肿瘤坏死因子诱导小鼠肝细胞凋亡中氧化还原平衡的破坏

化学品和试剂

D法案，丁硫氨酸亚砜胺（BSO）、马来酸二乙酯（DEM）、地塞米松和甲萘醌（MEN）通过西格玛化学公司（密苏里州圣路易斯）购买。乙酰-Asp（OMe）-Glu（OMe，OMe）-Val-Asp（OMe）-氨基甲基香豆素（DEVD-AMC）、乙酰-Ilu（OMe，Glu（OMe和α-硫辛酸（α-LA）分别从Bachem（Torrance，CA）或Calbiochem（LA Jolla，CA）中获得。Mitotracker green（MTG）、氯甲基-x-迷迭香胺（CMX）、壬基吖啶橙（NAO）、一氯二甲烷（MCB）和一溴二Mane购自Molecular Probes（Eugene，OR）。重组小鼠TNF购自R&D Systems（明尼阿波利斯，明尼苏达州）。p65抗体（sc-372-G）和caspase-8抗体（Mch 5，sc-6134）购自圣克鲁斯生物技术公司（加州圣克鲁斯），而抗caspase-3抗体({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“C76920”，“term_id”：“2517250”，“term_text”：“C66920”}}C76920号)从Pharmingen（加利福尼亚州圣地亚哥）购买。辣根过氧化物酶偶联抗小鼠二级抗体购自Amersham Pharmacia Biotech（NA 931；Piscataway，NJ），辣根过氧化物蛋白酶偶联抗山羊二级抗体购买自Santa Cruz（sc-2020）。

TNF+Act D诱导细胞凋亡

将AML12细胞进行胰蛋白酶化、电镀，并允许其粘附和生长过夜。在90%至95%的汇合率下，用200 nmol/L（250 ng/ml）Act D或磷酸盐缓冲盐水（PBS）在新鲜培养基中预处理细胞30分钟，然后用20 ng/ml TNF（溶解在含有1.0%牛血清白蛋白的PBS中，V组分，储备浓度为2.0μg/ml）或PBS对照。与90%至95%融合率的培养物相比，以较低密度电镀的细胞处理可导致更快的细胞凋亡动力学。体内如Leist等人所述，诱导肝细胞凋亡。13对于这些实验，C57BL/6小鼠单独或联合接受TNF（3.3μg/kg）或Act D（800μg/kg）。在注射TNF前15分钟注射Act D注射液，并在注射TNF-3至6小时后处死小鼠。收获肝脏，将其固定在10%的福尔马林缓冲液中，进行处理，并用苏木精和伊红染色。从形态学上评估细胞凋亡。

电泳迁移率变化分析（EMSA）

如前所述，对AML12细胞进行裂解并提取细胞核。28简言之，将5μg核蛋白与0.2 ng³²P-末端标记的双链寡核苷酸（来自1类主要组织相容性增强元件H2K的NFκB结合位点），然后通过5%聚丙烯酰胺-三-甘氨酸-乙二胺四乙酸（EDTA）凝胶电泳。凝胶在真空下干燥，并使用增感屏在−80°C下暴露于柯达X-AR胶片（纽约州罗切斯特市伊士曼柯达公司）中过夜。

免疫印迹分析

AML12细胞在PBS中冲洗并在含有50 mmol/L Tris-HCl、pH 7.4、50 mmol/Lβ-甘油磷酸、150 mmol/L-NaCl、2 mmol/L-EDTA、1 mmol/L.Na的1%Triton X-100缓冲液中溶解_三VO（旁白）₄、1 mmol/L苯甲脒、1 mmol/L二硫苏糖醇、10μg/ml亮氨酸肽、10μg/ml胃蛋白酶抑制素A、10μg/ml抑肽酶、0.5 mmol/L 4-（2-氨基乙基）-苯磺酰基氟化物氢氯（ICN Biomedicals，Irvine，CA）和10%甘油。使用Bradford试剂（Bio-Rad，Hercules，CA）进行蛋白质定量，50μg总蛋白裂解物经过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并转移到聚偏二氟乙烯（Millipore，Bedford，MA）。使用10μg如上所述分离的蛋白质进行核蛋白的免疫印迹分析。如Ghibelli等人29使用小鼠单克隆抗细胞色素C抗体（加州拉霍拉市PharMinen）。在4°C下用含有0.1%吐温20（含5%牛奶）的Tris-buffered生理盐水（印迹级；BioRad，Hercules，CA）封闭膜，并在以下稀释液中与一级抗体孵育：p65，1:2000；Mch5，1:1000；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3，1:1000；和细胞色素C，1:1000，在0.5%的牛奶中，用0.1%吐温20的Tris缓冲盐水浸泡1-2小时。在含有0.1%吐温20的Tris缓冲盐水中的0.5%牛奶中添加适当的二级抗体2至3小时，并使用从杜邦新英格兰核公司（马萨诸塞州波士顿）或皮尔斯公司（伊利诺伊州罗克福德）购买的增强化学发光试剂检测抗原-抗体复合物。

瞬时转染和荧光素酶检测

AML12细胞与4×NFκB荧光素酶报告基因共转染30和CMVβ-半乳糖苷酶基因，使用脂质体（Lifefectamine，Life Technologies，Inc.），按照制造商的协议，以2:1的比例（总DNA 1.5μg）。5小时后取出含有DNA/脂质体的转染培养基，立即处理细胞。根据制造商的说明，在转染后14小时采集细胞，并使用双光系统（Tropix，Bedford，MA）进行荧光素酶和β-半乳糖苷酶分析。该系统允许在同一实验样品上连续测定荧光素酶和β-半乳糖苷酶。

流式细胞术检测细胞氧化还原状态和线粒体改变

使用时间分辨双激光激发对Coulter Epics Elite（Coulter Electronics，Hialeah，FL）进行流式细胞术检测：15 mW 488氩（非延迟）和20 mW UV氩（延迟，40μS）。如前所述，使用以下染料进行荧光测量：31-33MCB和单溴双环芳烃分别用于测量GSH和还原细胞巯基；CMX测定线粒体膜电位；MTG测定线粒体质量；NAO用于测量心磷脂含量；和二氯甲烷-x-罗丹明（H2-CMXROS），一种线粒体选择性染料，氧化后变成荧光，用于测量线粒体ROS。紫外激发的蓝色自荧光用于测量还原NAD，即NADPH，代表NADH和NADPH的贡献。对于每个样品，测量488-nm前向光散射以确定细胞大小和紫外激光直角光散射。荧光强度以对数刻度显示。

AML12细胞在6孔组织培养板中培养。将培养上清液与附着的细胞混合，这些细胞用胰蛋白酶/EDTA（Life Technologies，Inc.）收获。将等分的细胞添加到含有等体积的2×细胞培养基中指示染料溶液的试管中，并在组织培养箱中偶尔混合培养30分钟。然后将细胞置于黑暗中的冰上，并在流式细胞仪上运行。每个样本至少记录了15000起事件。

使用软件包MPLUS（Phoenix flow Systems，San Diego，CA）对流式细胞术实验进行分析。为了帮助清除碎屑，紫外线侧散射对488通过分析未处理的对照样品确定的正向散射门。使用围绕整个群体或不同亚群体绘制的分析（非隔离）门来确定荧光中值和与这些群体相关的细胞百分比。所有比较均使用相同的门。

DAPI荧光

将胰蛋白酶化细胞固定在70%ETOH中，在50至80×克持续5分钟，并重新悬浮在含有0.5%Nonide P-40和10μg/ml DAPI的溶液中。根据Hotz等人的描述，对凋亡细胞核形态进行了评估34每个实验点200个细胞，每个点测定三次。

共焦激光显微镜

AML12细胞在2孔盖玻片室（Nunc Inc.，Bountiful，UT）中培养，处理后，在37°C下用CMXROS和MTG染色15分钟。使用ACAS Ultima共焦激光细胞仪（Meridian Instruments，Okemos，MI）对细胞进行扫描，并使用60×油物镜（NA=1.3）获得共焦图像。首先扫描线粒体染色的荧光场，然后从同一场采集NAD（P）H荧光图像。使用Adobe Photoshop（Adobe Systems，Inc.，San Jose，CA）将图像显示为合成图像（红、绿、蓝）。

透射电子显微镜

用胰蛋白酶法收集的细胞在室温下用一半强度的Karnovsky固定剂固定过夜。然后在0.1 mol/L磷酸盐缓冲液中冲洗细胞，将其固定在2%缓冲四氧化锇溶液中，然后通过一系列分级乙醇溶液进行脱水。用环氧丙烷冲洗细胞，然后用1:1的PolyBed（Polysciences，Warrington，PA）/环氧丙烷混合物渗透细胞，然后再用100%的PolyBed。然后将细胞嵌入PolyBed中，并在60°C下聚合过夜。用乙酸铀酰和酒石酸铅饱和溶液对切片（70至90 nm）进行染色，并在Philips 410透射电子显微镜上拍摄显微照片（FEI Co.，Hillsboro，OR）。

半胱氨酸天冬氨酸酶活性的检测

分别使用底物IETD-AMC、LEHD-AMC和DEVD-AMC（Biomol）测量Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3的活性。收集细胞并在上述Triton X-100裂解缓冲液中进行裂解。将蛋白裂解物（50μg）在37°C的caspase分析缓冲液（50 mmol/L Hepes，pH 7.4，100 mmol/L-NaCl，2 mmol/L-EDTA，10%蔗糖，0.1%CHAPS，含有10μmol/L每种肽基-氨基甲基香豆素底物的（3-[（3-胆酰胺丙基）二甲基氨]-1-丙磺酸盐（Meriden，CN）10 mmol/L.二硫苏糖醇）中培养30分钟。使用荧光板阅读器（Packard Instruments，Meriden，CT）重复进行酶分析和氨甲基香豆素标准曲线，激发和发射波长分别为360 nm和460 nm。在每次分析中减去底物空白的荧光作为背景。使用Packard的I-Smart软件进行数据分析。

TNF+Act D治疗后NFκB结合和反激活活性

在肝细胞和其他类型的细胞中，NFκB激活的抑制使细胞对TNF诱导的凋亡敏感。16,35-39将IκB蛋白或p65（rel A）抗体微量注射到AML12细胞中，并用IκB超阻遏物基因转染细胞，在这种情况下，NFκB功能失活，使AML12肝细胞在TNF治疗后发生凋亡。40,41为了确定Act D是否通过抑制NFκB活性使AML12细胞对TNF诱导的凋亡敏感，分别通过免疫印迹和EMSA分析p65转位到细胞核和NFκ）B DNA结合活性。NFκB的TNF激活通常伴随着细胞核中NFκB（p65/p50）的短暂增加。42Western blot分析如图2A所示▶显示单独使用TNF或TNF+Act D治疗30分钟后，细胞核p65水平增加。2小时后，这两个治疗组之间的细胞核p65浓度仍然没有差异（数据未显示）。为了确定TNF+Act D治疗是否阻断NFκB结合，从单独或联合使用Act D或TNF治疗的细胞中制备核提取物。经TNF处理30分钟后，EMSA测定的NFκB DNA结合增加。30分钟后测得的TNF+Act D诱导凋亡的组合没有抑制NFκB结合（图2B）▶或TNF治疗2小时（数据未显示）。TNF处理后，AML12细胞中的信号转导子和转录激活子3（STAT3）结合也增加，且该结合未被Act D预处理抑制（数据未显示）。STAT3的激活通过白细胞介素-6、NFκB靶基因和STAT3强大的反式激活因子与NF kb B活性相关。43-45

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图2。

NFκB活化和转录活性分析。A类和B类：细胞用Act D（200 nmol/L）或生理盐水预处理30分钟，然后用TNF（20 ng/ml）预处理。按照材料和方法中的描述制备核提取物。答：通过免疫印迹分析评估p65的核蓄积。在TNF处理30分钟后，对核提取物（10μg）的重复样品进行p65蛋白分析。分子量标记如左图所示。B类：按照材料和方法中的描述，在暴露于TNF 30分钟后对NFκB进行EMSA。上部带（NFκB）由p65/p50异二聚体组成；下带为p50/p50同二聚体。显示了重复的样本。这些结果代表了三个独立的实验。抄送：通过荧光素酶报告基因分析TNF+Act D治疗后NFκB的激活。如材料和方法中所述，使用脂质体胺与CMVβ-半乳糖苷酶和NFκB驱动荧光素酶报告子构建物共同转染细胞。5小时后，添加TNF+Act D达9小时，如材料和方法所述。采集细胞，按顺序分析蛋白裂解液的等分样品中的两种荧光素酶(黑色条)和β-半乳糖苷酶活性(点画条). 条形图显示了六个独立样本相对于未处理细胞（UNTX）的SEM。

NFκB EMSA分析测量异二聚体向细胞核的移位及其与DNA的结合。然而，DNA结合可能不能准确反映NFκB的转录激活活性。为了确定经Act D预处理的细胞中NFκB反式激活能力是否降低，用Act D对瞬时转染了NF-κB荧光素酶报告体的细胞进行30分钟的预处理，然后暴露于TNF 9小时。NFκB转录活性在单独暴露于Act D的细胞中没有改变，而TNF单独处理导致报告基因活性相对于未处理细胞的活性增加了7到8倍（图2C）▶在用Act D预处理并随后暴露于TNF的细胞中，这种增加并没有被阻断。细胞与CMV驱动的β-半乳糖苷酶基因共转染，作为这些实验的对照。与未经处理的细胞相比，所有治疗组的β-半乳糖苷酶活性增加了50%至70%。总之，这些结果表明，细胞暴露于TNF+Act D的凋亡诱导组合不会阻断NFκB核转位或DNA结合或反式激活能力。然而，荧光素酶反式激活试验可能高估了与生物学相关的NFκB转录活性，并不能解释单个基因反式激活可能受到的抑制。事实上，与单独使用TNF相比，暴露于TNF+Act D 6小时后，NFκB反式激活的基因产物IκBαmRNA减少（数据未显示）。

肿瘤坏死因子诱导细胞凋亡过程中半胱氨酸蛋白酶的激活

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活是凋亡过程的特征。为了确定TNF+Act D诱导凋亡期间caspase激活的动力学，在AML12细胞暴露于TNF+Act D后，使用荧光底物测量caspase-3、-8和-9活性，在TNF+Act D治疗6小时前检测到IETD和LEHD的切割活性（图3A）▶另一方面，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3活性（DEVD）在3到6小时之间可检测到。为了直接研究半胱天冬酶的激活，进行免疫印迹分析以检测半胱天蛋白酶-8的活性、裂解形式（见图3A▶)和半胱天冬酶-3（插入图3B▶). 直到TNF+Act D治疗后16小时，caspase-8裂解产物才被检测到，并且在24小时后显著增加。在9小时时检测到裂解的活性形式的胱天蛋白酶-3，并在15至18小时时达到最大值。暴露于TNF或Act D作为单一药剂的细胞的胱天蛋白酶-3、-8和-9的活性没有增加（数据未显示）。这些数据表明，TNF诱导的肝细胞caspase激活不是细胞因子的直接作用，而是在TNF与Act D联合治疗细胞引起的凋亡过程中检测到的。

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图3。

用TNF+Act D处理的AML12细胞中caspase-3、-8和-9的激活。用Act D（200 nmol/L）预处理细胞30分钟，然后用TNF（20 ng/ml）刺激。按照材料和方法中的描述制备细胞提取物并测定蛋白质浓度。答：使用IETD-AMC测定蛋白裂解物上的Caspase-8和Caspase-9活性(实心三角形)和LEHD-AMC(开放的圆圈)分别是。插图：免疫印迹分析在TNF+Act D治疗后的指定时间出现裂解的活性形式caspase-8。B类：使用DEVD-AMC测定蛋白裂解物上的Caspase-3活性。插图：在用TNF+Act D治疗后的指定时间，对裂解的活性形式caspase-3的外观进行免疫印迹分析。每个数据点代表重复样本的平均值。这些数据代表了三个独立的实验。

TNF+Act D治疗后肝细胞NAD（P）H和GSH水平降低

TNF已被证明能在培养的肝细胞和肝脏中诱导线粒体ROS的产生体内。24NADH和NADPH是细胞还原当量的主要来源，部分是抗氧化防御机制的组成部分，可防止氧化应激造成的损伤。肝脏是谷胱甘肽（一种三肽硫醇）的主要生成者，除其他功能外，它可以清除自由基并帮助维持蛋白质硫醇氧化还原状态。23,46为了确定用TNF+Act D治疗AML12细胞是否会引起还原当量的变化，在治疗后的不同时间用流式细胞仪测定细胞中的NAD（P）H和GSH。图4A▶显示了NAD（P）H直方图，将未经处理的细胞与暴露于TNF+Act D 12小时的细胞进行了比较。从直方图中可以清楚地看出，治疗导致含有正常水平NAD（P）H的细胞数量急剧减少。这些变化的量化如图4B所示▶该图由与图4A所示类似的直方图构成▶暴露于TNF+Act D 3至15小时的细胞。第一次检测到NAD（P）H水平在3小时时降低，到6小时时，未经处理的细胞和暴露于TNF+Act D的细胞之间的NAD▶并且只有25%的细胞保持正常的NAD（P）H水平（数据未显示）。细胞GSH水平也随着与NAD（P）H类似的动力学而降低，这是对TNF+Act D治疗的反应（图4B）▶使用单溴双环芳烃荧光（未显示）通过流式细胞术测量这些细胞中的总还原硫醇，结果表明，TNF+Act D处理后，总还原硫酚也以类似于GSH的方式减少。这是意料之中的，因为肝细胞中存在大量谷胱甘肽，是这些细胞总还原巯基部分的主要成分。

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图4。

凋亡细胞中NAD（P）H和GSH水平的丢失。用TNF+Act D或生理盐水（UNTX）处理细胞，并按照材料和方法中的描述进行流式细胞术。答：UNTX细胞和用TNF+Act D处理12小时的细胞的单变NAD（P）H直方图。细胞总还原NAD（标记为NAD（P）H，以反映NADH和NADPH的贡献）被测量为紫外激发的蓝色自荧光（450 nm）。注意，荧光中值以及保持在正常范围内的细胞百分比可以从这些曲线中得出。B类：显示了NAD（P）H和GSH坐标损失的时间过程。NAD（P）H通过在450nm处的UV激发的蓝色荧光来测定。通过MCB染色来测量GSH。数据点表示保持正常NAD（P）H的细胞百分比(开放三角形)或GSH(开放式钻石)相对于未处理样品获得的相应值的水平(开放式广场). 误差条代表三个独立样本的SEM。这些数据代表了至少三个独立实验。

TNF诱导细胞凋亡中的线粒体改变

为了确定TNF+Act D治疗引起的还原当量减少是否涉及线粒体功能丧失或线粒体结构损伤，使用荧光染料CMX通过流式细胞术测量线粒体跨膜电位（Δψm）。跨膜电位和NAD（P）H的双变量图显示，与未经处理的细胞相比，大部分细胞暴露于TNF+Act D 12小时后，跨膜电位降低，NAD（P）H水平降低（图5A）▶这些参数之间的关系是线性的；简单的回归分析（未显示）表明，存在高度显著的相关性(R（右）2= 0.72;P（P）<0.0001）。在细胞暴露于TNF+Act D后的3到6小时内，可以检测到ΔΨm的减少，并且随着时间的推移逐渐下降，在治疗15小时后下降到对照组的～65%（图5C）▶。

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图5。

凋亡细胞线粒体膜电位和线粒体心磷脂的丢失。用TNF+Act D处理细胞，并按照材料和方法中的描述进行流式细胞术分析。答：膜电位的双变量斑点（ΔΨ_米（通过CMX染色测定）和NAD（P）H，来自未经处理的（UNTX）培养物和用TNF+Act D处理12小时的培养物。B类：未经处理（UNTX）培养物和TNF+Act D治疗12小时的培养物的心磷脂含量（NAO染色）和NAD（P）H的双变量斑点图。C类和医生：线粒体膜电位逐渐丧失的时间进程(C类)和心磷脂含量(D类)TNF+Act D暴露后。曝光时间显示在横坐标上。数据点表示保持正常线粒体膜电位的细胞百分比的平均值(C类)或心磷脂含量(D类). 计算了相对于未处理样品的水平(开放式广场). 误差条代表三个独立样本的SEM。这些数据代表了至少三个独立实验。

心磷脂是一种线粒体内膜磷脂，在维持包括细胞色素C在内的膜蛋白中起主要作用。47,48脂质过氧化导致含心磷脂线粒体膜结构缺陷49至51可通过荧光染料NAO染色进行评估。为了确定心磷脂染色在TNF诱导的细胞凋亡中是否发生了改变，将细胞暴露于TNF+Act D 12小时，并通过流式细胞术分析心磷脂和NAD（P）H（图5B）▶心磷脂（NAO荧光）和NAD（P）H的双变量图表明，TNF+Act D暴露增加了心磷脂减少和NAD（P）H含量降低的细胞比例。这些变化之间有高度的相关性(R（右）2= 0.88;P（P）> 0.0001). NAO荧光缺失表明暴露于TNF+Act D的细胞线粒体膜损伤随着时间的推移逐渐增加（图5D）▶与Δψm的变化类似。

Mancini等人52据报道，人结肠癌细胞的凋亡与浓缩线粒体的增殖有关，线粒体的跨膜电位降低。这些线粒体变化发生在细胞周期停滞和凋亡之前。采用电子显微镜和流式细胞术检测TNF+Act D诱导凋亡期间AML12细胞是否发生类似变化。用TNF+Act D处理AML12肝细胞12小时后，线粒体体积减少，电子密度增加，嵴结构模糊（图6A）▶在其他系统中，这些线粒体类似于凋亡过程中的线粒体凝聚，这些系统被称为凝聚、超凝聚或超凝聚。52-54与未经处理的细胞相比，TNF+Act D并没有引起明显的线粒体肿胀（典型的坏死或凋亡后期）或线粒体数量增加。

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图6。

凋亡细胞线粒体质量和细胞色素C释放的变化。用TNF+Act D处理细胞，并在12小时后采集细胞进行透射电镜、流式细胞术和免疫印迹分析，如材料和方法所述。答：透射电子显微镜检测到线粒体凝集。UNTX-和TNF+Act D处理细胞的电子显微照片（×12000）。这个箭头表明UNTX样品中线粒体正常，嵴可见，基质密度正常。在处理过的样品中箭头表明线粒体浓缩，电子密度增加，使嵴结构变得模糊。B类：来自未经处理（UNTX）培养物或暴露于TNF+Act D的培养物的线粒体蛋白（MTG染色）和NAD（P）H的双变量斑点。抄送：用TNF+Act D治疗后细胞溶质细胞色素C释放的时间过程。分子量标记如左图所示。

MTG染料可用于定量细胞线粒体总质量。55图6B显示了未经处理的细胞和暴露于TNF+Act D的细胞中MTG荧光和NAD（P）H的双变量图▶大多数未经处理的细胞适合具有高NAD（P）H含量和可变MTG荧光的人群。然而，在用TNF+Act D处理的细胞中，一小部分细胞具有较低的NAD（P）H水平和较高的MTG荧光。经过12小时的治疗后，这种细胞群增加了两到三倍。图6B中的垂直线▶作为参考点，定义了未经处理细胞主要群体中NAD（P）H水平的下限。电子显微照片和MTG染色的增加表明，TNF+Act D暴露后，单个线粒体的质量增加，线粒体总数没有明显变化。

接下来，我们确定TNF+Act D是否刺激细胞色素C释放到AML12细胞的细胞溶质部分。在未经处理的细胞中，免疫印迹法检测到极少的细胞溶质细胞色素C（图6C）▶TNF+Act D治疗6小时后，细胞液中检测到细胞色素C，并增加至18小时。用抗细胞色素C抗体对处理和固定的AML12细胞进行免疫荧光染色，检测线粒体细胞色素C的释放（数据未显示）。线粒体释放细胞色素C的时间过程与caspase-9激活的时间一致（图3A）▶被认为依赖于细胞色素C的释放。

NAD（P）H的共焦成像（图7A）▶，Δψm（图7B）▶和线粒体质量（图7C）▶流式细胞术数据证实了上述结果。图7 A–C中显示了一个字段▶，三个字段合并在图7D中▶，以说明TNF+Act D治疗12小时后处于不同凋亡阶段的细胞。非凋亡细胞以星号表示。箭头表示早期凋亡细胞（线粒体Δψm减少，但无明显形态学变化）。箭头指向两个具有凋亡形态学变化的细胞。非凋亡细胞（星形），保留高水平的还原当量（紫色，图7A▶)线粒体膜电位高（橙色，图7B▶)线粒体质量无变化（图7C）▶在合并图像中产生洋红色的细胞（图7D）▶箭头所示的三个早期凋亡细胞具有低NAD（P）H（图7A）▶和低Δψm（图7B）▶但线粒体质量没有明显增加（图7C）▶。在合并的图像中，这些单元格显示为橙色（图7D）▶坦率地说，在合并图像中，凋亡细胞呈亮绿色（图7D）▶它反映了NAD（P）H的损失（图7A）▶，低Δψm（图7B）▶线粒体质量增加（图7C）▶线粒体质量增加与已知的形态学变化一致，如右下角绿色细胞中的膜起泡。

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图7。

AML12细胞凋亡的共焦成像。细胞生长在盖玻片和NAD（P）H荧光上(A类)线粒体膜电位（CMX染色）(B类)，和线粒体质量（MTG）(C类)按照材料和方法进行检查。单个字段如所示A–C图像被合并到(D类). 显示的区域代表了从早期到晚期凋亡观察到的变化谱：明显正常的细胞(明星); NAD（P）H降低但ΔΨm正常的细胞(箭头); 坦率地说，凋亡细胞(箭头).

谷胱甘肽消耗增加ROS积累并使肝细胞对TNF诱导的凋亡敏感

迄今为止的结果表明，线粒体产生的氧化应激增加或细胞抗氧化防御机制的丧失（或两者兼而有之）在肝细胞凋亡中起着关键作用。为了确定在TNF处理的细胞中是否检测到ROS，我们使用流式细胞术评估H2CMX，H2CMX是一种氧化后会发出荧光的非荧光化合物。在暴露于TNF的AML12细胞中，未检测到ROS水平的变化（图8A）▶然而，如果用DEM预处理细胞以急性消耗细胞GSH水平，然后暴露于TNF，联合处理会导致GSH水平下降70%，ROS水平上升55%（图8A）▶单独的DEM处理使GSH减少了50%以上，而ROS没有增加。数据表明，只有在部分消耗谷胱甘肽后，活性氧才会在TNF处理的肝细胞中积聚。

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图8。

活性氧检测和TNF诱导低GSH含量细胞凋亡。答：TNF诱导低GSH肝细胞产生ROS。培养物未经处理，用DEM（0.8 mmol/L）、TNF（20 ng/ml）或DEM和TNF同时处理。添加TNF前，DEM暴露60分钟。18小时后收集细胞，使用MCB染色（用于GSH）和H2-CMXROS（用于测量ROS）进行流式细胞术。数据是相对于未处理样本（UNTX）的值表示的。误差条代表三份样品的SEM。B类：TNF促进低GSH细胞的凋亡。培养物未经处理（UNTX）或用TNF（20 ng/ml）、BSO（1 mmol/L）+DEM（0.8 mmol/L.）或BSO+DEM+TNF的组合处理。在TNF治疗前，分别开始接触BSO和DEM 60分钟和30分钟。19小时后收获细胞，胰酶化后用70%乙醇固定，DAPI染色用于荧光显微镜分析。误差条代表三份样品的SEM。所示数据代表了至少三个独立实验。

鉴于这些结果，我们研究了TNF作为单一药物是否会对细胞GSH水平低的细胞产生凋亡作用。在这些实验中，AML12肝细胞被DEM处理以急性消耗GSH，并被BSO（γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）活性抑制剂）处理以阻断从头开始谷胱甘肽合成。56正如预期的那样，细胞单独暴露于TNF并没有引起凋亡。相反，联合接触TNF、BSO和DEM后，约45%的细胞凋亡（图8B）▶证明TNF通常不会导致肝细胞死亡，是低GSH含量肝细胞的凋亡剂。在没有TNF的情况下，用BSO和DEM处理细胞也会增加AML12细胞的凋亡（图8B）▶这表明，这些细胞中可能存在基本水平的氧化应激，如果GSH耗尽，氧化应激就会变得明显。

α-LA是一种有效的抗氧化剂，能够保护受损细胞中的GSH水平。57α-LA通过多种活性发挥作用，包括直接还原氧化型谷胱甘肽、清除ROS、螯合金属、还原氧化型维生素E和C以及刺激从头开始通过最大化半胱氨酸流量来合成谷胱甘肽，以保持谷胱甘氨酸生物合成中限速酶步骤γ-GCS的最佳活性。58,59图9A▶表明α-LA不仅阻止了TNF+Act D处理引起的GSH降低，而且实际上增加了这些细胞的GSH含量。这些结果表明，α-LA可能有效阻止已知氧化剂引起的细胞损伤。MEN是一种氧化剂，通过产生线粒体ROS发挥作用。60在用Act D预处理并暴露于MEN 3小时的细胞中检测到线粒体损伤（通过流式细胞仪测定心磷脂进行评估）。这些细胞的心磷脂水平比单独暴露于MEN的细胞低约25%（图9B）▶但用α-LA治疗培养物完全阻止了这种下降。这些结果表明，α-LA可以阻断线粒体产生的活性氧引起的损伤作用。此外，他们暗示，损伤可能是由Act D阻断细胞抗氧化防御引起的，该防御涉及用Act D预处理然后暴露于TNF或MEN的细胞中的GSH稳态。

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图9。

α-硫辛酸增加谷胱甘肽水平并防止氧化剂的损伤。答：α-LA阻断TNF+Act D诱导的GSH丢失。在添加TNF（20 ng/ml）和Act D（200 nmol/L）之前，用TNF、TNF+Act D或1 mmol/Lα-LA预处理细胞60分钟。培养12小时后，收集细胞，并使用MCB染色的流式细胞术评估细胞GSH含量，如材料和方法中所述。误差条代表三份样品的SEM。B类：行动D加剧了心磷脂的流失。用Act D（200 nmol/L）单独或与α-LA（1 mmol/L。然后添加MEN（100μmol/L）3小时。如材料和方法中所述，采集细胞并使用NAO染色通过流式细胞术评估线粒体心磷脂。误差条代表与甲萘醌处理细胞相关的三份样品的SEM。MEN治疗使心磷脂损失最小。所示数据代表了至少三个独立实验。

感谢科林·普里查德（Colin Pritchard）、丽莎·普里夏德（Lisa Prichard）、诺伯特·德什纳（Norbert Deschner）和普里西拉·瑟伯（Priscilla Thurber）的协助，以及D.霍肯贝（D.Hockenbey）博士的评论。我们感谢福斯托实验室成员的积极讨论和评论，以及马修·米勒在准备手稿方面的帮助。