美国国家科学院院刊。2000年5月23日；97(11): 5824–5829.
序号67-磷酸化抑制剂1是一种有效的蛋白磷酸酶1抑制剂
布卢姆菲尔德老龄研究中心、戴维斯夫人医学研究所、莫蒂默·B·戴维斯爵士犹太总医院和麦吉尔大学神经病学和神经外科，加拿大魁北克省蒙特利尔市科特·斯特卡瑟林路3755号，H3T 1E2
由加利福尼亚大学圣地亚哥分校Susan S.Taylor编辑，2000年3月14日批准
摘要
抑制剂1（I-1）是一种蛋白磷酸酶1（PP1）的蛋白抑制剂，PP1是一种主要的真核生物Ser/Thr磷酸酶。非磷酸化的I-1不活跃，而磷酸化I-1是一种有效的PP1抑制剂。I-1被磷酸化体内在Thr上35和Ser67.Thr（色度）35被cAMP依赖性蛋白激酶（A激酶）磷酸化，Thr35-磷酸化I-1抑制PP1。到目前为止，磷酸化Ser的激酶67尚未确定Ser的生理作用67磷酸化未知。在这项研究中，我们检测到当谷胱甘肽S公司-含有Ala取代Thr的转移酶（GST）融合I-1突变体35[GST-I-1（T35A）]用作基底。脑提取液中的GST-I-1（T35A）激酶和神经元cdc2-样蛋白激酶（NCLK）无法通过一系列连续色谱分离。GST-I-1（T35A）激酶与来自激酶活性柱部分的抗NCLK抗体免疫沉淀。纯化的NCLK-磷酸化GST-I-1（T35A）和I-1（0.7摩尔磷酸盐/摩尔I-1）。高效液相色谱磷酸肽图谱、氨基酸序列测定和定点突变确定NCLK磷酸化Ser67I-1的。NCLK磷酸化的I-1和I-1（T35A）通过IC抑制PP150值分别≈9.5和13.8 nM。相比之下，A激酶磷酸化I-1的抑制作用仅为NCLK磷酸化I-1的约1.2倍。我们的数据表明，NCLK有潜力体内I-1激酶和Thr35和Ser67磷酸化独立激活I-1。
关键词：神经元cdc2样蛋白激酶
蛋白磷酸酶1（PP1）是一种主要的真核生物Ser/Thr磷酸酶，调节糖原代谢、细胞分裂、肌肉收缩、信号转导、神经功能和RNA加工等多种细胞过程（参考文献。1–5). PP1是一种37-kDa催化亚单位，其活性由两类调节亚单位调节：靶向亚单位和抑制亚单位。靶向亚单位赋予底物特异性并将PP1定位于不同的亚细胞隔室(1–三). 抑制亚单位抑制PP1的催化活性(4,5). 抑制剂1（I-1）、DARPP-32和抑制剂2是热稳定的PP1抑制亚单位。DARPP-32是一种主要在大脑中发现的I-1同源物。I-1和DARPP-32的抑制活性需要磷酸化，而抑制剂2在没有磷酸化的情况下抑制PP1。
I-1是一种≈19-kDa蛋白，广泛表达于多种哺乳动物组织中(4–7). 在Thr上磷酸化35和Ser67体内(6). 瑟35被cAMP依赖性蛋白激酶（A激酶）磷酸化，这种磷酸化使I-1成为PP1抑制剂(6,7). 到目前为止，I-1 Ser67激酶尚未鉴定。Ser的生理作用67磷酸化也未知。在这项研究中，我们使用了谷胱甘肽S公司-转移酶（GST）融合I-1突变体，含有Ala代替Thr35以GST-I-1（T35A）为底物，在脑提取物中检测到高水平的激酶活性。我们在此报告I-1 Ser的身份67激酶并描述Ser的作用67I-1活性的磷酸化。
材料和方法
I-1 cDNA克隆和位点特异性I-1突变。
含有人类I-1和I-1（T35A）的pGEX-2T载体是杜克大学谢诺利卡尔（Shirish Shenolikar）赠送的礼物。一种含有Ala取代Ser的I-1突变体[I-1（S67A）]67通过基于PCR的巨引物突变构建(8). 两步Pfu公司以人Ⅰ-1 cDNA为模板进行DNA聚合酶催化PCR。第一步，前向引物5′-CTTCCGGAATTC公司ATGGAGCAAGACACACCCCCG-3′，包含生态RI位点（斜体）和I-1突变反向引物Ser67→ 阿拉，5′-189CCGTTGCCGTGG公司CGC公司CATTGCCAAAG公司213-使用3′。PCR（30个循环）在94℃下进行30秒，55℃下进行1分钟，72℃下进行40秒，并纯化PCR产物。在第二步中，上述纯化的PCR产物用作正向引物和5′-GCGCCGCCTCGAGT公司CAGACCGAGTTGGCTCCCTTGG-3′包含Xho公司I位点（斜体）用作反向引物。PCR（30个循环）在94℃下进行30秒，55℃下进行1分钟，72℃下进行1.5分钟。最终PCR产物被纯化并亚克隆到生态RI公司/Xho公司pGEX-6P-1载体的I位点。将重组质粒转化为大肠杆菌首先是DH10B，然后进入BL21（DE3）。DNA测序证实了该突变。
蛋白质和肽。
从大肠杆菌谷胱甘肽-S-脑葡萄糖亲和层析裂解产物(7). 使用Sigma的凝血酶清洁剂试剂盒并遵循制造商的说明，从各种I-1构造中去除GST标签。从新鲜牛脑中纯化了神经元cdc2-样激酶（NCLK）(9). 从兔骨骼肌中纯化磷酸化酶激酶(10). PP1α是E.Y.C.Lee（纽约医学院）赠送的礼物。A激酶的催化亚基、磷酸化酶b、A激酶底物keptide（LRRASLG）和A激酶抑制肽PKI（TTYADPIASGRTGRNAIHD）来自Sigma。抗NCLK cdk5亚单位和丝裂原活化蛋白激酶（MAP）C端多克隆抗体的制备埃尔克1)前面已经描述了NCLK肽底物（KTPKKPKTPKKAKK）的合成(10). 针对酪蛋白激酶1和酪蛋白激酶2的多克隆抗体是由麦吉尔大学的路易斯·拉罗斯和斯蒂芬·理查兹赠送的。
蛋白质和肽浓度。
以牛血清白蛋白（BSA）为标准，通过生物反应蛋白测定法测定GST-I-1和I-1浓度。I-1（T35A）、I-1（S67A。以GST-I-1为标准，通过生物反应蛋白测定法测定所有GST-I-1物种的浓度。NCLK浓度基于其活性(9). A激酶、磷酸化酶b、坎普肽和A激酶抑制肽的浓度基于干重。以牛血清白蛋白（BSA）为标准，通过生物反应蛋白测定法测定所有其他蛋白质浓度。NCLK底物肽的浓度基于氨基酸分析。
活性分析。
GST-I-1（T35A）激酶分析在30°C下启动，方法是将10μl激酶溶液添加到30μl含有其余分析成分的反应混合物中。各种分析成分的最终浓度为25 mM Hepes（pH 7.2）、50 mMβ-甘油磷酸、10 mM NaF、1 mM EDTA、1 mM-DTT、10 mM-MgCl2，0.4 mM[γ-32P] ATP和0.2 mg/ml GST-I-1（T35A）。30分钟后，从反应混合物中提取20μl，与SDS/PAGE样品缓冲液混合，并在SDS/10%聚丙烯酰胺凝胶上电泳。切下凝胶中的GST-I-1（T35A）条带，并在液体闪烁计数器中测量其放射性。使用50μM肽底物，如上所述检测NCLK活性(9). 30分钟后，将10μl 50%三氯乙酸添加到分析混合物中，该混合物在4°C下培养10分钟并离心。提取试验混合物中的上清液，并通过磷酸纤维素条带试验进行分析(11). 以肯普肽为底物，如上所述测量激酶活性。
要生成图。和表除I-1的浓度为0.6 mg/ml外，如上所述制备磷酸化I-1。使用时，A激酶的浓度为25μg/ml。在30°C下12 h后，用50 mM Tris●HCl（pH 7.4/1 mM EDTA/1 mM DTT）透析反应混合物。NCLK-磷酸化I-1（T35A）也如上所述制备。如上所述，通过用NCLK磷酸化I-1，然后用A激酶磷酸化I-1，各6小时来制备NCLK/A激酶磷酸化I-1。在相同条件下同时制备NCLK磷酸化I-1、NCLK磷化I-1（T35A）、A激酶磷酸化I-1和NCLK/A激酶磷酸化的I-1，并在同一容器中进行透析。NCLK磷酸化I-1、NCLK磷化I-1（T35A）、A激酶磷酸化I-1和NCLK/A激酶磷酸化的I-1中的磷酸盐含量分别为0.7、0.5、0.8和1.4摩尔/摩尔抑制蛋白的磷酸盐。同样，NCLK磷酸化GST-I-1、NCLK磷化GST-I-1（T35A）和A激酶磷酸化GST I-1中的磷酸盐量分别为0.5、0.3和0.8摩尔/摩尔抑制蛋白。
A激酶磷酸化I-1和NCLK-磷酸化的I-1和I-1（T35A）对PP1的抑制作用。在指示的抑制剂浓度下对PP1活性进行测定。30分钟后，取出等分样品并分析PP1活性。所有分析均在相同条件下同时进行。
表3
| 抑制剂 | 集成电路50，毫微克 |
|---|
| 识别1 | 无抑制作用 |
| 激酶磷酸化I-1 | 7.5 ± 0.49 |
| NCLK-磷酸化I-1 | 9.5 ± 0.93 |
| NCLK/A激酶磷酸化I-1 | 4.8 ± 0.18 |
| I-1（T35A） | 无抑制作用 |
| NCLK-磷酸化I-1（T35A） | 13.8 ± 1.5 |
| GST-I-1型 | 无抑制作用 |
| 激酶磷酸化GST-I-1 | 55 ± 4 |
| NCLK-磷酸化GST-I-1 | 74 ± 7 |
| GST-I-1（T35A） | 无抑制作用 |
| NCLK-磷酸化GST-I-1（T35A） | 149 ± 12 |
PP1活性按所述进行分析(7)在含有50mM Tris·HCl（pH 7.4）、1mM DTT和0.5mM MnCl的30μl反应混合物中2，10微米[32P] 磷酸化酶a和0.5μg/ml PP1。通过将1μl PP1添加到20μl含有其余分析成分的分析混合物中来启动反应。在30°C下20分钟后，通过向分析混合物中添加10μl 50%三氯乙酸终止反应。然后将分析混合物在冰上冷却并离心。将上清液中的20μl等分试样置于滤纸上，并置于闪烁计数器中，以测定释放量[32P] P（P）我. [32P] 如前所述，在30°C下制备用于PP1分析的磷酸化酶a 30分钟(10). [32P] 磷酸化酶a在50 mM Tris·HCl（pH 7.4/1 mM EDTA/1 mM DTT）中透析，并在−80°C下冷冻保存，直至使用。如上所述监测PP1对磷酸化I-1的去磷酸化作用。The concentration of32分析中的P-I-1为0.1 mg/ml。
磷酸肽纯化和肽序列测定。
如上所述，通过NCLK将GST-I-1（0.6 mg）磷酸化12 h。磷酸化GST-I-1在葡聚糖凝胶G-25柱上脱盐，冻干，在0.2 ml 50 mM NH中再溶解4HCO公司三（pH 8.0）含有50μg/ml胰蛋白酶，并在37°C下培养12小时18反相高效液相色谱法(10). 合并放射性HPLC馏分，浓缩至≈0.5 ml，并通过Sephadex G-25柱进行色谱分析，用0.1%三氟乙酸（TFA）平衡并洗脱。收集组分（每个0.5 ml），合并含有放射性的组分，浓缩至0.2 ml，并如上所述重新注入HPLC柱。用0–40%（vol/vol）乙腈梯度在0.1%TFA中洗脱色谱柱60分钟。含有放射性肽的部分在维多利亚大学生物化学和微生物学系进行氨基酸测序。
GST-I-1（T35A）激酶的部分纯化。
所有程序均在4°C下进行。新鲜牛脑（≈1 kg）在2升缓冲液A（20 mM Mops，pH 7.4/50 mMβ-甘油磷酸钠/10 mM NaF/1 mM EDTA/1 mM DTT/15 mM MgCl）中均质1分钟2)含有1 mM PMSF、1μg/ml亮氨酸肽、1μg/ml胃蛋白酶抑制素和5 mg/ml苯甲脒。匀浆在10时离心4×克30分钟。然后在10分钟时将上清液离心5×克将得到的清澈上清液加载到之前与缓冲液a平衡的DEAE-Sephacel（Sigma）色谱柱（2.5×45 cm）上，用缓冲液a中的0.5 M NaCl洗脱色谱柱。将含有GST-I-1（T35A）激酶活性的流通部分加载到SP-Sepharose（Pharmacia）色谱柱上（1×60 cm）。用缓冲液A清洗色谱柱，并用600 ml线性梯度为0–0.5 M NaCl的缓冲液A洗脱。将含有激酶活性的组分合并并加载到在缓冲液A中预先平衡的羟基磷灰石色谱柱（1.5×25 cm）上。用缓冲液B冲洗色谱柱，然后用250 ml线性梯度K洗脱2高性能操作4将含有激酶活性的流出物组分合并（≈50 ml），浓缩至≈5 ml，并在FPLC Superose 12凝胶过滤柱上进行凝胶过滤色谱（Pharmacia；2×70 cm，在含有200 mM NaCl的缓冲液A中平衡和洗脱）。
免疫沉淀和免疫印迹。
图中含有激酶活性的凝胶过滤部分。C类（≈1 ml）用50μl葡萄球菌蛋白A-琼脂糖珠（Sigma）清除，并分成两半（每个450μl）。每一半加入50μl免疫前血清或抗NCLK血清。在4°C条件下，将两部分倒置摇晃。摇晃1小时后，将50μl在缓冲液A中预先平衡的蛋白A-琼脂糖珠添加到每一半中，并继续摇晃一小时。通过离心收集蛋白A-琼脂糖珠，用冰冷的缓冲液A洗涤五次，并如上所述进行NCLK活性测定，但排除了三氯乙酸沉淀步骤。将分析混合物离心，并将上清液点在滤纸上，以确定纳入肽底物的放射性量。如前所述进行免疫印迹(9).
不同色谱柱中GST-I-1（T35A）激酶和NCLK的合并。牛脑提取物通过DEAE-Sephacel柱进行色谱分析。对含有GST-I-1（T35A）激酶活性的流通部分进行SP-Sepharose(A类)，羟基磷灰石(B类)和Superose 12凝胶过滤(C类)色谱法。提取所示组分的等分样品，并检测GST-I-1（T35A）激酶和NCLK活性。使用Pharmacia FPLC系统以1 ml/min的流速进行凝胶过滤A类,B类、和C类分别为5、5和1ml。
结果
脑提取物中的GST-I-1（T35A）激酶。
我们发现牛脑提取物中GST-I-1（T35A）激酶活性较高。当进行DEAE-Sephacel色谱分析时，在流通馏分中恢复了这种活性（数据未显示）。当通过SP-Sepharose柱对DEAE流通部分进行色谱分析时，GST-I-1（T35A）激酶活性被洗脱为一个对称的单一峰，这表明脑提取物中可能只有一个GST-I-1（T33A）激酶（图。A类). 我们着手确定这种激酶的特性。
为了确定GST-I-1（T35A）激酶是否是MAP激酶之一，从图中的不同组分中提取20μl。A类用MAP激酶多克隆抗体进行免疫印迹。我们的抗体可以检测到毫微克p43erk1号机组和第42页erk1号机组无免疫反应（数据未显示）。使用针对酪蛋白激酶2和酪蛋白激酶1的多克隆抗体进行的类似免疫印迹分析确定，图中没有这两种激酶。A类分数（未显示数据）。图。A类这些组分也没有任何可检测到的肯普肽激酶（A激酶）活性（数据未显示）。根据这些观察结果，我们得出结论：MAP激酶p43erk1号机组和p43细胞外信号调节激酶2，酪蛋白激酶1、酪蛋白激酶2和A激酶在图中的各个柱馏分中不存在。A类这些激酶很可能与DEAE柱结合，并且在用于产生图的DEAE流通级分中不存在。A类当20 mM LiCl，糖原合成酶激酶3抑制剂(12)，包括在GST-I-1（T35A）激酶测定混合物和图中的各种组分中。A类经分析，未观察到任何影响（数据未显示）。类似地，2mM EGTA，一种特异性Ca2+螯合剂也没有抑制GST-I-1（T35A）激酶活性。A类这些观察结果表明GST-I-1（T35A）激酶在图。不能是糖原合成酶激酶3或任何钙2+-依赖性激酶（蛋白激酶C、钙调素依赖性蛋白激酶或磷酸化酶激酶）。
NCLK是一种脑脯氨酸导向蛋白激酶(9,13). 因为I-1 Ser的羧基侧有脯氨酸67(7)，我们分析了各种图中的NCLK活性。A类分数。检测到与GST-I-1（T35A）激酶共稀释的强大激酶活性（图。A类). 为了确定NCLK和GST-I-1（T35A）激酶是相同的还是不同的，图。A类依次进行羟基磷灰石和凝胶过滤色谱分析。如图所示。 B类C、NCLK和GST-I-1（T35A）激酶活性由两个色谱柱共同计算。使用抗NCLK抗体，然后我们从图中免疫沉淀NCLK。C类峰柱分数。对产生的免疫复合物进行NCLK活性测定。抗NCLK免疫复合物显示出强烈的GST-I-1（T35A）激酶活性（数据未显示）。
通过NCLK对I-1进行磷酸化。
我们之前的数据表明，有趣的可能性是，NCLK是GST-I-1（T35A）激酶，或者GST-I-1（T33A）激酶与脑提取物中的NCLK有物理结合。为了区分这些可能性，我们通过纯化的NCLK检测了各种I-1物种的磷酸化。如图所示。A类，NCLK磷酸化GST-I-1（T35A）和GST-I-1，但未能磷酸化GST-I-1（S67A）。正如预期的那样，一种激酶磷酸化了GST-I-1和GST-I-1（S67A），但没有磷酸化GST-I-1（T35A）。图。B类显示了NCLK对GST-I-1磷酸化的时间过程。在4小时内，NCLK每摩尔GST-I-1加入0.5摩尔磷酸盐。由于这些实验中使用的NCLK是从大脑提取物中纯化出来的，我们进行了实验以确定观察到的GST-I-1磷酸化是由NCLK的作用引起的，而不是由我们NCLK制剂中的任何污染激酶引起的。
I-1的磷酸化和奥洛霉素对磷酸化的抑制。使用400单位/ml NCLK和0.2 mg/ml I-1物种进行磷酸化。使用时，A激酶的浓度为25μg/ml。在指定的时间后，从每个混合物中提取20μl并电泳，通过凝胶放射自显影术分析磷酸化。(A类)通过NCLK和A激酶使GST-I-1、GST-I-1（T35A）和GST-I-1（S67A）磷酸化。磷酸化进行30分钟(B类)NCLK诱导GST-I-1磷酸化的时间进程。控制通道C含有GST-I-1，与其余分析成分单独孵育40分钟。NCLK与其他分析成分单独孵化，凝胶上没有显示GST-I-1大小的任何放射性带（数据未显示）。(C类)奥洛穆辛对GST-I-1磷酸化的抑制作用。在所示浓度的olomoucine（Sigma）存在下，通过NCLK进行GST-I-1磷酸化30分钟。(D类)通过NCLK和A激酶对I-1、I-1（T35A）和I-1（S67A）进行磷酸化。指示的I-1物种被指示的激酶磷酸化30分钟。
激酶抑制肽PKI（50μM）完全抑制了A激酶的I-1磷酸化，但对NCLK的I-1磷酸化没有影响（数据未显示）。同样，NCLK的GST-I-1磷酸化不受20 mM LiCl或2 mM EGTA的影响（数据未显示）。这些观察结果表明，图。B类不是由任何污染物A激酶、糖原合成酶激酶3或任何钙引起的2+-依赖性激酶。使用酪蛋白激酶1、MAP激酶和酪蛋白激酶2的多克隆抗体进行的免疫印迹分析未能显示与所有NCLK制剂的任何交叉反应。这些结果表明，NCLK制剂的GST-I-1磷酸化不是由任何污染MAP激酶、酪蛋白激酶1或酪蛋白激酶2引起的。最后，我们加入了奥洛霉素，一种特殊的NCLK抑制剂(14)，并监测GST-I-1磷酸化。如图所示。C类，奥洛霉素完全抑制GST-I-1磷酸化。根据这些结果以及我们的观察结果，本研究中使用的所有NCLK制剂都以类似的方式磷酸化了GST-I-1，我们得出结论，NCLK确实磷酸化了GST-I-1。
为了进一步评估NCLK对I-1的磷酸化作用，用凝血酶处理各种GST-I-1物种以去除GST标记。由此产生的I-1物种被NCLK和A激酶磷酸化。如图所示。D类，NCLK磷酸化了I-1和I-1（T35A），而没有磷酸化I-1（S67A）。类似地，A激酶磷酸化了I-1（S67A），但未能磷酸化I-1（T35A）。
我们比较了GST-I-1作为NCLK和A激酶底物（表). 这个K（K）米这些值表明，GST-I-1与NCLK的结合比与A激酶的结合更好。然而，人员流动率(k个猫)A激酶磷酸化比NCLK磷酸化高约13倍。总的来说，k个猫/K（K）米这些值表明，GST-I-1的A激酶底物比NCLK底物好≈2倍。
表1
| 激酶 | K（K）米，微米 | k个猫，分钟−1 | k个猫/K（K）米，分钟−1●微米−1 |
|---|
| 一种激酶 | 8.1 ± 0.8 | 318 ± 23 | 39.2 |
| NCLK公司 | 1.2 ± 0.1 | 24 ± 4.8 | 20 |
磷酸化位点测定。
用胰蛋白酶消化NCLK-磷酸化GST-I-1并进行HPLC分析。只有一个保留时间≈32 min的放射性峰从色谱柱中洗脱出来（数据未显示）。合并放射性组分并纯化磷酸肽。分离出一个磷酸肽。这种纯化的磷酸肽在气相氨基酸测序器中进行氨基酸测序（表). Ser、Thr、Leu、Ala、Met、Pro和Arg分别被鉴定为该肽的第一、第二、第三、第四、第五、第七和第八个残基。第六种残留物无法识别。由于磷酸化氨基酸的苯硫乙内酰脲衍生物无法通过Edman降解鉴定，因此未经鉴定的第六个残基必须是磷酸化氨基酸。根据这些观察结果，NCLK不能磷酸化GST-I-1（S67A）和I-1（C67A）（图。 A类和D类)和人类I-1的氨基酸序列(7)，我们得出结论，磷酸肽从残基62延伸到残基69和Ser67是磷酸化位点。为了证实NCLK磷酸化Ser上的I-167如上所述，GST-I-1和I-1被NCLK磷酸化并用胰蛋白酶消化。在相同条件下对两种胰蛋白酶消化物进行HPLC磷酸肽图谱分析。两幅图看起来完全相同，每个图只有一个放射性峰，保留时间≈32分钟（数据未显示）。这些观察结果表明，NCLK在Ser67.
表2
| 循环 | 氨基酸 | 产量，pmol |
|---|
| 1 | 序号 | 18 |
| 2 | 瑟 | 8.8 |
| 三 | 卢 | 5.4 |
| 4 | 阿拉 | 2.6 |
| 5 | 遇见 | 1.7 |
| 6 | Xaa公司 |
| 7 | 赞成 | 1.8 |
| 8 | 精氨酸 | 1.4 |
NCLK磷酸化对I-1功能的影响。
先前的研究已经确定，I-1仅在Thr35A激酶磷酸化(4–7). 自从我们发现NCLK磷酸化Ser上的I-167，我们检测了NCLK磷酸化对I-1抑制活性的影响。如图所示。，NCLK磷酸化的I-1和I-1（T35A）以剂量依赖的方式抑制PP1。表比较IC50各种I-1物种的（半最大抑制所需的浓度）值。激酶磷酸化的I-1通过IC抑制PP150值≈7.5 nM。集成电路50NCLK-磷酸化I-1和I-1（T35A）对PP1的抑制值分别为≈9.5 nM和≈13.8 nM。NCLK/A激酶磷酸化I-1通过IC抑制PP150值为4.8 nM。这些数据表明，A激酶磷酸化I-1的抑制性约为NCLK磷酸化I-1的1.3倍，而NCLK/A激酶磷酸化的I-1分别约为A激酶磷酸化I-1和NCLK磷化I-1抑制性的1.5倍和2倍。
PP1对NCLK-磷酸化I-1的去磷酸化。
瑟35-磷酸化的I-1在Mn存在下被PP1去磷酸化2+(15). 检查Ser的去磷酸化67-通过PP1磷酸化I-1，制备了一种激酶磷酸化和NCLK磷酸化的I-1物种。监测PP1对这些物种的脱磷作用。A激酶和NCLK磷酸化的I-1物种都被PP1去磷酸化。激酶磷酸化的I-1的去磷酸化速度是NCLK磷酸化I-1的3倍（数据未显示）。这些数据表明PP1去磷酸化I-1在两个Thr上磷酸化35和Ser67在锰的存在下2+.
讨论
未磷酸化的I-1不抑制PP1。在Thr上35通过A激酶磷酸化，I-1成为有效的PP1抑制剂(6,7). 瑟35磷酸化被认为是I-1抑制活性的关键(三–7). 然而，我们发现67NCLK磷酸化的I-1抑制PP1，而NCLK磷酸化的I-1（T35A）是一种优秀的PP1抑制剂（图。). 这些观察结果表明67-磷酸化的I-1抑制PP1，I-1通过两个不同位点的磷酸化独立激活，即Thr35和Ser67.
艾特肯等。(6)发现I-1被磷酸化体内关于Ser67除Thr外35这些作者没有直接研究Ser67磷酸化。然而，根据他们的观察，在几个含氰溴代叶的I-1肽中，只有含有I-1残基2-66的CB1在A激酶磷酸化时具有完全活性，他们认为67磷酸化似乎并不调节I-1功能(6).
在本研究中，使用细菌表达的重组I-1，我们确定67磷酸化以类似于Thr的方式激活I-135磷酸化，与Aitken的建议相矛盾等。(6). 与我们的数据一致，黄和格林斯曼(16)他最初描述了I-1，表明I-1以磷酸化活性形式和非磷酸化非活性形式存在，只有非磷酸化的非活性形式需要A激酶磷酸化才能激活。因为艾特肯等。确定I-1从组织中分离时在Thr上完全脱磷35(6)和≈50%磷酸化67(1,6)Huang和Glinsmann描述的磷酸化活性形式(16)很可能是Ser67-磷酸化的I-1。此外，艾特肯的观察等。(6)只有CB1肽抑制PP1并不奇怪，也不排除Ser67磷酸化激活I-1。现在，除了Thr之外35，包含PP1结合基序RKIQF的I-1残基8-12的N末端区域对I-1功能至关重要（参考文献。7和17; 见下文）。I-1的溴化氰裂解将产生几个肽，其中包括所谓的CB1，它含有35和一个八聚体，残基67–74，含有Ser67只有CB1含有RKIQF序列，因此可能表现出PP1抑制活性。
PP1活性中心由一个催化腔组成，该催化腔具有一个结合底物的酸性槽和一个疏水槽(17). 底物的磷酸苏氨酸/丝氨酸占据PP1催化间隙。底物磷酸苏氨酸/丝氨酸侧面的碱性和疏水性残基与PP1酸性和疏水性凹槽相互作用(17). 有人建议Thr35-磷酸化I-1是一种活性位点抑制剂，以类似于底物阻断PP1-底物相互作用的方式与PP1结合(17). 在这项工作中，我们发现67-磷酸化的I-1也抑制PP1。需要更多的研究来阐明Ser抑制PP1的生化机制67-磷酸化I-1。然而，I-1含有四种基本残基，Arg69，氩气71，赖氨酸72和Lys73位于Ser的羧基区67(6,7). 同样，Ser67前面有两个疏水残基，Leu64和Ala65.序列号67具有磷酸化后成为PP1活性位点抑制剂的所有结构要求。
含有I-1残基9–54的蛋白水解片段抑制PP1(18). 据推测，抑制区位于I-1氨基末端残基9–54内(18). 使用合成肽的研究已经确定，在I-1氨基末端区域中有两个PP1相互作用域(7,19–21). 第一个结构域由8–12个残基组成，在许多PP1结合蛋白中发现RKIQF序列(三)在远离催化中心的地点与PP1结合(22). 第二个结构域，Thr35结构域，在Thr磷酸化时占据PP1催化中心35并阻止基底结合(17). 这两个结构域都被认为是PP1抑制的关键和协同作用(7,19–21).
我们不知道Ser抑制PP1的机制67-磷酸化I-1。然而，如上所述，氨基酸序列(7)建议Ser67-磷酸化Ser67结构域可以作为PP1活性位点抑制剂。因此，Thr抑制PP1的机制35域和由Ser67域可能类似。如果是这样，就像Thr一样35领域(7,19–21)，Ser67域可能还需要8RKIQF公司12PP1抑制域。
I-1被许多提升cAMP的细胞事件激活(4,23–25)，活化被认为是通过A激酶I-1磷酸化(1–4,6,7). 在这项研究中，我们发现NCLK磷酸化也激活I-1。因此，激活NCLK的细胞内事件也将激活I-1。因此，激酶不是唯一的I-1调节器。最近的研究表明，除了A激酶外，还有细胞内的cAMP受体，这些受体调节细胞对cAMP的反应(26,27). NCLK是否参与这些激活I-1的事件将是一个有趣的问题。毕竟，NCLK的催化cdk5亚单位在各种组织和细胞系中广泛表达(28–30).
致谢
我们衷心感谢杜克大学的谢里什·谢诺利卡尔博士提供了I-1和I-1（T35A）cDNA克隆，纽约医学院的欧内斯特·Y·C·李博士赠送了纯化的重组PP1α，帕特里克·W·卡弗蒂帮助撰写了这份手稿。这项工作得到了加拿大医学研究委员会和美国卫生援助基金会（美国）的资助。H.K.P.是麦吉尔大学Fraser Monat and McPherson奖学金的获得者。
缩写
| 一种激酶 | cAMP依赖性蛋白激酶 |
| 消费税 | 谷胱甘肽S公司-转移酶 |
| 识别1 | 抑制剂1 |
| MAP激酶 | 丝裂原活化蛋白激酶 |
| NCLK公司 | 神经元cdc2样蛋白激酶 |
| PP1项目 | 蛋白磷酸酶1 |
脚注
本文直接（第二轨道）提交给PNAS办公室。
印刷前在线发表的文章：Proc。国家。阿卡德。科学。美国，10.1073/pnas.100460897。
文章和出版日期见www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.100460897
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