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分子细胞。作者手稿；可在PMC 2008年1月12日获得。
以最终编辑形式发布为：
分子细胞。2007年1月12日；25(1): 57–70.
数字对象标识：2016年10月10日/j.molcel.2006.11.022
预防性维修识别码：项目经理1850387
美国国立卫生研究院：美国国立卫生研究院16254
PMID：17218271

平行SUMOylation依赖性途径介导LXRs和PPARγ的基因和信号特异性转阻遏

塞雷娜·吉莱斯蒂,1 温迪黄,1,2 小川住友,1,7 加布里埃尔·帕斯科尔,1 穆恩林,2 蒂莫西·威尔逊,5 迈克尔·罗森菲尔德,三，4和克里斯托弗·K·格拉斯1,三，6
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补充资料

总结

转阻遏被广泛用于负性调节基因表达，但不同核受体影响基因和信号特异性转阻抑程序的机制尚不清楚。在这里，我们报告了选择性SUMOylation依赖机制的鉴定，该机制使PPARγ和LXRs负调控重叠但不同的促炎症基因亚群。SUMO2/3与LXR或SUMO-1与PPARγ的配体依赖性结合将其靶向TLR靶基因的启动子，从而阻止转录激活所需的NCoR辅抑制复合物的信号依赖性移除。SUMO-1-PPARγ和SUMO-2/3-LXRs抑制不同的NCoR清除机制，允许启动子和TLR-特异性抑制模式。对天然存在的氧甾醇配体的突变分析和研究表明，LXR的反式激活和SUMOylation依赖的反式阻遏活性可以独立调节。这些研究定义了平行但功能不同的途径，PPARγ和LXR利用这些途径来差异调节控制免疫和稳态的复杂基因表达程序。

简介

配体依赖性转录因子的核受体家族成员通过积极和消极调节不同细胞类型（包括巨噬细胞、淋巴细胞和树突状细胞）的基因表达来影响免疫反应(格拉斯和小川，2006年;Winoto和Littman，2002年). 最近对糖皮质激素受体（GR）、肝脏X受体（LXRs）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）、维甲酸受体（RAR）和雌激素受体（ER）的研究表明，每个核受体都抑制信号依赖性炎症基因表达的重叠但不同的模式(Galon等人，2002年;Joseph等人，2003年;小川等人，2005年;Welch等人，2003年). 虽然这些观察结果与特定配体在生物水平上对炎症过程的重叠但不同的作用相一致，但用于实现这种特异性的分子机制仍不清楚。

LXRα和β是核受体超家族的成员，在胆固醇和脂肪酸稳态中发挥重要作用(Janowski等人，1996年;Peet等人，1998年;Schultz等人，2000年). LXR是外周细胞正常胆固醇流出和肝脏通过积极调节胆固醇流出相关基因表达而排出胆固醇所必需的(Costet等人，2000年;Repa等人，2000年)和胆汁酸生物合成和转运相关基因(Chiang等人，2001年;刘易斯和雷德，2005年). LXR的转录活性被认为在体内受到胆固醇氧化衍生物氧甾醇的调节(Janowski等人，1999年;Janowski等人，1996年).

最近的研究表明，LXR是巨噬细胞天然免疫和炎症信号的调节器(Zelcer和Tontonoz，2006年). LXR激动剂可提高细菌感染期间巨噬细胞的存活率，LXR是正常免疫所必需的单核细胞增生李斯特菌(Castrillo等人，2003年;Joseph等人，2004年;Joseph等人，2003年;Valledor等人，2004年). 此外，LXR激活抑制脂多糖（LPS）对许多促炎基因的诱导，如诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、细胞因子如白细胞介素-1β（IL-1β）和趋化因子如单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）(Joseph等人，2003年). LXR激动剂对炎症介质的抑制在缺乏LXR的巨噬细胞中被消除，但在含有LXRα或LXRβ的巨噬细胞中没有，表明这两种亚型都可以介导抗炎活性(Joseph等人，2003年). LXR抑制炎症反应基因的分子机制尚待确定。

PPARγ，脂肪细胞发育和正常葡萄糖稳态所需的核受体(Spiegelman，1998年;Willson等人，2001年)，在巨噬细胞和其他细胞类型中也发挥广泛的抗炎作用(Delerive等人，1999年;格拉斯和小川，2006年;Jiang等人，1998年;Ricote等人，1998年)该活性与合成PPARγ激动剂的胰岛素敏感性和抗动脉粥样硬化活性相关(哈夫纳等人，2002年;Li等人，2000年;Staels and Fruchart，2005年). 最近对PPARγ通过LPS抑制iNOS基因激活的机制的研究导致了SUMOylation依赖性反抑制途径的鉴定(Pascual等人，2005年). 在此途径中，合成的PPARγ激动剂促进SUMO-1与PPARγ配体结合域的PIAS1依赖性偶联。这反过来针对PPARγ至NCoR共升压复合物，这些复合物在基础条件下通常与iNOS启动子结合，并需要在没有炎症刺激的情况下介导活性抑制。研究发现，SUMO1-PPARγ的募集可以阻止信号依赖性泛素化和NCoR复合物的清除，从而使iNOS基因保持在抑制状态(Pascual等人，2005年). 这些发现提出了一系列问题，包括该途径是否被其他核受体使用，是否可以用基因或信号特异的方式介导抑制，以及天然配体是否可以促进同源核受体进入该途径。

在这里，我们证明炎症靶基因的LXR转阻遏也利用SUMO化和NCoR依赖性途径，表明该机制代表了一种通过调节代谢和免疫的核受体亚群进行转阻抑的一般分子策略。然而，与PPARγ相反，LXR被SUMO2和SUMO3而不是SUMO1 SUMO化，HDAC4而不是PIAS1作为所需的SUMO E3连接酶发挥作用。因此，PPARγ和LXR的反式阻遏可以以信号和基因特异的方式独立调节。

结果

LXR依赖性转运抑制需要NCoR

基于NCoR对PPARγ转阻遏的要求，我们首先试图确定LXR介导的抑制是否也是NCoR依赖性。实验在转染对照非特异性或NCoR-特异性siRNA的原代巨噬细胞中进行(图S1A)使用GW3965作为LXR特异性激动剂。NCoR表达减少显著逆转LPS诱导的LXR配体依赖性iNOS表达抑制(图1A). 为了证实这一结果，在RAW264.7巨噬细胞中评估iNOS启动子活性。如所示图1B敲除NCoR可逆转LPS诱导的iNOS启动子活性的LXRα和LXRβ依赖性反式阻遏。为了确定LXR是否被招募到iNOS启动子中并阻止NCoR清除，进行了染色质免疫沉淀（ChIP）实验，以检查LPS刺激的原代巨噬细胞中iNOS激活子上LXR和NCoR的占有率。无论是否存在LPS，LXR都以配体依赖的方式被招募到iNOS启动子中，并且这种招募是NCoR依赖性的(图1C). 在双LXRα/LXRβ敲除巨噬细胞中未检测到LXR，表明LXR抗体特异性检测到与iNOS启动子结合的LXRβ。正如预期的那样，NCoR被发现在基础条件下占据iNOS启动子，并被LPS排除(Pascual等人，2005年)而GW3965治疗阻止了NCoR清除（图1D）。这些结果表明，除了PPARγ外，LXRα和LXRβ通过阻止NCoR的清除来抑制iNOS基因的LPS诱导。

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LXR转阻遏需要NCoR

NCoR特异性siRNA消除LPS诱导的原代巨噬细胞内源性iNOS基因表达的LXR依赖性抑制（A）和RAW264.7细胞iNOS-核糖核酸酶报告基因活性（B）。siRNA转染后，在不存在或存在LXR配体（GW3965，1μM）的情况下，用LPS（1μg/ml）刺激巨噬细胞6h。通过QPCR评估腹腔巨噬细胞iNOS的表达，通过荧光素酶分析评估RAW264.7细胞iNOS启动子的激活*与LPS+对照siRNA相比p<0.03**p<0.02 vs GW3965+LPS控制siRNA。C.ChIP分析显示iNOS启动子的配体依赖性和NCoR依赖性LXR募集。用LPS（1μg/ml）和LXR配体（GW3965，1μM）处理初级巨噬细胞1h。用抗LXR（α和α亚型）抗体或对照IgG进行ChIP分析。用iNOS特异性引物通过QPCR分析免疫沉淀DNA。从LXR分离的染色质−/−小鼠被用作LXR抗体特异性的阴性对照。*与未经治疗或单独使用LPS相比，p<0.05**p<0.03 vs GW3965或GW3965+LPS控制siRNA。D.LXR配体抑制LPS刺激的NCoR从iNOS启动子释放，如在腹腔巨噬细胞中的ChIP试验所示，如C组所述。*p<0.02 vs未治疗**与LPS相比p<0.02。结果表示为三个独立实验的平均值。误差线表示标准偏差。

LXR依赖的反式阻遏是SUMO依赖的

LXR反阻遏被鉴定为NCoR依赖性，这提出了是否也涉及SUMOylation依赖性途径的问题。SUMO与靶蛋白的连接需要E2-结合酶Ubc9(Hay，2005年). 因此，我们使用一种特殊的siRNA来抑制Ubc9的表达(图S1B)初级巨噬细胞中(图2A)和RAW264.7细胞(图2B)转染LXRα和LXRβ表达质粒。敲除Ubc9显著削弱LPS诱导iNOS表达的LXR配体依赖性抑制(图2A)和iNOS启动子激活(图2B). 接下来在原代巨噬细胞中进行ChIP分析，以确定SUMO化在LXRα和LXRβ向iNOS启动子的配体依赖性募集以及在预防NCoR清除中的作用。敲低Ubc9表达阻止LXR向iNOS启动子的配体依赖性募集(图2C)并削弱iNOS启动子NCoR清除的阻滞(图2D). 这些结果表明，SUMOylation依赖性步骤对LXR向iNOS启动子募集以防止共升压因子清除至关重要。

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LXR依赖性反式阻遏依赖于SUMO酸化

Ubc9特异性siRNA逆转LPS诱导的初级巨噬细胞iNOS表达的LXR依赖性抑制（A）和RAW264.7细胞iNOS启动子激活（B）。siRNA转染后，在没有或存在LXR配体（GW3965，1μM）的情况下，用LPS（1μg/ml）刺激巨噬细胞6小时。通过QPCR评估腹腔巨噬细胞iNOS的表达，通过荧光素酶分析评估RAW264.7中iNOS启动子的激活。*与LPS对照siRNA相比p<0.03**p<0.02 vs GW3965+LPS控制siRNA。针对Ubc9的siRNA阻止LXR募集（C），并消除LXR激动剂抑制iNOS启动子NCoR清除（D）的能力，如ChIP所示。用LPS（1μg/ml）和LXR配体（GW3965，1μM）处理初级巨噬细胞1h。用抗LXR或NCoR抗体或对照IgG进行ChIP分析。使用iNOS启动子特异性引物通过实时PCR分析免疫沉淀的DNA。（C） *与未治疗+对照siRNA相比，p<0.01**p<0.02 vs GW3965对照siRNA。（D）*p<0.03 vs未治疗+对照siRNA**p<0.02 vs LPS对照siRNA，***p<0.01 vs GW3965+LPS对照siRNA。结果表示为2个独立实验的平均值。误差线表示标准偏差。

LXR被依赖HDAC4 E3连接酶活性的SUMO-2/3修饰

由于LXR反阻遏需要SUMOylation依赖性步骤，我们测试了LXR本身是否是SUMOylization的靶点。在存在或不存在Myc-tagged SUMO-1、SUMO-2或SUMO-3的HeLa细胞中表达FLAG-tagged LXRβ。在存在SUMO-2和SUMO-3的情况下检测到高分子量LXRβ，单SUMO酰化的预期尺寸增加，但在存在SUMO-1的情况下未检测到(图3A)以配体依赖的方式。这种高分子量物种被抗Myc抗体检测到，并通过敲除Ubc9而被消除(图3B)，表明它对应于SUMOylated LXRβ。LXRα也被SUMO-2和SUMO-3磺胺酰化（数据未显示）。中用星号表示的附加LXR相关带图3在一些实验中也观察到。该条带可能代表LXR的未知翻译后修饰，与SUMO化无关。

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LXRβ被SUMO-2和SUMO-3修饰

A.LXRβ被SUMO-2和SUMO-3 SUMO化。用FLAG-LXRβ、Ubc9和SUMO-1、SUMO-2或SUMO-3表达载体（如图所示）转染HeLa细胞，并用GW3965处理1h（1μM）。对全细胞裂解物进行FLAG-tag免疫印迹。B.特定siRNA敲除Ubc9阻断LXRβ的SUMO-2结合。用siControl、siUbc9（如有指示）、FLAG-LXRβ和MYC-SUMO-2表达载体转染HeLa细胞。用FLAG抗体免疫沉淀裂解的全细胞，并对FLAG-tag和SUMO2-MYC-tag进行免疫印迹。C.针对HDAC4的siRNA阻断LXRβSUMO化。用siControl、siHDAC4（如有指示）、FLAG-LXRβ和SUMO-2表达载体转染HeLa细胞，并用GW3965处理1h（1μM）。对全细胞裂解物进行FLAG-tag免疫印迹。D.LXRβ和HDAC4在物理上相互作用。用FLAG-LXRβ和Ha-HDAC4转染HeLa细胞，并用GW3965处理1h，如图所示。用HA抗体免疫沉淀全细胞裂解液（中板），用FLAG抗体检测LXRβ（上板）。在下部面板中，INPUT显示每个样本中LXRβ的相等表达。仅转染LXRβ或HDAC4（第一条和最后一条通道）的细胞作为IP的阴性对照。E.LXRβ在体外被HDAC4磺胺酰化。按照实验程序中的描述进行体外SUMO酸化试验，添加到反应HDAC4或HDAC4突变体（67-257）中，如图所示。对这些蛋白进行HA-tag免疫印迹。F.HDAC4在体内调节LXRβSUMO化。用FLAG-LXRβ、Ubc9、SUMO-2和HDAC4或HDAC4突变体（67-257）表达载体（如图所示）转染HeLa细胞，并用GW3965处理1h（1μM）。对全细胞裂解物进行FLAG-tag免疫印迹。G.HDAC4的敲除阻断MCP1的LXR反式抑制。用对照组或HDAC4特异性siRNA转染原代巨噬细胞48小时，然后在没有或存在LXR配体（GW3965，1μM）的情况下用LPS（1μg/ml）刺激6小时。实时PCR检测MCP1的表达。结果表示为两个独立实验的平均值。误差线代表标准偏差。*p<0.02 vs LPS+对照siRNA**p<0.03 vs GW3965+LPS+对照siRNA。

已经确定了几个SUMO E3连接酶，它们促进SUMO从E2转移到特定底物。迄今为止，三种类型的SUMO E3连接酶已被很好地表征：激活信号转导和转录激活子（PIAS）家族的蛋白抑制剂、RanBP2/Nup358蛋白和人类Polycomb成员Pc2(Melchior等人，2003年). 尽管SUMO-PPARγ介导的转阻遏依赖于PIAS1(Pascual等人，2005年)所有PIAS E3连接酶、RanBP2/Nup358和PC2的系统性敲除并没有逆转初级巨噬细胞中LXR配体依赖性抑制（数据未显示）。最近，HDAC4和II类脱乙酰酶的相关成员，如HDAC5，被描述为MEF2转录因子的SUMO E3连接酶(Gregoire和Yang，2005年;Zhao等人，2005年). 敲除HDAC4表达(图S1C)导致LXRβSUMO化的完全抑制(图3C). 与这些发现一致，联合免疫沉淀分析揭示了LXRβ和HDAC4之间的物理相互作用(图3D). 为了确定HDAC4是否直接促进LXRs SUMOyation，我们进行了体外SUMOyating分析。在配体存在的情况下，通过添加体外翻译的HDAC4蛋白，配体依赖性LXRβSUMO化显著增加(图3E)，但不在缺少配体的情况下（数据未显示）。相反，HDAC4突变体（67-257）没有与Ubc9相互作用所需的线圈结构域(Zhao等人，2005年)，废除LXRβSUMO化。在过表达WT HDAC4或HDAC4突变体（67-257）的HeLa细胞中也观察到类似的作用(图3F). 这些结果一致表明，HDAC4在体内作为LXR的SUMO E3连接酶发挥作用。

接下来，我们评估了在原代巨噬细胞中LXRs介导的转阻遏是否需要HDAC4。出乎意料的是，HDAC4的敲除阻止了iNOS的LPS激活，从而无法评估其在该特定靶点反抑制中的作用（数据未显示）。最近的几份报告表明，HDAC抑制剂阻断了IRF对炎症反应基因的激活(Chang等人，2004年;Nusinzon和Horvath，2003年;Sakamoto等人，2004年). 由于iNOS基因也是这些因素的靶点，我们推测HDAC4是激活这组基因所需的关键HDAC之一。

为了鉴定适用于确定HDAC4在LXR依赖性转运抑制中的作用的替代LPS靶基因，进行了微阵列实验，以鉴定在HDAC抑制剂TSA存在下保留LPS诱导的LXR敏感靶基因(表S1). MCP-1被选为符合这些标准的最具代表性的趋化因子基因之一。为了确定MCP-1基因是否是一个合适的模型，我们在原代巨噬细胞中进行了转阻遏实验，并证实MCP-1转阻拦是NCoR和Ubc9依赖性的(图S2). ChIP分析证实，LXR以NCoR和Ubc9依赖性的方式被招募到MCP-1启动子并阻止NCoR清除(图S3A和B). HDAC4的拆除(图S1C)正如微阵列数据预测的那样，对MCP-1的诱导没有影响，但逆转了LXR反阻遏(图3G). 综上所述，这些结果表明HDAC4与LXR相互作用，并通过促进其SUMO化来调节LXR反阻遏活性。此外，这些发现表明，尽管LXR和PPARγ反式阻遏都是SUMOylation依赖性的，但在体内，LXR通过SUMO-2和SUMO-3以配体依赖性的方式进行SUMOylated，而PPARγ通过SUMO-1修饰(Floyd和Stephens，2004年;Ohshima等人，2004年;Pascual等人，2005年;Yamashita等人，2004年).

LXR SUMO受体位点突变可消除反式阻遏而非反式激活活性

人类LXRβ一级氨基酸序列中的两个赖氨酸残基，即N末端Lys-31和C末端Lys-448，很可能符合SUMO结合的一致模体。此外，在Lys-410处发现了一个概率较低的位点。为了确定这些赖氨酸残基是否是SUMO化的靶点，生成了K31、K410和K448的赖氨酸到精氨酸替换的突变体，并对其进行了SUMO酸化分析。当用突变体K410和K448转染细胞时，LXRβ的SUMO化减少，而用K410/448双突变完全消除，而K31突变没有影响(图4A).

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LXRβSUMO受体位点突变可消除反式阻遏，但不能消除反式激活活性

A.LXRβ的SUMO化在K410和K448处发生，但在K31处不发生，如SUMO酸化试验所示（按照图3A)在转染WT FLAG-LXRβ或FLAG突变体K31、K410、K448或双突变体K410/K448的HeLa细胞中，如图所示。B、 C.转阻遏需要LXRβK410和K448，而非激活。用iNOS-luc（B）或ABCA1-luc（C）报告质粒和LXRβ野生型表达载体转染RAW264.7细胞，或如图所示在K31、K410、K448或K410/K448中突变。转染24小时后，在没有（黑条）或存在LXR配体（GW3965，1μM，灰色条）的情况下，用DMSO（白色条）或LPS（1μg/ml）处理细胞12小时。结果表示为三个独立实验的平均值。误差线表示标准偏差。（B） *p<0.01 vs LPS**与GW3965+LPS+LXRβ野生型相比，p<0.05。（C） *p<0.03 vs pCMX。

为了确定LXR SUMO化的功能意义，在RAW264.7细胞中测试了LXRβ突变体反式抑制iNOS启动子和反式抑制ABCA1启动子的能力。K410和K448的个体突变部分损害了反式阻遏活性，而K410/448双突变完全消除了反式抑制(图4B). MCP1启动子也观察到类似的结果(图S3C). 相反，这些相同的赖氨酸突变并没有损害ABCA1启动子的配体依赖性反式激活。LXRα的平行研究表明赖氨酸残基328和434（对应于LXRβ的残基448）的配体依赖性SUMO化。这些残基突变为精氨酸会削弱LXRα的反式阻遏作用，但不会激活（数据未显示）。总之，这些实验表明，LXRα和LXRβ配体结合结构域中的特定赖氨酸残基被SUMO-2和SUMO-3 SUMO化，并且它们的SUMO化是反式抑制所必需的。

内源性LXRs配体促进进入反阻遏途径

许多天然存在的氧甾醇是LXR的有效转录激活剂(Janowski等人，1999年;Janowski等人，1996年). 在巨噬细胞中，内源性氧甾醇被认为与细胞内胆固醇水平成比例地产生，并诱导一些参与LXR依赖性胆固醇流出的基因的表达，如ABCA1(Repa等人，2000年). 为了研究天然LXR配体正向和负向调节基因表达的相对能力，评估了它们对原代巨噬细胞ABCA1基因表达和内源性iNOS基因LPS依赖性诱导的影响。这些实验表明，22（R）-羟基胆固醇（22R）、24（S）、25环氧胆固醇（EC）和24-羟基胆固醇均抑制iNOS激活并诱导ABCA1表达。这种抗炎作用依赖于LXR，因为在LXR中没有观察到−/−巨噬细胞(图5B). 相反，25羟基胆固醇（25HC）和27羟基胆固醇（27HC）能够激活ABCA1，但即使在显著高于ABCA1基因激活水平的浓度下也不能抑制iNOS的激活(图5C)表明活化和反抑制活性可以通过化学方法分离。此外，22（R）-羟基胆固醇（22R）、24（S）、25环氧胆固醇（EC）和24羟基胆固醇（24HC）的反抑制活性因敲除Ubc9而受损，这表明LXR天然存在的一部分氧甾醇配体可以促进其进入SUMOylation依赖性反抑制途径。

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内源性LXRs配体促进进入转运抑制途径

A、 B.天然LXRs配体诱导ABCA1表达并抑制iNOS激活。WT（图A和B，灰色条）和LXR的原代巨噬细胞−/−用GW3965（1μM）或5μM氧甾醇22R、22S、24（S）、25EC、24HC、25HC和27HC（A）处理小鼠（B组，黑色条）18小时。在B板细胞中，用指示的配体预处理细胞，然后用LPS（1μg/ml）处理6h。通过QPCR评估ABCA1（A）和iNOS（B）的表达。（A） *与未治疗组相比p<0.03；（B） *p<0.01 vs LPS。C.25HC和27HC的剂量反应实验。用GW3965（1μM）、25HC和27HC以增加的浓度（1μM、5μM、10μM、50μM）预处理初级巨噬细胞，然后用LPS（1μg/ml）处理6h。通过QPCR评估iNOS的表达。*与LPS相比，p<0.01。D.天然LXRs配体需要Ubc9转抑制iNOS表达。用Ubc9 siRNA（黑条）或非特异性siRNA（白条）转染原代巨噬细胞48小时，然后在不存在或存在LXR配体的情况下用LPS（1μg/ml）刺激6小时（5μM）。通过QPCR评估腹腔巨噬细胞iNOS的表达。*与对照siRNA相比p<0.05。结果表示为两个独立实验的平均值。误差线表示标准偏差。

LXRs和PPARγ对平行NCoR和SUMOylation依赖途径的基因特异性利用

研究发现，LXR利用SUMO酸化/NCoR依赖性途径与最初确定的通过PPARγ介导炎症反应反抑制的途径平行，来抑制iNOS的激活，这一发现引发了以下问题：这些平行途径在多大程度上被用来抑制其他LPS靶基因，以及它们是否可以被利用以基因特定的方式。先前的表达谱研究表明，PPARγ和LXR激动剂抑制LPS或TLR3-激活剂poly I:C在原代巨噬细胞中诱导的重叠但不同的基因集(小川等人，2005年)（完整的数据集可在网址：www.lipidmaps.org). 这些关系如所示图6A筛选出每种TLR激动剂至少5倍诱导的基因，并在没有PPARγ或LXR激动剂的情况下显示出至少50%的激活抑制。我们最初评估了一些内源性LPS诱导的靶基因，这些靶基因被原代巨噬细胞中的两个核受体所转染。大多数符合这些标准的LPS诱导基因，如MIP-1β、MCP-1、VCAM-1和IL-15，都被PPARγ和LXR通过NCoR和SUMOylation依赖性机制转抑制(图S2). 这些发现表明，NCoR和SUMOylation依赖性途径可能被LXRs和PPARγ广泛用于反抑制促炎症靶基因。

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NCoR和SUMOylation依赖途径在LXR和PPARγ反抑制中的基因特异性利用

A.通过表达谱分析确定受LPS或poly I:C刺激的初级巨噬细胞中LXR或PPARγ激动剂反式阻遏的基因之间的关系。根据LPS和poly I:C至少5倍的诱导以及每个PPARγ或LXR激动剂至少50%的抑制筛选基因。数据来源于(小川等人，2005年). B.IL1β和TNFα的受体特异性抑制。用siRNA对照或NCoR特异性siRNA转染原代巨噬细胞48小时，然后在没有或存在LXR配体（GW3965，1γM）或PPARγ配体（罗格列酮，1μM）的情况下用LPS（1μg/ml）刺激6小时。通过QPCR评估IL1β和TNFα的表达。*与LPS相比p<0.01；**与GW3965（左面板）或Rosi（右面板）+LPS控制siRNA.C相比，p<0.01。PPARγ和LXR配体对IL1β和TNFα启动子NCoR清除的差异抑制。用LPS（1μg/ml）加或不加PPARγ（罗格列酮，1μM）或LXR配体（GW3965，1μM）处理原代巨噬细胞1h。使用抗NCoR和/或对照IgG抗体进行ChIP分析。*与未治疗组相比p<0.01；**与LPS相比p<0.08。D.PPARγ转阻遏依赖于TAB2。用siRNA对照或TAB2特异性siRNA转染原代巨噬细胞48小时，然后在没有或存在LXR配体（GW3965，1μM）或PPARγ配体（罗格列酮，1μM）的情况下用LPS（1μg/ml）刺激6小时。iNOS表达通过QPCR进行评估。*与LPS相比p<0.01；**与Rosi+LPS控制siRNA相比，p<0.01。E.Tab2在iNOS启动子上以基础状态存在，但在IL1β启动子上不存在。使用Tab2抗体或对照IgG进行ChIP分析。*与对照IgG相比，p<0.01。结果表示为两个独立实验的平均值。误差条表示标准偏差。

接下来，我们评估了仅由LXR激动剂转抑制的LPS诱导基因亚群（如图6BIL1β）或仅PPARγ激动剂（表示为图6BTNFα）。出乎意料的是，尽管LXRs和PPARγ配体对IL1β和TNFα有不同的反抑制作用，但这两种情况都涉及NCoR依赖的反抑制机制(图6B). ChIP实验证实了这一结果，表明LXR激动剂而不是PPARγ激动剂能够抑制NCoR从IL1β启动子中的清除(图6C，左侧面板）。相反，在LXR激动剂存在的情况下，NCoR从TNFα启动子中清除，但在PPARγ激动剂治疗后没有清除(图6C，右侧面板）。因此，我们在原代巨噬细胞中进行了ChIP实验，以确定SUMO化受体是否被不同地招募到这些启动子中。这些分析表明，PPARγ和LXR均以配体依赖的方式被招募到iNOS、IL1β和TNFα启动子中(图S4A)表明SUMOylated受体正在中断负责NCoR清除的不同信号输入。观察到饱和浓度的PPARγ和LXRs激动剂对iNOS启动子具有加性抑制作用，iNOS对这两种受体的反式阻遏敏感，这一发现得到了支持，表明它们通过独立的机制发挥作用(图S4 B).

为了探讨特定信号适配器蛋白在LPS激活和反抑制中的作用，我们研究了Tab2，它在TLR4依赖的信号转导中起细胞质作用，也是NCoR复合物子集的组成部分(Baek等人，2002年;Jiang等人，2004年;Takaesu等人，2000年;Zhu等人，2006年). 巨噬细胞中Tab2的敲除(图S1D)减少iNOS对LPS的折叠激活约50%。有趣的是，iNOS的剩余激活仍然对LXRs激动剂的抑制完全敏感，但现在对PPARγ激动剂的阻遏完全抵抗(图6D). 此外，ChIP实验表明，在基础条件下，Tab2存在于iNOS启动子上，在LPS处理时被清除，但在LPS和PPARγ激动剂存在时被保留。相反，在任何条件下，IL1β启动子上的Tab2均未富集到背景（IgG对照）水平以上。总之，这些结果与Tab2在介导PPARγ依赖性而非LXR依赖性的反抑制中发挥启动子特异性作用一致。

LXRs和PPARγ对平行NCoR和SUMOylation依赖通路的信号特异性利用

最近的研究表明，特定核受体抑制炎症反应基因特定亚群的能力可以以信号特异的方式进行调节，例如，当LPS诱导时，对GR介导的抑制敏感的一组基因，当被poly I:C激活时，是GR耐药的(小川等人，2005年). 在LXR和PPARγ激动剂的反式阻遏基因中观察到类似的关系，如图7A为了研究LXRs和PPARγ表现出信号特异性抑制的基因是否利用NCoR依赖机制，我们评估了IL1β基因。当该基因被LPS激活时，LXR激动剂以NCoR依赖性的方式强烈抑制该基因，而当被poly I:C激活时，该基因几乎完全耐药(图7B). 作为第二个例子，我们评估了TLR1/2激动剂Pam3CSK激活iNOS基因时的抑制作用(Omueti等人，2005年).

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NCoR和SUMOylation依赖性反抑制的信号特异性调节

A.PPARγ和LXR激动剂抑制的信号依赖性。当LPS或poly I:C诱导时，每个图中中央部分的基因受到抑制。左侧部分的基因仅在LPS诱导时受到抑制，而右侧部分的基因只有在poly I:C诱导时才受到抑制，但仅在LPS诱导时对LXR阻遏敏感。用TLR4特异性激动剂（LPS，1μg/ml）或TLR3特异性激动药（polyI:C，50 ng/ml）处理原代巨噬细胞6h，加或不加PPARγ（罗格列酮，1μM）或LXR配体（GW3965，1μM）。通过QPCR评估IL-1β的表达。*与LPS相比p<0.02。C.LXR和PPARγ配体对iNOS基因的差异反式阻遏。原代巨噬细胞用LPS（1μg/ml）、TLR2特异性激动剂（PAM3，300 ng/ml）或poly I:C（50 ng/ml）处理6h，无论是否加PPARγ（罗格列酮，1μM）或LXR配体（GW3965，1μM）。iNOS表达通过实时PCR进行评估。*p<0.02 vs LPS（左）、Pam 3（中）、poly I:C（右）。结果表示为两次独立实验的平均值。误差线表示标准偏差。D.描述PPARγ和LXR使用的平行反式阻遏途径的模型。参见文本进行讨论。

虽然LXR和PPARγ激动剂在LPS诱导下都被抑制，但当TLR1/2激动剂刺激巨噬细胞时，LXR激动剂对iNOS的反抑制能力被选择性地消除(图7C). 因此，我们评估了LXR激动剂反抑制炎症反应的能力是否与其阻断不同TLR激动剂诱导的NCoR清除的能力相关。ChIP实验表明，LXR激动剂在LPS处理下抑制iNOS启动子的NCoR清除，但在TLR1/2激动剂Pam3CSK处理细胞时未能抑制NCoR的清除(图S5A). 此外，研究发现，即使用LXRs配体处理细胞，poly I:C也能促进NCoR从IL1β启动子中的清除，这与GW3965对该信号的反式抑制IL1β激活的失败一致(图S5B). 这些结果一致表明，平行的SUMOylation依赖性反式阻遏途径本身受到调控，并且可以通过基因特异性方式被特定信号所覆盖。

讨论

一种通用的SUMO/NCoR反阻遏机制

许多核受体可以反式作用抑制炎症反应，最近的研究表明，炎症靶基因的配体依赖性抑制以基因和信号特异的方式发生(Ogawa等人，2005年). 虽然从人工和瞬时转染靶基因的分析中提出了大量的反抑制机制，但在原代细胞中建立内源性靶基因的机制相对较少。目前的研究表明，LXRs对原代巨噬细胞中许多内源性炎症反应基因的配体依赖性转运抑制是NCoR-和SUMO-依赖性的。此外，ChIP分析显示，LXR以SUMOylation依赖性的方式被招募到iNOS启动子，并抑制LPS诱导的共升压因子清除。这些观察延伸了最初确定为PPARγ的NCoR和SUMOylation依赖途径(Pascual等人，2005年)核受体家族的另外两个成员，LXRα和LXRβ。因此，将核受体依赖SUMO酰化靶向辅升压复合物以防止其信号依赖性清除可能代表了一种普遍的分子策略，即转抑制促炎症靶基因，扩展先前描述的SUMO蛋白负调控基因表达的机制(吉尔，2005).

平行SUMO依赖性反阻遏途径

尽管这些研究表明，LXRs和PPARγ均利用SUMOylation依赖机制，该机制收敛于NCoR辅阻遏物复合物，但它们也为以受体特异性和基因特异性方式使用的不同和平行通路提供了证据(图7). 这些结论是基于PPARγ和LXR通过不同的E3连接酶与不同的SUMO蛋白结合，并对IL1β和TNFα等促炎靶基因进行差异调节的结果。而PIAS1被描述为参与PPARγSUMO化的E3连接酶(Ohshima等人，2004年;Pascual等人，2005年)目前的研究强烈表明，LXR的SUMO化需要HDAC4 E3连接酶活性。在PPARγ的情况下，作为SUMO1结合点的赖氨酸残基位置的配体诱导变构变化被认为是配体依赖SUMO化的基础(Pascual等人，2005年). 就LXR而言，载脂蛋白受体的晶体结构不可用，因此尚不可能评估代表基本SUMO受体位点的赖氨酸残基中的配体依赖性变化。然而，LXRβ与HDAC4的结合似乎并不依赖于配体，这表明配体改变了作为SUMO受体位点的赖氨酸残基的特定构型，从而提供了配体依赖的机制。

由于SUMO-2和SUMO-3的共轭形式形成了一个独特的亚家族，并且在序列上仅与SUMO-1相同50%(Hay，2005年)，我们认为LXRs和PPARγ是根据其差异SUMO化而进行功能分化的，并且代表了不同的平行反式阻遏途径，可以以基因和信号特异的方式利用(图7D). 这些平行通路的基因特异性利用表现为LXR对IL1β的选择性反抑制和PPARγ对TNFα的选择性反阻遏，而信号特异性利用则表现为IL1β和iNOS基因在被TLR1/2、TLR3和TLR4激动剂激活时对LXR配体的不同敏感性。

因此，这些发现为NCoR复合体中SUMO化PPARγ和LXR的分子靶点以及这些蛋白的对接如何阻止NCoR清除提供了许多有趣的可能性。ChIP实验现已将NCoR复合物定位在我们检测的几乎所有LPS应答基因上。此外，SUMOylated PPARγ和LXRs似乎在激活信号之前定位于这些复合物。在所有情况下，一个基因是否对PPARγ或LXR激动剂敏感或耐药与它们是否阻止NCoR清除密切相关。先前的研究表明，NCoR复合物从靶启动子的信号依赖性清除涉及激活作为这些复合物核心成分的Tbl1和TblR1蛋白的泛素E3连接酶活性(Ogawa等人，2004年;Perissi等人，2004年)导致NCoR复合物泛素化所需的Ubc5/19S蛋白体机械的招募及其随后的清除。PPARγ的SUMO化及其与NCoR复合物的相互作用已被证明可以阻断UbcH5向iNOS启动子的信号依赖性募集(Pascual等人，2005年)，但这是由于Tbl1/TblR1磷酸化的抑制，还是由于某些远端步骤，尚待确定。PPARγ而非LXRs对iNOS基因的转阻遏需要Tab2，这一发现表明SUMOylated受体抑制了参与激活Tbl1/TblR1泛素连接酶活性的不同信号输入。生物化学方法最近已将共抑制复合物的成分确定为SUMO2的相互作用靶点(Rosendorff等人，2006年)利用SUMOylated LXRs和PPARγ作为分子探针，进一步阐明以信号特异性的方式从炎症反应基因中清除NCoR辅阻遏物复合物的特定事件，将是很有意义的。

反式激活和反式抑制的协调和独立调节

在巨噬细胞中，LXR通过积极调节胆固醇储存和流出相关基因的表达，在维持正常胆固醇稳态方面发挥关键作用。合成的LXR激动剂也能有效抑制炎症反应基因的观察提出了一个问题，即内源性氧甾醇的产生是否也可能通过与LXR结合而发挥抗炎作用。与这种可能性一致，我们发现22R、24（S）、25EC和24HC均可诱导初级巨噬细胞中ABCA1的表达并抑制iNOS的激活。有趣的是，25HC和27HC可以激活ABCA1，但不抑制iNOS的激活。这些发现表明，LXR的反式激活和反式阻遏活性可能根据不同环境下产生的特定配体而独立调节。有趣的是，在培养的巨噬细胞中未发现任何显著水平的诱导反式阻遏的氧甾醇，而由培养的巨噬细胞产生的高水平氧甾醇也不会诱导反式抑制(Fu等人，2001年). 体内巨噬细胞的特定亚群中可能表达产生激活该途径的天然配体所必需的酶。或者，该途径可能作为旁分泌系统运行，例如，肝脏中的Kuppfer细胞可能暴露于激活反抑制途径的肝细胞衍生的氧甾醇。

许多配体依赖性核受体抑制炎症基因表达的能力，从调节炎症疾病的新方法的发展角度来看，也是相当有趣的。由于强效核受体激动剂与不必要的副作用有关，这一目标常常变得复杂：例如，PPARγ激动剂促进糖尿病患者体重增加和水肿形成(Staels and Fruchart，2005年;Yki-Jarvinen，2005年)虽然LXR激动剂已被证明可引起动物明显的高甘油三酯血症，但至少部分原因是肝脏中SREBP1c的激活(Schultz等人，2000年). 目前的研究表明，有可能开发LXR配体，将反式阻遏与反式激活活动分开。特异性促进LXR进入SUMO依赖性反抑制途径的配体可能在炎症起重要致病作用的疾病中具有治疗作用。

实验程序

试剂和质粒

TLR4激动剂（LPS）、TLR3激动剂（poly I:C）来自Sigma，TLR1/2激动剂（Pam3CysSK4）来自ECM Microcollections，GW3965和罗格列酮由葛兰素史克提供。22（R）-羟基胆固醇、22（S）-羟基胆甾醇、25-羟基胆固醇购自Sigma，24（S）、25-环氧胆固醇和24-羟基胆固醇取自Biomol，27-羟基胆固醇来自Research Plus，Inc.。使用QuickChange侧向突变试剂盒（Stratagene）对Flag-hLXRα和Flag-hLXRβ进行点突变。报告质粒iNOS-luc、Ubc9和SUMO-1表达载体已在前面进行了描述(Pascual等人，2005年)报告质粒ABCA1-luc由B.Wagner博士捐赠，报告质粒MCP1-luc由R.Natarajan博士捐赠，HDAC4突变体（67-257）由T.Yao博士捐赠。

细胞培养和瞬时转染

如前所述制备硫乙醇酸合法巨噬细胞(Pascual等人，2005年)来自LXRαβ+/+和LXRαβ−/−老鼠(Wagner等人，2003年)或C57BL/6小鼠（查尔斯河）。对于初级巨噬细胞的RNAi实验，使用脂质体2000（Invitrogen）将针对NCoR、Ubc9、HDAC4和TAB2的对照或智能池siRNA（100 nM，Dharmacon）转染细胞。培养48小时后将细胞用于实验，并通过QPCR验证靶基因敲除(补充图S1). RAW 264.7瞬时转染iNOS、ABCA1或MCP1启动子，使用Superfect试剂（Qiagen）指导荧光素酶表达。一个β-半乳糖苷酶表达载体被联合转染作为内部对照。对于RAW264.7巨噬细胞中的siRNA实验，使用Superfect试剂将siRNA（40 nM）转染细胞48小时。

ChIP分析

如前所述进行ChIP测定(Pascual等人，2005年). 使用抗LXR（Calbiochem）、抗PPARβ（ActiveMotif）和抗NCoR（亲和生物试剂）抗体。兔免疫前血清用作非特异性结合的对照。实时PCR扩增iNOS、MCP1、IL1β和TNFα近端启动子的150-bp区。可根据要求提供引物序列。

RNA分离和QPCR

从初级巨噬细胞中制备总RNA（通过RNeasy试剂盒Qiagen分离）。1μg总RNA用于cDNA合成，1μl cDNA用于使用炎症基因特异性引物进行实时PCR。可根据要求提供引物序列。PCR（SYBERgreen）分析在Applied Biosystems 7300实时PCR系统上进行。使用GAPDH内容对值进行标准化。

Co-IP分析

用Flag-LXRβ和Ha-HDAC4转染HeLa细胞，并在低盐裂解缓冲液中进行裂解。使用抗Ha珠（Covance）免疫沉淀Ha-HDAC4，使用抗Flag抗体（Sigma）检测Flag-LXRβ。

体外SUMO酸化试验

通过向体外翻译的LXRβ中添加重组SUMO、SAE-1、SAE-2、Ubc9和体外翻译的HDAC4或HDAC4突变体（67-257），在20μl反应缓冲液中进行体外SUMO化反应。反应在37°C下培养60分钟，并添加2mM ATP，通过SDS-PAGE进行分析，并使用抗HA（Covance）抗体进行免疫印迹。

体内SUMO酸化试验

在NEM（N-乙基马来酰亚胺，Calbiochem）存在下，从转染FLAG标记的野生型LXRα和LXRβ或赖氨酸突变体和Myc标记的SUMO-1、SUMO-2或SUMO-3、Ubc9和HDAC4或HDAC4突变体（67-257）表达载体的HeLa细胞制备全蛋白提取物。通过SDS-PAGE解析提取物，并使用抗FLAG（Sigma）或抗Myc（Santa Cruz）抗体进行免疫印迹。

补充材料

补充数字

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补充表1

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致谢

我们感谢B.Wagner（X-ceptor Therapeutics）提供的ABCA1-luc质粒，感谢R.Natarajan（Duarte Hope城）提供的MCP1-luc质粒，感谢T.Yao（Durham杜克大学）提供的HDAC4突变（67-257）质粒，感谢A.Gamliel（圣地亚哥加利福尼亚大学）提供SUMO-2和SUMO-3质粒。我们感谢DERC/BIOGEM核心设施对微阵列实验的帮助，以及A.Howarth对手稿准备的帮助。这些研究得到了美国心脏协会博士后奖学金对S.G的支持，NIH向CKG授予CA52599、HL56989、DK063491和GM 069338。MGR是霍华德·休斯医学研究所的研究员。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将进行编辑、排版和校对。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明都适用。

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