许多早老蛋白和淀粉样前体蛋白基因突变的家族性阿尔茨海默病患者大脑中路易体含有改变的α-突触核蛋白

摘要

尽管路易体（LBs）是帕金森氏病（PD）的标志性病变，但它们也经常出现在许多尸检证实的阿尔茨海默氏病（AD）患者的大脑中，原因尚不清楚。事实上，免疫组织化学研究表明，在一种被称为AD LB变异体（LBVAD）的AD亚型中广泛存在皮层LB。1-4虽然LBs可能是终末期AD的非特异性结果，但LBs可能反映了部分AD患者中PD的同时发生。或者，LBs在AD脑中的积聚可能是AD发病机制的结果。因此，尽管富含牛磺酸的神经纤维缠结（NFT）和由富含Aβ的淀粉样纤维形成的老年斑（SP）是AD的标志性病变，未知的遗传或表观遗传因素可能使一部分受影响患者在AD进展过程中神经元倾向于积聚LB。

在发现染色体4q21-23上α-突触核蛋白基因的错义突变导致家族性PD后，人们对阐明导致LB形成的机制的兴趣增强了。5, 6这些数据强烈表明，α-突触核蛋白参与了导致LBs形成的异常事件序列，而其他研究也支持这一观点，这些研究表明，α-synuclein是散发性PD、LBs痴呆（DLB）和LBVAD中LBs的主要组成部分。7-10由于从DLB脑中纯化的LBs含有α-突触核蛋白的全长、部分截短和不溶性高分子量聚集体，9α-synuclein溶解度的降低可能在这一过程中发挥作用。9因此，以LBs积聚为特征的神经退行性疾病可能是由野生型α-突触核蛋白的改变以及该蛋白的突变形式引起的。尽管其他两种蛋白质（即β-和γ-突触核蛋白）与α-突触核素部分同源，但在LBs中未检测到，9目前尚不确定它们是否在其他神经退行性疾病中发挥作用。

研究表明，LBs可能由致病性突变而非影响α-突触核蛋白基因的致病性突变引起，LBs存在于一些家族性AD（FAD）患者和一些唐氏综合征患者的大脑中。11-14研究FAD中LBs的患病率和组成对于阐明导致遗传性AD的基因突变如何导致α-突触核蛋白积聚到丝状内含物中，从而可能损害FAD和其他神经退行性疾病中受影响神经元的功能和生存能力，具有重要意义。然而，即使使用抗泛素抗体通过免疫组织化学标记这些包涵体，皮层LB也很难检测到。由于泛素存在于多种脑损伤中，因此它不是LBs的特异标记物。例如，并不总是能够区分泛素阳性LBs和NFT。因此，α-突触核蛋白抗体通过免疫组化将LBs与NFT及其他一些形态相似的病变区分开来7-10促使我们调查FAD患者大脑中LBs的患病率和构成。

材料和方法

结果

FAD病例中最引人注目的免疫组织化学观察是19个可用样本中12个样本的杏仁核中α-突触核蛋白阳性LB的丰度（图1，A和B）▶一些LB似乎与NFT在同一神经元中共存，这一点通过使用tau和α-突触核蛋白抗体的双标记免疫组织化学证实（图1，E和F）▶虽然这些α-同核阳性LB最常见的表现为固体包裹体，但偶尔LB表现为免疫反应晕，核心清晰。与之前的研究一致，7-10α-突触核蛋白免疫反应性LBs也见于伴有LBs的散发性AD患者（即LBVAD患者）和DLB患者，但在正常对照组患者中未发现（数据未显示）。在12例散发性AD患者中，只有2例杏仁核神经元出现轻胞浆α-突触核蛋白免疫反应。

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图1。

低放大倍数(A类)和高倍放大(B类)大量α-同核阳性LB和偶发LB的显微照片(箭头)路易神经节(C类). α-突触核蛋白抗体染色的黑质LB在D类.E类和F类显示通过双标记免疫组织化学检查的LBs，以显示不同组织中α-同核蛋白阳性（粉红色）LBs和τ阳性（棕色；见箭头）NFT(E类)还是一样的(F类)神经元。正常对照组的杏仁核切片不含α-同核蛋白阳性LBs或其他病变(克). 免疫电镜显示PS-1患者杏仁核神经元中存在α-同核蛋白阳性LB(H（H）). LB丝由α-突触核蛋白抗体修饰。比例尺，30μm(A类和克)，10微米(C类)和20微米(B类和D类–F类)和200μm(H（H）).

在相邻的杏仁周皮质（18例FAD样本中的8例）、海马旁回（18例检查的FAD样本的4例）、扣带回（25例检查的25例中的6例）以及额叶的8区和9区（66例检查的FAD样本中有9例）也发现了类似的α-同核阳性LB。黑质中α-突触核蛋白抗体染色的LB较少（检查的15份FAD样品中有2份；图1D▶)以及在蓝斑中（所检查的12个FAD样本中的1个）。在任何FAD病例的小脑中均未发现α-突触核蛋白聚集体，除大脑外，在这里研究的一例FAD病例中的任何其他器官中均未出现α-突触核蛋白染色异常。总的来说，22%的FAD患者至少在一个脑样本中含有LB。

在FAD病例中，α-同核蛋白阳性营养不良过程（所谓的路易神经节，图1c▶)偶尔可见于LBs区域，包括杏仁核、杏仁周皮质、扣带回和黑质。偶尔也在海马CA2-3区观察到这些突起，但这些突起不如DLB和LBVAD中描述的突起突出7-10以及在控制DLB大脑中看到的那些。值得注意的是，在这里研究的任何FAD或对照病例中，均未通过β-或γ-突触核蛋白抗体检测到LBs、营养不良神经突或其他病变。最后，ApoE基因型对这些FAD病例中α-同核阳性LBs或Lewy突起的存在或分布没有明显影响。例如，在四例α-突触核蛋白染色LBs最丰富的FAD病例中，三例具有ApoE-ɛ3/4基因型，另一例具有Apo E-ɥ3/4基因型。

进行免疫电镜研究以确定α-突触核蛋白免疫反应性在FAD脑LB中的超微结构定位，这些实验表明α-突触核蛋白免疫反应性主要定位于LB中的细丝，尽管一些α-突触核蛋白染色也与这些丝状物之间散布的无定形和颗粒状物质有关（图1G）▶因此，正如之前的研究所建议的那样，9这些发现表明α-突触核蛋白是LB丝的主要成分。

尽管可获得适用于生化研究的有限量的未固定、冷冻的FAD杏仁核，但对来自三个FAD和两个正常对照脑的富含α-突触核蛋白的杏仁核提取物进行的蛋白质印迹分析显示，高盐溶性部分中的α-突触核蛋白含量大致相等（图2A）▶在甲酸可萃取提取物中，在两个FAD杏仁核样品（FAD1和FAD2，图2C）的Western blot中检测到高分子量α-突触核蛋白聚集体▶)其中含有α-突触核蛋白的LB存在。无LBs的FAD病例（FAD3）和对照脑缺乏高分子量α-突触核蛋白聚集体（图2C）▶。三例FAD患者甲酸-可溶提取物中单体α-突触核蛋白的减少可能反映了膜结合α-突触核蛋白的降低，因为在高盐不溶的Triton X-100可溶组分中也观察到了这种降低（图2B）▶.

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图2。

用MAb LB509进行的Western blot分析显示，PS-1突变的FAD患者杏仁核中α-突触核蛋白的高分子量聚集。对照组和FAD患者的杏仁核按照材料和方法进行分离。A类：三例FAD患者（FAD1-3）杏仁核高盐可溶组分中的α-突触核蛋白与两例对照患者（C1-2）杏仁核中的α-Synuclein进行比较。B类：高盐不溶性Triton X-100可溶组分中的α-突触核蛋白。C类：甲酸可萃取组分中的α-突触核蛋白。在每条通道中分别装载5微升高盐不溶性Triton X-100可溶性提取物或10微升甲酸提取物。将由高盐溶性和Triton X-100可溶性提取物形成的Western blot暴露在薄膜中的时间相同，而由甲酸可萃取样品形成的blot暴露的时间大约延长五倍。

讨论

这是首次研究确定α-突触核蛋白是否是FAD脑内LBs的组成部分，我们在这里显示，α-而非β-或γ-突触核蛋白的抗体标记了至少22%的大序列LBs(n个=74）FAD大脑。值得注意的是，在杏仁核可供分析的FAD患者大脑中，>60%的患者出现α-突触核蛋白免疫反应性LBs。因此，已知PS-1、PS-2或APP基因突变的FAD病人大脑中LBs的发病率可能远高于先前研究的结果。此外，对α-突触核蛋白染色的LBs的抗体存在于DLB和LBVAD的许多脑区，包括海马旁回和扣带回皮层的深层。然而，与散发性DLB和LBVAD患者的大脑相比，这些FAD患者大脑中出现典型的α-同核阳性黑质LBs和路易神经节（包括典型的CA2-3中出现的）较少。7-10虽然很少有关于FAD脑内LB的电子显微镜研究，但我们的免疫电镜数据表明，这些LB中的纤维被α-突触核蛋白抗体修饰，并且这些LB与PD、DLB和LBVAD中的LB非常相似。此外，与DLB大脑一样，我们的定量Western blot分析表明，FAD大脑LB丰富区域中的α-突触核蛋白聚集成高分子量物种，其可溶性低于正常大脑中的α-synuclein。最后，在这里研究的一名FAD患者的脑外任何组织中都没有出现α-突触核蛋白染色的病变，β-或γ-突触核蛋白抗体也没有染色FAD大脑中的LBs或其他病变。

FAD中α-突触核蛋白表达和/或溶解度局部改变的生物触发因素尚不清楚。然而，我们的观察很重要，因为它们扩展了α-突触核蛋白聚集成LB的疾病，包括与引起家族性PD的突变无关的退行性疾病，涉及非α-突触核蛋白基因的基因突变可能导致一系列事件，局部影响α-突触核蛋白并诱导LB形成。

α-突触核蛋白形成LB的机制尚不清楚。然而，α-突触核蛋白的表达、代谢或生化特性的改变可能导致溶解度降低，随后将其并入LB丝中。我们的数据显示，FAD杏仁核中不溶性α-突触核蛋白库的增加与其他研究的数据一致，这些研究表明，相对于正常大脑，从具有丰富LB的神经退行性疾病大脑中恢复的α-突触核蛋白的溶解度降低。9目前尚不清楚表观遗传因素是否在FAD患者大脑中LB的形成中起作用，但如果我们关于有限数量的FAD患者杏仁核样本中α-同核蛋白阳性LB的流行率的数据准确反映了PS-1、PS-2、，或者APP基因，那么可以合理地推断，这些突变确实在由α-突触核蛋白组成的异常丝形成LBs中起作用。

我们的数据证实了其他人的发现，即α-突触核蛋白是LBs的敏感和特异性蛋白标记物，7-10尽管α-突触核蛋白抗体在所有FAD患者的大脑中检测到LBs，但两名FAD患者除外，这些患者的LBs早已经通过抗泛素抗体和组织化学染色鉴定出来。30在这两个FAD大脑中，LBs没有被α-突触核蛋白抗体标记的原因尚不清楚，但这可能反映了这些大脑中LBs的低丰度，或者之前识别的内含物是泛素阳性的球状NFT，很难与泛素阳性LBs区分开来。事实上，后一个问题无疑说明了这样一个事实，即LBs由于PS-1、PS-2或APP基因突变而不被认为是FAD患者大脑中常见的神经病理学病变，尽管许多作者在包括唐氏综合征在内的遗传异常导致的AD病例中描述过LBs。11-14因此，我们的数据表明，除了通过影响α-突触核蛋白基因导致家族性帕金森病的致病突变外，其他致病突变可能会诱导LB的形成。尽管没有直接证据表明PS-1、PS-2或APP基因突变与野生型α-突触核蛋白代谢紊乱有关，我们的数据表明，现在研究由这些众所周知的FAD突变引起的突变基因产物的潜在相互作用可能是及时的，类似于以前对其他相关蛋白质相互作用的一些研究。31, 32例如，尽管先前已经描述了NFT和LB在散发性DLB和PD患者的大脑中的共同定位，33目前的研究表明，遗传因素可能在同一神经元中这两种不同内含物的共存中起作用。因此，对LBs、NFT和Aβ斑块形成的事件序列的研究可能会阐明遗传和表观遗传因素在这些病变发病机制中的作用。

致谢

脚注

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