逆转录酶治疗大鼠离体肝细胞移植长期近全肝替代

摘要

通过肝细胞移植重建慢性病肝脏将是目前用于治疗终末期肝病的全器官移植的一种有价值的替代方法。1,2然而，迄今为止大多数肝细胞移植研究中的一个主要问题是移植细胞在受体器官中的生长受限。3-7为了解决这个问题，人们通常采用部分肝切除术来切除部分肝脏，从而为移植细胞提供增殖刺激。5-7然而，仅使用部分肝切除术来增加细胞增殖有两个主要局限性：1）只需要一到两轮细胞分裂就可以将肝块恢复到原来的大小，8、9内源性肝细胞和移植细胞均可参与再生过程。其他方法包括向脾脏注射大量细胞（最多1×108细胞）和随后的肝脏移植，10多次细胞移植，11,12或在细胞移植前诱导肝毒性，13但这些方法只能导致适度的肝脏再生。

最近，已经描述了两种广泛肝脏再增殖的实验模型：尿激酶型纤溶酶原激活物转基因小鼠14-16和富马酸乙酰乙酸水解酶（Fah）-无效小鼠，17后者是遗传性酪氨酸血症I型的模型。在尿激酶型纤溶酶原激活物模型中，失去转基因表达的内源性肝细胞14和移植的正常肝细胞15,16由于表达尿激酶型纤溶酶原激活物转基因的常驻肝细胞持续蛋白水解破坏，细胞广泛增殖。14同样，在Fah-null小鼠中，移植的野生型肝细胞比受体肝脏中的酶缺乏细胞具有生长优势，因为后者在酪氨酸代谢途径中积累有毒中间产物。17两种模型都令人信服地证明，移植的肝细胞具有巨大的增殖潜力。15-17在Fah模型中，最新的研究报告表明，移植的野生型肝细胞可以通过6或7个宿主进行连续移植，每个受体中有10000个供体细胞进行完全再生。18然而，由于这两种模型都依赖于独特的遗传背景，它们作为肝细胞移植的通用模型的应用相当有限。

我们推断，如果我们能够开发出一种替代方法，为移植细胞提供比内源性肝细胞更具选择性的生长优势，这可能是一种普遍有用的肝细胞再生方法。本研究描述了一种新的选择性增殖移植细胞的策略，通过干扰常驻肝细胞的增殖能力，使用吡咯烷啶生物碱逆转录酶，然后移植正常细胞并结合部分肝切除术。通过追踪近交系Fischer（F）344大鼠中未表达特定标记基因二肽基肽酶IV（DPPIV）的转基因标记移植细胞，并通过监测移植肝细胞替代肝细胞团的能力，验证了该方法的有效性，通过形态学和组织化学分析确定移植细胞与肝实质结构的整合，通过肝组织中肝细胞特异性蛋白、白蛋白和葡萄糖-6-磷酸酶的表达分析确定移植肝细胞的生化功能，以及糖原合成和储存。使用这些方法，我们观察到雌性大鼠肝脏替换40%至60%的肿块长达1年。实验期间，在雄性大鼠（98%至99%）中观察到肝细胞团几乎完全替换，并在移植后持续9个月。

材料和方法

结果

移植肝细胞的鉴定和增殖

DPPIV的逆转录治疗⁻按照材料和方法中的说明，对F344大鼠进行肝细胞分离和移植，以及三分之二的肝部分切除。所有程序均耐受良好，大多数动物（>95%）均存活。在逆转录酶的急性作用消退后（包括肝窦扩张和充血、轻度炎症和胆道上皮细胞增生），肝实质表现为实质索结构轻度至中度破坏、残余胆道细胞增生、，和散在的肝细胞巨细胞增生症（图1A）▶肝部分切除术（有或无细胞移植）后，肝大细胞显著增加（图1B）▶这些细胞具有大细胞核，这是在肝脏增殖刺激后逆转录酶处理的肝细胞中DNA合成的结果，但这些细胞不能进行有丝分裂(参考文献。22-25以及E.Laconi和P.Pani，未发表的观察结果）。还观察到集群中小肝细胞的病灶区域（图1B）▶无纤维化迹象（图1、C和D）▶、慢性肝病或肝肿瘤，所有这些都是在较高剂量和/或反复服用吡咯里嗪生物碱时发生的。26,27在细胞移植时，没有证据表明逆转录酶对其他器官有毒性，包括肺、心脏、大脑、胃、小肠、结肠、肾脏、胰腺、肾上腺、睾丸和卵巢。

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图1。

逆转录酶或逆转录酶加肝细胞移植和部分肝切除治疗大鼠的肝脏组织学。答：DPPIV公司⁻F344大鼠接受两剂量逆转录酶治疗1个月后。注意肝窦扩张和肝小叶结构中度紊乱，但没有急性或慢性炎症（H&E染色）的迹象。B类：DPPIV公司⁻F344大鼠接受两剂量逆转录酶治疗，如A类然后移植2×106肝细胞和三分之二肝部分切除术。细胞移植后2个月处死动物，进行组织学分析。注意增殖肝细胞的散在病灶（一个病灶由箭头). 肝细胞的大小也有显著变化，包括一些细胞核非常大的肝细胞(箭头). 与移植前状态相比，小叶组织得到了改善，但这因动物而异（H&E染色）。抄送：与中的相同A类，采用三色染色。注意肝小叶结构中度破坏，但无肝纤维化迹象。医生：与中的相同B类，使用三色染色。注意肝细胞的局灶性增生区域，但移植肝细胞和内源性肝细胞之间没有边缘化的迹象，也没有纤维化改变。原始放大倍数：A类通过D类, ×50.

为了追踪移植肝细胞的命运，我们使用DPPIV缺陷型（DPPIV）⁻)F344大鼠模型。28DPPIV是一种由多种上皮细胞类型表达的膜外肽酶；然而，在肝细胞中，其表达模式是独特的，因为它分离到质膜的顶端结构域。29-31DPPIV与Mg共定位²⁺/K（K）⁺ATP酶是胆道的经典标志物，32两种酶都可以通过组织化学分析很容易地检测到。32,33

2×10移植后1天6逆转录酶和部分肝切除治疗雌性大鼠的肝细胞，DPPIV⁺细胞很难找到。它们主要以单个细胞的形式出现在门静脉三联体内或附近的肝窦中（图2A）▶最初，DPPIV组织化学染色弥漫于细胞表面，不局限于胆管，可能反映了最近的细胞分离和移植。移植后第4天，2-4组DPPIV⁺具有典型胆道染色的细胞是可辨别的（图2B）▶，2周时，DPPIV⁺肝细胞出现在二维横截面积的25至50个细胞簇中（图2C）▶.DPPIV公司⁺肝细胞簇在移植后1个月大得多（图2D）▶，范围从100到数百个细胞，移植后2个月，DPPIV⁺簇的范围可达1000个或更多细胞，许多簇融合在一起（图2E）▶在术后2周对雌性大鼠进行基于计算机的形态计量分析，我们发现约3%至5%的肝细胞团表达DPPIV，1个月时增加至15%至25%，2个月时增至40%至60%。在实验期间，肝细胞置换的水平在长达1年的时间内基本保持不变。在接受部分肝切除但未接受逆转录酶治疗的大鼠中，未观察到移植肝细胞的显著生长（数据未显示）。在接受移植肝细胞但未进行部分肝切除的逆转录酶治疗雌性大鼠中，移植后4个月内移植细胞几乎没有增殖（图2F）▶。

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图2。

DPPIV的扩散⁺逆转录酶处理的雌性DPPIV肝脏中的肝细胞⁻部分肝切除术后的突变大鼠。答：2×10移植后1天6肝细胞。分散、孤立的DPPIV⁺细胞位于门静脉三联体附近的肝窦内(箭头).B类：移植后四天。移植的细胞以两到四个细胞组成的小簇存在，这表明细胞会进行几轮分裂。这个箭头指向大细胞DPPIV⁻具有大的深染细胞核的肝细胞。抄送：移植后13天。DPPIV的大小⁺细胞簇正在增加，并且在离门脉三联体（中薄壁组织）更远的地方可以看到簇。这个箭头指向许多大粒细胞DPPIV之一⁻肝部分切除后变得突出的肝细胞。医生：移植后一个月。DPPIV的平均数量⁺集群中的细胞继续增加，更大的集群开始融合。尽管各节段之间和节段内存在差异，但大约15%至25%的肝脏总质量现在被DPPIV替代⁺细胞。电子邮箱：移植后两个月。DPPIV的大小⁺肝簇继续增加，移植肝细胞现在占总肝质量的40%至60%。传真：移植后一个月，未进行部分肝切除。在这些条件下，移植细胞很少增殖，主要在门脉周围区域可见单细胞或双细胞。原始放大倍数：A类,B类,C类、和F类, ×200;D类和E类, ×100.

移植DPPIV的分布和生长模式⁺肝细胞也很有趣。最初在门静脉周围区域观察到通过门静脉输注移植的肝细胞（图2A）▶作为DPPIV的数量⁺细胞增多，形成集群，随后在中间薄壁组织中也可见（图2、C和D）▶这是否意味着门静脉周围区域的原代细胞簇迁移而来的细胞进一步植入肝脏，簇大小的增加使得它们现在更容易在最初由移植细胞稀疏填充的小叶的其他区域被检测到，或者这两种过程的结合尚不清楚。DPPIV中肝细胞的平均大小⁺在周围的肝脏中，肝簇比肝细胞小。如前所述，许多内源性肝细胞（如DPPIV所示⁻如图2所示▶)肝部分切除术后大细胞变为深染细胞核（图2、B和C▶，箭头），反映了吡咯利嗪生物碱的作用。22日至25日

移植和增殖肝细胞并入肝实质

为了确定移植的和新增殖的肝细胞是否在结构上整合到肝实质中，用ATP酶和DPPIV进行双重组织化学分析。在正常F344大鼠中，两种染色均为阳性且重叠（图3A）▶在这些情况下，只能看到DPPIV（铁锈色/橙色）。控制中DPPIV⁻F344大鼠，ATP酶阳性（棕色），但DPPIV阴性（图3B）▶DPPIV后两个月⁺DPPIV肝细胞移植⁻大鼠，DPPIV大簇⁺观察到肝细胞（图3C）▶移植细胞和内源性细胞之间没有边缘分离；移植肝细胞和内源性肝细胞之间的边界不规则，移植细胞似乎正在向肝周围扩张。移植细胞完全整合到肝实质板中，并与相邻的DPPIV形成杂交小管⁻/ATP酶⁺内源性肝细胞（图3D▶，箭头）。

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图3。

移植DPPIV的整合⁺肝细胞进入宿主肝脏的实质结构。大鼠肝移植2×10后2个月DPPIV（锈色/橙色）和ATP酶（棕色）的组织化学染色6DPPIV公司⁺肝细胞。答：正常F344大鼠胆道分布模式中DPPIV和ATP酶重叠染色。在这些情况下，只显示DPPIV（铁锈色/橙色）。B类：DPPIV公司⁻突变体F344大鼠具有ATP酶（棕色）而非DPPIV的泪小管表达。抄送：DPPIV公司⁻大鼠移植2×106DPPIV公司⁺含有两大簇DPPIV的肝细胞⁺细胞向肝实质扩张。没有证据表明DPPIV之间存在物理分离⁺和DPPIV⁻细胞或移植细胞压迫宿主肝脏。宿主肝细胞和移植细胞之间的边缘不规则且模糊，移植细胞似乎沿着薄壁扩张。医生：放大倍数更高C类，显示移植肝细胞和内源性肝细胞之间的物理接触，以及移植肝细胞和宿主肝细胞之间形成混合胆管(箭头). 原始放大倍数：A类,B类、和C类, ×200;D类，×1000。

雄性大鼠近总肝细胞置换

在采用相同方案治疗的雄性F344大鼠中，移植肝细胞的增殖反应在肝脏替代率和范围方面更为显著。2×10移植后1天6肝细胞，再次分离出的单个细胞主要在门脉周围区域观察到（使用×4或×10物镜，每个区域一个门脉间隙中通常不超过一个或几个细胞；图4A▶). 细胞移植后两周，DPPIV⁺横切面上已经观察到由100个或更多细胞组成的肝细胞簇（图4B）▶与雌性大鼠1个月时观察到的水平相当。雄性大鼠细胞移植后1个月，DPPIV⁺肝细胞约占肝细胞总质量的50%（图4C）▶到2个月时，移植的肝细胞替换了90%至95%的实质性肿块（图4D）▶在4个月时，肝细胞置换接近总量（98%；图4E▶). 通过计算机辅助图像分析确定，在9个月龄时，肝细胞的高水平再填充率为99%，并在实验期间持续存在（图4F）▶在小叶边缘和紧邻一些中央静脉的区域观察到残余的内源性肝细胞，通常细胞核很大，DPPIV酶活性阴性（图4E▶，箭头）。在没有部分肝切除的情况下，雄性大鼠移植肝细胞的增殖也非常有限，但在一些动物中，在1个月内其增殖率达到了3%至5%。

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图4。

DPPIV的扩散⁺逆转录酶治疗的男性DPPIV的肝细胞⁻部分肝切除后的突变大鼠。答：2×10移植后1天6肝细胞。几个DPPIV⁺单元位于入口三元组和一个DPPIV附近⁺细胞在肝实质内的识别更深入。肝细胞中观察到广泛的空泡化，在肝切除术后的前24小时内发生不同程度的空泡。B类：移植后两周。移植的肝细胞在一个横截面积内扩张成包含100个或更多细胞的簇。这些集群在门脉周围空间更为突出，也出现在中区，但规模小得多。肝细胞替换率在肝脏不同区域为15%至25%。抄送：细胞移植后1个月。移植的肝细胞现在形成大的汇合细胞团，占肝细胞总数的50%或更多。通过计算机多场分析，该动物的总肝细胞置换率为49%。医生：移植后两个月。观察到广泛的（94%）肝细胞替代。少量残留DPPIV⁻确定了肝细胞。电子邮箱：移植后四个月。观察到几乎全部（98%）的肝细胞置换，只有少数残留内源性（DPPIV）⁻)小叶边缘和中央静脉区的肝细胞(箭头).传真：移植后9个月。肝实质基本上完全被移植肝细胞所取代，目前占肝细胞总量的99%。移植肝细胞用正常的索状结构改造实质板。德国：接受10000个细胞的动物移植后9个月。在这种情况下，可以观察到30%到50%的肝细胞替换。高：100个DPPIV移植后6个月⁺肝细胞。包含200到300 DPPIV的群集⁺肝细胞出现在肝脏的横截面上。这些簇状物似乎完全整合在薄壁组织结构中。原始放大倍数：A类通过小时, ×100.

为了确定是否可以用较少的移植细胞获得有效的肝脏替代物，进行了稀释实验。细胞移植一个月后，除一只动物外，所有动物都出现了成簇的移植肝细胞，即使是移植了100个细胞的大鼠。在移植10000个肝细胞的大鼠9个月时，观察到30%至50%的肝细胞替换（图4G）▶在移植100个细胞的雄性大鼠6个月时，2到6簇DPPIV⁺肝细胞在肝脏的横切面上可见。在这些动物中，移植细胞簇在二维横截面上大小不同，较大的簇包含数百个肝细胞（图4H）▶。

图5显示了雄性F344大鼠肝细胞移植后9个月长期肝细胞置换后肝脏的最终外观，与正常大鼠肝脏相比▶如低倍镜下苏木精和伊红（H&E）染色所示（图5，A和B）▶，小叶结构和整体组织学外观基本正常。放大倍率较高时（图5、C和D）▶与未经处理的肝脏相比，肝细胞的形态、肝板结构和肝窦衬里细胞的外观正常。唯一持续观察到的异常是胆管轻微重叠，这发生在所有接受逆转录酶治疗的动物中。如细胞移植前后DPPIV组织化学染色所示（图5，E▶ 对F） ，肝细胞置换的范围接近全部，仅剩下少量DPPIV⁻小簇中的细胞。图5F▶还显示移植肝细胞恢复了正常的肝索结构。

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图5。

肝细胞移植后9个月肝脏的组织学和组织化学分析。A类,C类、和电子邮箱：未经处理的DPPIV⁻大鼠肝脏。B类,D类、和传真：逆转录病毒处理的DPPIV⁻大鼠肝部分切除移植术后9个月6DPPIV公司⁺肝细胞。A类和B类：福尔马林固定和石蜡包埋组织的H&E染色，放大×50倍。C类和医生：福尔马林固定组织和石蜡包埋组织的H&E染色，放大×200倍。E类和传真：放大50倍DPPIV组织化学染色。除了胆管轻度重叠外B类和D类，移植动物肝脏的小叶结构和组织基本正常。电子邮箱：在逆转录酶治疗后，但在细胞移植前，在部分肝切除时，从大鼠体内取出肝脏。传真：DPPIV移植后9个月来自同一大鼠的肝脏⁺肝细胞。

移植肝细胞的生化功能

为了研究移植细胞执行独特肝细胞生化功能的能力，对白蛋白合成、葡萄糖代谢和糖异生进行了检测。如图6中的系列部分所示，1▶细胞移植后一个月，在小管分布中表达DPPIV的大肝细胞簇（图6A）▶也证明了白蛋白的合成（图6B）▶糖原的储存（图6C）▶类似地，在移植的成簇（DPPIV）中葡萄糖-6-磷酸酶高表达⁺)肝细胞（图6，E和F）▶移植肝细胞不表达细胞角蛋白-19（图6D）▶或γ-谷氨酰转肽酶（未显示），表明这些细胞位于肝细胞而非胆管上皮细胞系。移植细胞的α-甲胎蛋白也呈阴性（数据未显示）。

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图6。

DPPIV的肝细胞生化功能⁺-DPPIV中的移植细胞⁻突变大鼠肝脏。A类通过医生：2×10移植后30天肝脏连续切片6DPPIV公司⁺肝细胞，表达(A类)DPPIV、(B类)白蛋白(C类)糖原，以及(D类)细胞角蛋白-19。E类和传真：单独的序列部分显示(E类)DPPIV和(F类)葡萄糖-6-磷酸酶，另一种在肝细胞中独特表达的蛋白质。移植细胞的白蛋白、糖原和葡萄糖-6-磷酸酶的表达水平至少与内源性肝细胞的水平一样高。在早期，这些蛋白的表达明显高于周围肝脏。原始放大倍数：A类通过F类, ×100.

讨论

本研究表明，移植到大鼠肝脏中的正常肝细胞可以广泛增殖，融入肝实质，重新填充该器官的大部分，并表现出正常的分化肝细胞功能。这是通过用逆转录酶（一种吡咯里嗪生物碱）治疗大鼠，然后结合部分肝切除术进行肝细胞移植来实现的。最初研究吡咯里嗪生物碱是因为它们对动物，特别是绵羊和牛具有毒性，导致急性和慢性肝损伤。26,27这些药物是天然植物物质，肝脏选择性地吸收并代谢为生物活性化合物，使蛋白质和DNA烷基化。27它们在肝细胞周期中产生阻滞，并在晚期S和/或G中积聚细胞₂阶段。22-25尽管吡咯里嗪生物碱代谢迅速，但其对肝细胞增殖的影响持续数周至数月。22-25,34,35在这方面，我们以前曾报道过将正常肝细胞移植到用毛果芸香碱（一种相关的吡咯里嗪生物碱）治疗的大鼠肝脏中，在移植后3个月时，肝脏组织学几乎完全正常。35这表明移植的正常细胞可能有潜力克服这些药物的慢性毒性。35

用这种逆行/部分肝切除方案治疗的动物已维持长达2年，没有发生腺瘤、肝细胞癌或其他肝脏恶性肿瘤。我们观察到谷胱甘肽-S-转移酶P阴性的嗜碱性肝细胞病灶和谷胱甘苷-S-转移酶P阳性的改变肝病灶，但这些病灶的发生率（频率）和数量与相同年龄的未治疗对照F344大鼠相比没有增加。

最初观察到移植细胞为单细胞或双细胞，经过1至2个月的时间，雌性大鼠的肝细胞体积扩大到约40%至60%被替换，而雄性大鼠几乎完全替换（99%）。细胞生长模式呈克隆性，单个细胞形成集群，在1到2个月的时间内逐渐增大。对于二维横截面中包含约25至50个单元的簇，这相当于三维中125至250个单元，假设每个簇代表一个球体，并且横截面穿过球体的最大直径。如果我们还假设每个簇都来自单个移植细胞，那么每个簇中的总增殖质量代表7到8个细胞分裂。这在雄性大鼠大约7至10天和雌性大鼠2周时观察到。当横截面簇大小达到1000个或更多细胞时（雄性大鼠为1个月，雌性大鼠为2个月），这表示~12到13个细胞分裂。膨胀的细胞在不压缩周围结构的情况下整合到薄壁组织块中。最初，增殖的移植肝细胞的大小小于内源性肝细胞，但在移植后3至4天内，这些细胞表现出DPPIV的小管表达。移植肝细胞和内源性肝细胞之间在几天内也观察到杂交小管，移植肝细胞与宿主肝细胞之间没有边缘分离。2到4个月后，移植的肝细胞开始用窦内的内皮细胞、枯否细胞和伊藤细胞改造正常肝板。到9个月时，肝实质结构恢复正常，但胆管轻度重叠。

在逆转录酶治疗的大鼠中，与内源性宿主肝细胞相比，移植的野生型肝细胞似乎经历了选择性增殖，后者受到吡咯里嗪生物碱的有丝分裂抑制。部分肝切除术显著增强了这种增殖。这与尿激酶型纤溶酶原激活物转基因小鼠或Fah-null小鼠形成对比，后者的肝脏细胞增殖是一个持续的过程，是由基因操作的毒性作用造成的。在这些模型中，内源性和移植性肝细胞都可以增殖，但内源性肝细胞被毒性损伤移除，使移植细胞成为优势细胞。虽然肝细胞置换的具体机制不同，但有趣的是，在所有三种模型中，肝细胞置换大约在2个月内完成。如何控制这一过程以及特定生长因子、激素和细胞因子的作用是未来研究的有趣领域。

稀释实验显示移植后肝脏大量重新填充104细胞以及在只接受100个细胞的动物中存在多簇移植肝细胞。这些发现与之前的报告一致，这些报告表明移植肝细胞在需要替换中毒损伤肝细胞的各种条件下表现出高增殖能力。Overturf等人17最近在他们的Fah-null小鼠模型中显示，野生型移植肝细胞和突变肝细胞都经过基因校正体内通过反复静脉注射含有正常Fah cDNA的逆转录病毒载体，能够重新填充Fah-null小鼠的肝脏并恢复正常的酪氨酸代谢。因此，在适当的情况下，细胞移植或基因治疗方法都可以用来纠正特定的遗传缺陷。

在我们的研究方案中，移植的肝细胞在形态、生化和解剖上均正常，在三分之二的肝部分切除术后，肝细胞扩张以恢复肝块。移植细胞及其子代的功能活性通过肝细胞特异性标记物的组织化学和免疫组织化学检测来证明，这些标记物的水平与正常肝细胞中的标记物相当，包括白蛋白、葡萄糖-6-磷酸酶、糖原和DPPIV。这些关于移植细胞分化肝细胞功能的结果与Overturf等人的发现一致，其中在将野生型肝细胞移植到Fah-null小鼠后重组的肝小叶中央静脉区域的移植肝细胞中观察到谷氨酰胺合成酶活性。18

据我们所知，这项研究是大鼠肝脏广泛再生和功能的第一个例子。原则上，同样的策略可以应用于几乎任何哺乳动物物种。此外，该模型易于复制，并为研究基础肝脏生物学的许多方面提供了一个合适的系统，例如分析假定的肝细胞祖细胞和细胞系的谱系和增殖潜力。它还可以用于研究特定生长和分化因子在肝脏重新繁殖中的作用，并使用基因工程或修饰细胞开发新的肝脏疾病动物模型。通过适当的修改，本研究中提出的方法也可能与后天性和遗传性人类肝病的管理相关。当前研究的局限性之一体外基因治疗是指最终存在于宿主肝脏中的少量转导细胞（估计范围为肝细胞质量的0.1%至1.0%）。36通过联轴器体外用目前的细胞移植策略进行基因治疗，应该可以消除这一主要技术障碍。

致谢

脚注

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