究目的是通过评估人类卵巢癌细胞释放的微泡对HUVEC表型的影响，来研究微泡在血管生成过程中的作用。

材料和方法

细胞培养

从脐带静脉中分离出HUVEC，并在添加有10%胎牛血清（FCS）、10%新生小牛血清、2 mmol/l谷氨酰胺、50µg/ml内皮细胞生长因子（牛脑粗提物）、青霉素和链霉素的DMEM中的1%明胶涂层烧瓶上生长。使用第三代至第五代培养的细胞。CABA I细胞系是从一名未接受药物治疗的卵巢癌患者的腹水中建立的[33]. CD147转染的CABA I细胞在含有5%FCS和400µg/ml G418的RPMI 1640（Euroclone，Devon，UK）中保持为单层。人卵巢癌细胞株A2780、OVCAR 3和SKOV 3在添加10%FCS的RPMI培养基中培养。

小干扰RNA与转染

通过Zucker等人的方法将CD147/绿色荧光蛋白cDNA转染到CD147低表达的人CABA I卵巢癌细胞中[11]. 根据制造商的协议，使用FuGene（瑞士巴塞尔罗氏）稳定转染细胞。显微镜下对G418抗性克隆进行绿色荧光蛋白荧光筛选，并汇集阳性克隆以最小化克隆变异。生成了仅携带pcDNA3载体的对照转染体。未转染的CABA I细胞或转染pcDNA3的CABAⅠ细胞获得了相同的结果（数据未显示）。根据制造商的协议，我们使用CD147小干扰RNA（siRNA）（h）sc-35298、打乱寡核苷酸sc-37007作为对照，以及sc-29528 siRNA转染试剂（加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司）沉默OVACAR3细胞中的CD147。未沉默的OVCAR3细胞或转染打乱寡核苷酸的OVCAR 3细胞也获得了相同的结果。

流式细胞术分析

如前所述进行流式细胞术分析[33]，稍作修改。简单地说，用小鼠抗人CD147一级抗体（8D6小鼠单克隆IgG）在冰上培养细胞60分钟1圣克鲁斯生物技术公司；1微克/106细胞）在含有0.03%BSA的PBS中。用PBS洗涤后，将细胞与荧光素标记的山羊抗小鼠IgG（Kirkegaard&Perry Laboratories Inc.，Gaithersburg，MD）在冰上孵育30分钟。在流式细胞仪（FACScan，Becton Dickinson，Collaborative Research，Bedford，MA）中分析细胞相关荧光。

从细胞条件培养基中分离膜微泡

如前所述制备微泡[19]. 上述条件培养基在600℃下离心克15分钟，然后在1500克15分钟以清除细胞和大碎片。上清液在10万离心克在4°C下保持1小时。球状微泡在PBS（pH 7.4）中重新悬浮。采用Bradford（意大利米兰Bio-Rad）的方法，以BSA（密苏里州圣路易斯Sigma）为标准，根据囊泡相关蛋白水平的测量对囊泡进行量化。

脐带形成分析

将HUVECs（70000/孔）接种到含5%血清的内皮生长培养基中Matrigel-coated 24孔板上。如图所示，通过添加微泡来刺激细胞。在2小时和24小时后，两名盲人观察者对绳索的形成进行拍照和独立评分。

侵袭试验

使用改进的Boyden室和无PVP聚碳酸酯核孔过滤器（孔径8µm）检测HUVEC侵袭[34]. 过滤器涂有一层厚厚的重组基膜（0.05 mg/ml Matrigel，Becton Dickinson），细胞必须降解才能通过过滤器迁移。如图所示添加微泡。分离HUVEC，在DMEM-0.1%BSA中洗涤，在相同的培养基中以5 x 10的浓度再次悬浮5细胞/ml，并添加到腔室的上部隔间。6小时后，滤镜在甲醇中用1%结晶紫染色，并计数10个高功率场中迁移的细胞。

酶谱学

使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶与1 mg/ml B型明胶（Sigma）共聚进行酶谱分析。在无需加热的非还原条件下，在SDS-PAGE样品缓冲液中稀释微孔（2.5µg）和五倍浓度的HUVEC条件培养基。电泳后，在室温下将凝胶在2.5%Triton X-100中洗涤两次30分钟，并在胶原酶缓冲液（50 mmol/l Tris-HCl，pH7.6，10 mmol/l NaCl，0.02%Brij 35，和5 mmol/lCaCl）中培养过夜2)37°C时。凝胶用考马斯蓝R 250（Bio-Rad）在30%甲醇和10%乙酸中染色2小时，并在相同的溶液中去除染料。明胶酶活性在黑暗背景下显示为清晰的条带，表明底物发生蛋白水解。将WM983A黑色素瘤细胞上清液用作MMP-2和MMP-9的参考标准。

Western Blot分析

细胞用含有50 mmol/l Tris（pH 7.8）、150 mmol/l NaCl和1%NP40的裂解缓冲液进行裂解。如上所述测定细胞裂解物和微泡的蛋白质浓度。细胞裂解物（40µg）和微囊蛋白（10µg。在室温下用10%脱脂奶粉在TBST中孵育至少1小时，以阻断非特异性结合位点。用抗人CD147（8D6小鼠单克隆IgG）的单克隆抗体培养这些斑点1，1:500稀释；Santa Cruz Biotechnology（圣克鲁斯生物技术）1小时，或用肌动蛋白抗体（SC-1616，Santa Cru z Biotechnology）升高，然后用过氧化物酶结合二级抗体阻断缓冲液。洗涤后，使用化学发光检测试剂盒（ECL，Amersham-Pharmacia；Biotech，Piscataway，NJ）观察反应带。

实时聚合酶链反应

使用SV总RNA分离系统（Promega，Madison，WI）分离总RNA，并根据制造商的方案使用ImProm II逆转录系统（Promega）从5µg RNA合成cDNA。每个实时聚合酶链式反应（PCR）反应一式三份，含有2.0µl cDNA。PCR采用SYBR-实时荧光检测PCR产物（Roche）进行。PCR所用引物序列为：MT1-MMP正向、5′-GAGTCAGGGCAGTGGATAG-3′、MT1-MMP-反向5′-GGTAGCCGGTTCTACCTTC（215bp）；MMP-1正向，5′-AGGTCTGAGGGTCAAGCAGCA-3′，MMP-1反向，5′-CTGGTGAAAAGCATGAGCA（111 bp）；MMP-2正向，5′-CACTTTCCTGGGCAACAAAT-3′，MMP-2反向，5′-TGATGTCCCTGGGACAGA-3′（257 bp）；MMP-9正向，5′-TTGGACAGCGAAGAGTGG，MMP-9反向，5′-GCCATCACGTCCTTAT-3′（179 bp）；GADPH正向5′-GGCCTCCAGAGTAAGACC-3′，GADPH反向5′-AGGGGTCTACATGCAACTG-3′（147 bp）。A比较ΔCt吨方法用于检测基因表达。表达水平标准化为看家基因的表达水平GADPH公司.

结果

CD147在卵巢癌细胞系和脱落微泡中的表达

我们检测了四种具有不同侵袭能力的卵巢癌细胞系（CABA I、A2780、SKOV3和OVCAR3），以增加侵袭活性；图1A类). 通过细胞裂解物的Western blot分析，所有测试细胞系的CD147均呈阳性(图1B类)，除CABA I外，其显示未检测到CD147，其水平按以下顺序递增：CABA I、A2780、SKOV3和OVCAR3(图1C类). 使用扫描电子显微镜获得的CABA I细胞囊泡脱落现象的代表性图像如所示图2A类微泡的大小在200到900纳米之间。为了研究CD147是否通过微泡脱落而从卵巢癌细胞系中释放，通过离心分离膜微泡并进行Western blotting分析(图2B类). 卵巢癌细胞脱落的囊泡中CD147呈阳性，其水平依次增加：CABA I、A2780、SKOV3和OVCAR3。

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（A） 三种卵巢癌细胞系侵袭潜能的比较。迁移活性（代表三个实验）是指在十个高倍视野中观察到的迁移细胞的平均数量（三倍的平均值±SD）。（B） CD147的Western blot分析。（C） CD147的流式细胞术分析。右剖面，白色区域，OVACR3；灰色剖面，SKOV3；中央剖面，白色区域，A2780；黑色轮廓，CABA I。

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（A） 微泡相关CD147的Western blot分析。（B） 肿瘤细胞产生的微泡对内皮细胞侵袭性的影响。卵巢癌细胞（1、2和4µg蛋白质）释放的微泡刺激HUVEC。迁移活性（代表三个实验）是指在10个高倍视野中观察到的迁移细胞的平均数量（三倍的平均值±SD）。NIH-3T3上清液作为参考引诱剂，刺激入侵，值为480%。

肿瘤CD147阳性微泡对HUVEC的影响

体外采用Matrigel侵袭试验的实验表明，卵巢癌细胞株脱落的CD147阳性微泡增强了HUVEC的侵袭性。微泡中CD147的表达与内皮细胞侵袭性直接相关（OVCAR3>SKOV3>A2780>CABAI；图2C类). 微泡也能够诱导HUVEC增殖（数据未显示）。CD147表达不可检测的卵巢癌细胞系CABA I脱落的囊泡对HUVECs血管生成表型的发展没有显著影响。因此，我们假设卵巢癌细胞分泌的小泡可能通过CD147介导的机制诱导HUVEC的促血管生成活性。为了阐明这个问题，我们将CD147 cDNA转染到非侵袭性CABA I人卵巢细胞系中，以产生CD147高表达的CABA I细胞(图3A类). 流式细胞术证实CD147-GPF融合蛋白的表达(图3B类)和共焦显微镜（数据未显示）。我们使用实时PCR分析检测CD147转染的CABA I细胞中MMP的诱导。与载体转染的CABA I细胞相比，CD147转染细胞显示MMP-1、MT1-MMP、MMP-2和MMP-9 mRNA增强。诱导最显著的基因是MMP-2(图3C类). CD147转染后，CABA I-shed微泡变成CD147阳性(图4A类). 囊泡相关MMP的酶谱分析证实，与载体转染的细胞相比，CD147转染的CABA I脱落的微泡中pro-MMP-2和pro-MMP-9的表达更高(图4B类). 此外，与载体转染细胞产生的微泡相比，CD147阳性微泡具有更大的诱导HUVEC迁移的能力(图4C类). 为了进一步研究囊泡相关CD147对HUVEC表型的潜在调节作用，用针对CD147的特异性siRNA转染CD147阳性的OVCAR3细胞以沉默其表达。与亲本OVCAR3细胞相比，siRNA处理细胞的细胞提取物的Western blot分析显示CD147表达较低（约六倍）(图3D类). FACS确认了结果(图3E类)共聚焦显微镜分析（数据未显示）。实时PCR用于量化与亲代OVCAR3群体相关的siRNA转染细胞中MMP基因的表达。与载体转染的CABA I细胞相比，CD147表达沉默的细胞显示出MMP-1、MT1-MMP、MMP-2和MMP-9基因表达的显著抑制。还注意到对MT1-MMP mRNA的微弱影响(图3F类). 与亲本细胞衍生的微泡相比，CD147沉默的OVCAR3细胞释放的微泡显示CD147表达降低(图4D类). 类似地，与亲代细胞衍生的微泡相比，从具有沉默CD147表达的OVCAR3细胞中分离的微泡是HUVECs中pro-MMP-2和pro-MMP-9合成的无效诱导物(图4E类). 此外，来自CD147表达沉默的OVCAR3细胞的微泡在诱导HUVEC迁移方面效果较差(图4F类).

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（A，D）CABA I和OVAR3卵巢癌细胞系中CD147的Western blot分析。（B） CABA I中CD147的流式细胞术分析：灰色剖面表示对照细胞，而黑色剖面表示CD147转染细胞。（E） OVCAR3细胞中CD147的流式细胞术分析。灰色轮廓表示对照细胞，而黑色轮廓表示CD147表达沉默的细胞。卵巢癌细胞系MMP-1、-2、-9和MT1-MMP mRNA表达的（C，F）RT-PCR分析。控制单元被任意设置为1。

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卵巢癌细胞中微泡相关CD147的（A，D）Western blot分析。（B，E）肿瘤微泡相关MMP-2和MMP-9的酶谱分析。（C，F）肿瘤细胞层微泡对培养内皮细胞侵袭性的影响。通过CABA I细胞释放的微泡刺激HUVEC，包括转染CD147 cDNA（C）的细胞和未转染CD145 cDNA的细胞，以及通过OVCAR3细胞释放的囊泡，包括沉默的CD147表达（D）（1、2和4µg蛋白）。迁移活性（代表三个实验）是指在10个高倍视野中观察到的迁移细胞的平均数量（三倍的平均值±SD）。

肿瘤表面微泡对HUVEC产生MMP的影响

为了进一步探讨脱落微泡介导肿瘤-内皮相互作用的机制，采用逆转录-PCR（RT-PCR）分析监测经肿瘤释放微泡治疗的HUVEC中MMP的合成。CABA I细胞衍生的微泡未诱导HUVEC中MMP的表达。相反，CD147转染的CABA I细胞脱落的微泡能够增加MT1-MMP（约1.5倍）、MMP-1（约2倍）和MMP-2（约1.9倍）的mRNA转录。然而，OVCAR3细胞脱落的小泡诱导了MT1-MMP（约1.5倍）、MMP-1（约2.2倍）和MMP-2（约2.8倍）mRNA的上调。OVCAR3细胞衍生的微泡不影响MMP-9基因表达(图5A类). CD147表达沉默的OVCAR3细胞脱落的微泡处理后，在HUVEC中未观察到MMP的诱导。收集每种条件培养基并通过明胶酶谱检查。经OVCAR3衍生微泡处理的HUVEC条件培养基显示MMP-2活性增加(图5B类)，但未发现MMP-9诱导的证据（数据未显示）。

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（A） 肿瘤衍生微泡暴露后HUVEC中MMP表达的RT-PCR分析。未经水泡处理的HUVEC的MMP mRNA表达被任意设置为1。（B） 添加微泡后HUVEC条件培养基的明胶酶谱。

肿瘤微泡对HUVEC脊髓形成的影响

我们已经表明，HUVEC微泡可以以自分泌的方式刺激毛细血管样结构的形成[16]. 为了研究卵巢癌细胞脱落的微泡是否能发挥类似的作用，我们使用三维基质（Matrigel）分析了人类微血管内皮细胞在毛细血管样管状结构中的生长。在含有10%血清的完全培养基中培养24小时后，95%以上的HUVEC被组织成毛细血管样结构(图6A类). 相反，维持在低血清（5%）培养基中的细胞无法形成管状网络(图6D类). 用OVCAR3脱落的微泡处理维持在低血清培养基中的HUVEC，如完全培养基观察到的那样，导致脐带形成(图6B类). 然而，从CABA I细胞脱落的微泡不能诱导毛细血管样管的形成(图6C类). 用CD147表达沉默的OVCAR3细胞脱落的微泡处理HUVEC后，未观察到脐带形成(图6E类)而CD147转染的CABA I细胞脱落的微泡能够诱导毛细血管样管状结构的形成(图6F类). 这些结果表明，在低血清培养基中维持的HUVEC的成管与肿瘤脱落微泡中CD147的表达密切相关。

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微泡对内皮细胞形成毛细血管样结构的影响。将HUVEC接种在Matrigel培养基上，培养基中含有10%血清（A）、5%血清（D）、5%含有OVCAR3衍生微泡的血清（B）、5%含CD147沉默表达的OVCAR2衍生微泡（E）的血清、5%含有CABA I细胞脱落微泡的血清（C）、，和含有5%血清的培养基，含有转染CD147 cDNA（F）的CABA I细胞脱落的微泡。这些照片是在孵育24小时后拍摄的（原始放大倍数为100倍）。

讨论

CD147在肿瘤细胞表面高度表达，并以旁分泌方式刺激周围成纤维细胞产生MMPs[35,36]. 此外，最近已经证明CD147刺激肿瘤和间质室中VEGF的表达[9]. 这些发现使CD147成为肿瘤进展中的一个重要分子，包括癌细胞生长、侵袭、转移和血管生成[5,11].

因为CD147是浆液性卵巢癌患者不良临床结局的标志[三]在本报告中，我们试图确定来源于卵巢癌细胞的CD147微泡作为肿瘤/内皮细胞串扰介质的作用。CD147的细胞表达与卵巢癌细胞侵袭能力呈正相关。尽管CABA I细胞具有最低的侵袭潜能，但它们保留了一定的侵袭Matrigel的能力，因此表明其他因素在其侵袭性中起作用（例如MMPs、尿激酶样纤溶酶原激活剂）[37,38]. 此外，所有受试细胞株都将膜微泡脱落到培养基中。值得注意的是，通过Western blot分析评估，微泡结合的CD147与卵巢癌细胞系中CD147的表达成正比。值得注意的是，在所有细胞系的细胞提取物中都没有在微泡中观察到CD147的双谱带。由于微泡产生于脂筏，我们认为这是由于CD147蛋白在这些膜区域的选择性分配。

肿瘤的发展和进展是肿瘤细胞与包括成纤维细胞和内皮细胞在内的邻近细胞协同活动的结果[39,40]. 在这方面，基质微环境的改变，包括血管生成、改良的细胞外基质组成和不平衡的蛋白酶活性，是肿瘤生长和侵袭的重要调节因素。在癌细胞上表达的CD147已被证明能刺激邻近的基质细胞产生多种基质金属蛋白酶。尽管这一过程先于任何直接细胞-细胞接触，但目前尚不清楚CD147是否在肿瘤微环境中以可溶性形式释放[4]或与癌细胞脱落的微泡有关[7].

膜微泡脱落体内和在体外从细胞表面可以观察到正常细胞和肿瘤细胞[19,41]. 在生理条件下，正常细胞对特定刺激只释放有限数量的微泡[16]. 相反，肿瘤细胞的囊泡脱落在很大程度上是一个不受控制的过程，许多囊泡从整个细胞表面组成性脱落[19, 22]. 此外，肿瘤衍生的微泡携带血管生成因子[30,42]可能通过促进内皮细胞迁移和小管生成来促进血管生成[31,32].

我们之前已经证明，HUVEC释放的微泡可能以自分泌的方式诱导动脉内皮细胞的脐带形成[16]. 在本研究中，我们提供证据表明，人卵巢癌细胞系OVCAR3、SKOV3和A2780分泌的囊泡表达不同水平的CD147，并以CD147依赖方式刺激HUVEC的促血管生成活性（OVCAR3>SKOV3>A2780）。此外，CD147低表达的卵巢癌细胞系CABA I分泌的小泡对HUVEC血管生成表型的发展没有显著影响。用抗CD147的siRNA处理OVCAR3细胞可抑制OVCAR3-衍生微泡的血管生成潜能。然而，将CD147 cDNA转染到CABA I细胞系可以使CABA I衍生的小泡在培养的HUVEC中诱导血管生成表型。肿瘤衍生微泡对在体外血管生成可能通过内皮细胞MMPs的转录上调发生，至少部分是这样。

最近，我们已经证明，肿瘤脱落的囊泡可以运输VEGF，血管生成因子的生物利用度取决于微环境中酸性pH值引起的囊泡破裂[42,43]. 然而，尚不清楚囊泡相关CD147是否会直接与靶细胞的质膜相互作用。另一种可能性是CD147的可用性可能涉及从破裂的囊泡中释放该分子。因此，有必要进行进一步的研究，以进一步阐明这种现象背后的分子机制。

总之，我们已经证明卵巢癌细胞分泌的小泡可能通过CD147介导的机制诱导HUVEC的促血管生成活性。综上所述，我们的发现表明CD147在肿瘤诱导的血管生成中起着重要作用，因此是新治疗方法的潜在靶点。

脚注

1这项工作得到了意大利大学和科学技术研究部（MURST）对A.P.和V.D.的资助。

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文章来自肿瘤（纽约）由以下人员提供肿瘤出版社