干细胞的主要特性已从经典的干细胞营养谱系更新系统（包括骨髓、肠上皮和皮肤）的研究中推断出来。干细胞的基本特性包括重复增殖、更新干细胞群以及产生足够分化的后代以维持或再生组织功能能力的能力。1,2经典干细胞被认为是未分化的，并表达可变的分化潜能；完全（终末）分化的细胞不被认为具有这些特性。1,2虽然经典的干细胞饲养谱系系统已被用来推断干细胞的特性，但现在的证据表明，在许多组织中，例如中枢神经系统中，存在干细胞样细胞3-6和肝脏，7,8似乎主要由终末分化的薄壁细胞组成，不包含活性干细胞来源的谱系。缺乏高细胞周转率的组织中的干细胞样细胞表现出不同于传统干细胞的特性。
成年啮齿动物肝脏至少含有两种公认的具有主要干细胞特性的细胞群，即单潜能（定向）祖细胞（完全分化的肝细胞和胆道上皮细胞）和多潜能非实质上皮（导管）祖细胞，这两种细胞在不同的病理生理环境下都有助于肝脏修复，尽管在正常情况下，这两种类型的细胞都没有显著的增殖。9手术切除（部分肝切除）或中毒性损伤（坏死）导致的肝细胞（和肝组织块）的替换通常是通过残余（活的）组织中含有的完全分化、正常静止的肝细胞和胆道上皮细胞的增殖来实现的。10-13例如，成年啮齿动物肝细胞具有广泛的生长潜力14-16并能通过至少86倍细胞增殖体内在实验环境下。17因此，完全分化的肝细胞具有典型干细胞-饲料谱系系统干细胞的基本特性，7, 9包括重复增殖和产生大量分化后代的能力，可被视为产生额外肝细胞的单潜能祖细胞。9如果成熟的残留肝细胞和胆道上皮细胞能够增殖以恢复正常的肝脏质量和结构，那么在啮齿类动物的肝脏修复过程中，多潜能上皮干样（卵圆形）细胞不会被激活。18,19然而，在某些形式的毒性肝细胞损伤损害肝细胞的复制能力后，肝实质可能由卵圆细胞取代。7,8在目前的研究中，我们提供了证据表明，具有某些干样特性的第三肝祖细胞，即未完全分化的小肝细胞样细胞，也可能参与大鼠肝组织修复。我们检测了逆转录酶诱导肝细胞损伤大鼠肝再生的细胞反应和时间进程。逆转录酶是吡咯里嗪生物碱（PA）家族中的一种天然化合物，对各种哺乳动物组织（包括肝、肺、肾、脑、肌肉、心脏、胸腺、淋巴结和血管）有毒。20-25PA的肝毒性作用是长期的26-28包括抑制肝细胞分裂，诱导多倍体和巨细胞增生。27,28逆转录酶暴露大鼠肝脏中巨细胞增生的急性发展是由于PA及其代谢产物对受刺激分裂的肝细胞的抗有丝分裂作用所致，例如由部分肝切除术（PH）或肝细胞坏死引起的。29在这个模型中，逆转录酶损伤的、完全分化的肝细胞和卵圆形细胞都没有大量增殖，对PH后肝质量的恢复没有显著作用。相反，PH后，整个肝组织通过一种新的细胞反应进行重建，这种反应是由小的肝细胞样祖细胞的出现和快速扩张介导的，这些祖细胞与胎儿肝母细胞、卵圆细胞和完全分化的肝细胞具有某些表型特征，但在形态和/或表型上与每种不同。PH后早期出现小的肝细胞样细胞，迅速增殖形成膨胀的细胞聚集物，取代大细胞肝细胞，同时获得成熟肝细胞典型的全方位分化特征。在其他肝损伤模型中，未观察到丢失的肝细胞替换和小肝细胞样祖细胞后代的完全肝再生，在这些模型中，剩余成熟肝细胞的复制受到损害，这表明肝再生的一种新机制，由先前未标记的成年大鼠肝脏祖细胞类型的扩张介导。
材料和方法
动物
这些研究中使用了雄性德国-斯特拉菲舍尔344 DPPIV缺乏大鼠。这些老鼠是在北卡罗来纳大学教堂山分校的一个群体中繁殖和饲养的。最初的繁殖者来自罗德岛医院肿瘤内科，布朗大学（普罗维登斯，RI）。
逆转录酶给药与PH
6周龄的雄性同窝大鼠Fischer 344只（体重约100克）随机接受逆转录酶治疗(n个=72）和车辆处理对照(n个=39）组。这两组大鼠分别在6周龄和8周龄时，每隔2周接受两次逆转录酶（30mg/kg i.p.）或溶媒（150mmol/L等量盐水溶液）治疗。逆转录酶工作溶液按规定制备。28将逆转录酶（12,18-二羟千里光-11,16-二酮；β-龙吉洛滨，西格玛，圣路易斯，密苏里州）以10 mg/ml添加到蒸馏水中，并用1 N HCl滴定至pH 2.5，以完全溶解固体。随后，使用1 N NaOH中和溶液，并添加NaCl，使最终浓度为6 mg/ml逆转录酶和150 mmol/L NaCl（pH 7.0）。配制完成后立即使用工作溶液。第二次逆转录酶或载体治疗五周后，实验大鼠和对照大鼠被随机分为以下组：对照组(n个=5），控制/PH(n个=34），仅逆转录酶(n个=15）和逆转录酶/PH(n个= 57). 对照组和仅逆转录组均未进行手术治疗。在没有PH的情况下，没有与载体或逆转录酶治疗相关的死亡率。手术PH基本上按照最初的描述进行。30暴露于逆转录病毒蛋白酶的大鼠在PH后的死亡率（35%）高于对照组（18%），这可能是由于逆转录病毒蛋白酶毒性的影响。逆转录酶/PH中存活的大鼠(n个=37）和控制/PH(n个=28）组在PH后1、3、5、7、10、14、17、23和30天进行安乐死，并收获肝脏(n个=每个时间点3–6）。同样，仅逆转录酶治疗组的大鼠在PH后第0、7、14、21和30天被安乐死，并收获肝脏(n个=每个时间点3），其中第0天表示最终逆转录酶治疗后5周。在PH后30天的时间点同时收集未经处理的对照大鼠的肝脏(n个= 5). 在每个终点，记录大鼠体重和肝脏重量。将肝组织固定在10%中性缓冲福尔马林中，并常规处理石蜡包埋切片。此外，冷冻组织并制备冷冻切片。涉及动物的研究是根据美国国立卫生研究院和北卡罗来纳大学教堂山分校动物护理和使用委员会提出的联邦和州指南进行的。
组织学
按照标准程序，将福尔马林固定、石蜡包埋的肝组织切片至6μm，并用苏木精和伊红（H&E）染色。细胞多糖沉积通常使用周期性酸-希夫（PAS）反应检测。通过用唾液淀粉酶预处理组织切片，验证糖原是细胞多糖的主要成分。
酶组织化学
如前所述检测胆道ATP酶。31简单地说，在37°C下，在含有0.5 mg/ml ATP（钠盐）、10 mmol/L MgSO的底物溶液中培养6μm肝脏冷冻切片30分钟4，3.63 mmol/L硝酸铅（II）和80 mmol/L-马来酸三钠缓冲液，pH 7.2。通过在室温下（r.t.）在0.22%硫化铵溶液中培养切片3分钟，观察ATP酶活性。用甲基绿对组织切片进行复染，并将其固定在甘油中。
肝细胞、胆管和卵巢细胞标记物的免疫组织化学检测
使用小鼠单克隆抗体H.4、，32,33兔抗鼠转铁蛋白抗体（Cappel、Aurora、OH）和兔抗鼠白蛋白抗体（Cappel）。使用小鼠单克隆抗体（mAbs）BD.1检测胆管标记物，34BD.2，35和GST-π（Dako，Carpintia，CA）。使用单克隆抗体OV6检测卵巢细胞标记，36OC.2，32,33OC.4、OC.5和OC.10（Hixson DC，未出版）。转铁蛋白和白蛋白在6μm石蜡切片上进行免疫染色。其他免疫染色反应在6μm肝脏冷冻切片上进行。在石蜡切片上进行间接免疫过氧化物酶分析，石蜡切片用二甲苯清除，并通过一系列分级的醇，最后在PBS（136 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/LNa）中短时间培养（15分钟）2高性能操作4和1.76 mmol/L KH2人事军官4，pH 7.2），以使组织切片完全再水化。使用亲和素/生物素过氧化物酶系统（Vectastain rabbit kit，Vector，Burlingame，CA）检测主要抗体。用0.3%H淬灭内源过氧化物酶活性2O（运行）2转铁蛋白和白蛋白的多克隆抗体在PBS中稀释1:200，在组织切片上孵育30分钟，从而阻断非特异性活性，并使用二氨基联苯胺（DAB试剂盒，Vector）和Gill苏木精复染进行检测。在冷丙酮（−20°C，10分钟）中固定的冰冻切片上进行间接免疫荧光分析。非特异性活性的阻断是通过在1%正常山羊血清中的PBS中在r.t培养30分钟来完成的。一级抗体在PBS/1%正常山羊血浆中以1:100稀释（OV6为1:2000，GST-π为1:25），并在r.t与组织切片培养30分钟。FITC-结合多价二级抗体（Sigma）在PBS/1%正常山羊血清中稀释至1:100。在4°C下用二级抗体孵育30分钟。切片用碘化丙啶复染。使用尼康FXA显微镜和彩色透明胶片拍摄图像。
PH后增殖细胞比例的估算
核抗原Ki-67被用作细胞分裂的标记37并且只存在于增殖细胞中。使用6-μm石蜡切片进行间接免疫过氧化物酶分析，石蜡切片用二甲苯清除，通过一系列分级的醇，并在室温下的TBS（25 mmol/L Tris-Cl，136 mmol/L-NaCl，和27 mmol/L-KCl，pH 7.2）中培养15分钟，以完全复水组织切片。抗原回收是通过在抗原回收缓冲液（1.8 mmol/L柠檬酸，8.2 mmol/L-去离子水中柠檬酸钠）中微波（～750瓦）载玻片完成的，共四个5分钟周期，然后在室温下的TBS中冷却。内源过氧化物酶活性用0.3%H猝灭2O（运行）2在TBS中持续10分钟。生长周期中的细胞用Ki-67抗原的小鼠单克隆抗体（Immunotech，法国马赛）在TBS中以1:50的稀释度修饰。使用真蓝色过氧化物酶底物（Kirkegaard&Perry，Gaithersburg，MD）开发的亲和素/生物素过氧化物酶系统（Vectastain kit，Vector）进行检测，并用对比红色进行复染。
PH后逆转录酶诱导炎症的特征
为了评估逆转录酶/PH大鼠H&E染色切片中观察到的炎症反应，在PH后1天和3天，使用鼠抗大鼠ED1（单核细胞和组织巨噬细胞）和ED2（单组织巨噬细胞）的单克隆抗体，对逆转录酶暴露大鼠和对照大鼠的6μm石蜡切片进行间接免疫过氧化物酶分析，如前所述38稍作修改。大鼠ED1和ED2的单克隆抗体购自Serotec（英国牛津州基德林顿）。石蜡切片用二甲苯清除，并通过一系列分级的醇进行再水化。为了灭活内源性过氧化物酶，将切片在室温下在0.5%的H溶液中培养15分钟2O（运行）2为了阻止非特异性染色，将切片在r.t.下在20%正常兔血清/PBS中孵育10分钟。一级抗体在正常兔血清/PBS（ED1 1:100，ED2 1:10）中稀释，并在切片上在4℃孵育45分钟。二级抗体，即过氧化物酶结合的兔抗鼠免疫球蛋白（Dako），在正常兔血清/PBS中以1:20稀释，并在r.t切片上孵育30分钟。使用二氨基联苯胺（DAB试剂盒，载体）和吉尔苏木精复染检测抗体。
形态计量分析
计算机形态计量学用于量化在PH后的不同时间，逆转录酶/PH大鼠再生肝脏中小肝细胞簇占据的薄壁组织面积，并估计对照和逆转录酶暴露的大鼠肝脏中肝细胞、巨细胞和小肝细胞样祖细胞的大小。该分析是使用Macintosh G3计算机和NIH Image软件进行的(http://rsb.info.nih.gov/nih-image/). 为了进行面积定量，在PH（3、7、14和30天）后的每个时间点，从三只不同的大鼠中选择两个随机H&E染色切片进行分析。小肝细胞面积表示为每个时间点六个截面平均肝总截面面积的百分比。为了估算细胞大小，从两个不同的大鼠中选择一个随机的H&E染色切片进行分析，这两个大鼠分别来自于未注射药物的对照大鼠、对照/PH大鼠（PH后3天）和逆转录酶/PH大鼠类（PH之后3天）。细胞大小以μm为单位2)作为每组15个不同随机测量的平均值。
超微结构
将福尔马林固定组织浸入3%戊二醛中的100 mmol/L二羧酸钠缓冲液中，pH 7.4，含0.05%CaCl2一夜之间。薄片用四氧化锇固定，用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色，并用透射电子显微镜检查。
统计分析
双尾未成对t吨-测试用于生成P（P）评估并确定实验组和对照组之间肝脏重量和肝脏/体重比的所有量化差异的显著性。所有计算均使用GraphPad Prism软件（v.2.01）。
结果
逆转录酶损伤大鼠肝脏PH后的细胞反应
在PH后1天，逆转录酶/PH组的大鼠具有苍白、易碎的肝脏，在PH后5天大体外观正常。在PH后1至3天之间，有炎症、轻度凝固性坏死和肝细胞凋亡的显微镜证据（数据未显示）。PH后1天的炎性浸润主要由ED1阳性血单核细胞和ED2阳性Kupffer细胞组成，这些细胞在PH后3天数量增加，可能是通过局部增殖和持续向肝脏募集。PH后5天的H&E染色肝脏切片显示出轻微的持续炎症迹象。对照组和对照/PH组大鼠的肝脏在所有时间点均显示正常的颜色和质地，H&E染色切片中没有炎症迹象。仅逆转录酶组大鼠的肝脏表现出轻微的炎症反应，仅限于局部坏死的罕见区域。ED1/ED2免疫组织化学证实了这些肝脏缺乏全身炎症反应（数据未显示）。
在逆转录酶/PH大鼠PH后1天，残留的肝细胞已经显示出大细胞增生和DNA合成，凋亡小体频繁。PH后3天，易于识别的小肝细胞表现为3-6个细胞的孤立簇（图1A）并且从不与卵圆细胞共定位。此时，在16%（范围为10-25%）的肝小叶中观察到新生的小肝细胞样祖细胞簇。对多只大鼠的H&E染色肝切片的检查表明，新生的小肝细胞样细胞簇并不局限于门脉周围区域，新生的卵圆细胞也不局限于门静脉周围区域，并且在所有小叶区都可见。对扩张的小肝细胞样祖细胞簇小叶下定位的评估表明，31%位于门脉周围，43%位于小叶中部，26%位于中央周围(n个=在四只大鼠的十个随机H&E染色肝脏切片上计数的126个簇）。PH后7天，小肝细胞样细胞增殖形成小叶大小的聚集物（图1C），PH后10天合并成大片（图1E），在PH后14天占据近50%的薄壁组织面积（图1G）到PH后30天，增生的小肝细胞恢复了正常的肝脏结构（数据未显示）。此时，逆转录酶/PH大鼠的肝脏结构与对照组和对照/PH大白鼠的肝脏几乎没有区别（数据未显示）。新形成的肝细胞排列在间隔规则的单细胞厚板中，其间有窦状物，门静脉束和中央静脉呈规则模式。仅逆转录酶治疗组的大鼠有明显的肝细胞瘤（数据未显示）和罕见的局部坏死区域。在对照/PH大鼠的肝再生过程中，从未观察到具有小肝细胞样细胞特征的细胞（图1、B、D、F和H）此外，在对照大鼠或仅逆转录病毒大鼠的肝脏中未观察到小肝细胞样细胞（数据未显示）。
逆转录酶暴露大鼠PH后肝细胞样小细胞的出现和扩增。A、 C、E、，和德国：分别在PH后3、7、10和14天逆转录酶暴露大鼠肝脏（H&E）。B、 D、F、，和高：分别在PH后3、7、10和14天对大鼠肝脏进行对照（H&E）。逆转录酶暴露大鼠PH后3天，在3到6个细胞组成的易于识别的细胞簇中可见小肝细胞样细胞聚集(A类)PH后7天接近小叶大小(C类)并在PH后10天合并成大片(E类). PH后14天，小肝细胞样细胞占据了近50%的实质(G公司). 对照/PH大鼠在任何时间点均未观察到小的肝细胞样细胞(B、 D、F、H). 棒材，50μm。黑色箭头表示肝细胞样小细胞；白色箭头表示兆字节。插入在里面A类显示了不同场的更高放大率。
在该模型中，成熟肝细胞在PH后无助于组织质量和细胞数量的恢复，但可作为巨细胞进行增殖抑制和/或显示凋亡的特征（图2）通过逆转录酶/PH大鼠残余肝细胞和胆道上皮细胞亚群中核抗原Ki-67的阳性染色，PH后1天DNA合成开始明显。PH后3天，肝细胞巨细胞增生清晰可见，大多数肝细胞和胆管上皮细胞Ki-67染色呈阳性（图2A）这反映了一种针对肝脏缺陷的细胞增殖尝试，尽管该模型中的肝细胞无法完成细胞周期并进行有丝分裂。23,28,29PH后5天，逆转录酶损伤的肝细胞表现为巨细胞增多，大多数Ki-67染色阴性，而小肝细胞样细胞簇为Ki-67阳性，并含有频繁的有丝分裂象，表明持续增殖。在PH后14天，只有膨胀细胞聚集物中的小肝细胞样细胞Ki-67呈阳性（图2B）PH后30天，肝块完全重建，新形成肝细胞的增殖活性降低，Ki-67阳性细胞很少（图2C）.
PH后逆转录病毒暴露大鼠肝脏Ki-67核抗原的间接免疫过氧化物酶检测。答：PH后3天，用核抗原Ki-67标记逆转录病毒暴露的大鼠肝脏切片。B类：PH后14天，用核抗原Ki-67标记逆转录病毒暴露的大鼠肝脏切片。抄送：PH后30天用核抗原Ki-67标记逆转录病毒暴露的大鼠肝切片。PH后3天(A类)肝细胞巨细胞增生清晰可见。大多数肝细胞和胆管上皮细胞的核抗原Ki-67（蓝色素）染色呈阳性，表明试图复制，尽管肝细胞没有完成细胞周期。PH后14天(B类)，只有小的肝细胞样细胞有增殖的迹象，并且只有在PH后30天肝块完全重建时(C类)小肝细胞样细胞的增殖活性降低了吗。棒材，50μm。长箭头表示兆字节和短箭头表示小的肝细胞样细胞。
逆转录酶/PH大鼠在肝脏再生过程中出现最小的卵圆细胞反应（图3）在PH后的早期，细胞核较小且细胞质稀少的细胞在形态上与经典的卵圆形细胞相似19,39-41位于入口地带附近（图3A）这些细胞对卵圆细胞和胆管标记物呈阳性，包括OV6、OC.2、OC.5和BD.2，但对OC.4、OC.10和BD.1呈阴性。从PH后第3天开始，可以使用OV6细胞表面标记抗体跟踪PH后卵圆形细胞的增殖，以观察薄壁组织中阳性染色细胞的相对数量（图3D）卵圆形细胞仅适度增殖，在PH后7天达到峰值反应（图3E）且与小嗜碱性肝细胞病灶无关，提示卵圆形细胞分化。7天后，卵圆细胞数量逐渐减少，到PH后30天，剩下的少数卵圆细胞与小肝细胞子代占据的薄壁区域周围残留的巨细胞共定位（图3F）使用其他阳性标记物对卵圆形细胞增殖的鉴定和表征表明，在PH后第3天、第7天和第10天，这种细胞类型在薄壁组织中的频率相似（数据未显示）。在对照/PH大鼠中，OV6抗体（图3G、3H和3I），以及其他卵圆细胞和胆管标记物，仅在PH后3、7和30天装饰胆管。未喂食对照大鼠的肝脏也获得了类似的结果（数据未显示）。仅逆转录酶组的大鼠没有表现出广泛的卵圆细胞增殖（数据未显示），尽管在门管区附近很少能发现形态类似卵圆细胞的细胞。OV6阳性的卵圆细胞在仅逆转录病毒大鼠中很少见，偶尔出现在门脉周围和中央周围部位。仅逆转录病毒大鼠肝脏中OC.2阳性和OC.5阳性的卵圆细胞比OV6阳性的卵圆细胞更丰富，并且主要位于门脉附近，很少有小叶中定位的情况。
PH后逆转录病毒暴露大鼠肝脏中的卵圆细胞增殖。A−C：分别在PH后3、7和30天，逆转录酶暴露大鼠的H&E染色肝脏切片。D−F：分别在PH后3、7和30天，对逆转录病毒暴露大鼠肝脏冷冻切片中的OV6进行间接免疫荧光分析。G−I：分别在PH后3、7和30天对对照大鼠肝脏冷冻切片中的OV6进行间接免疫荧光分析。在这个模型中，卵圆细胞的增殖是最小的。在PH后3天，在逆转录酶暴露大鼠的门管区附近观察到PH后卵圆形细胞增殖的证据(A类和D类)，在PH后7天达到峰值响应(B类和E类)然后慢慢减少，直到PH后30天(C类和F类)当剩余的卵圆细胞与大细胞共定位时。PH后相同时间点对照组大鼠无卵圆细胞增殖(G−I型). 只有胆管OV6阳性。棒材，50μm。箭头表示椭圆形细胞。
小肝癌样祖细胞的表型分析
在PH后1天，逆转录酶/PH大鼠的H&E染色肝切片中不易发现小的肝细胞样祖细胞，但在PH之后3天，这些肝切片中很容易识别(P（P）<0.001）较小尺寸（平均值=135.4±9.6μm2)与对照组大鼠肝细胞相比（平均值=294.9±15.0μm2)和从对照组/PH再生肝细胞（平均=391.5±23.0μm2)大鼠。小的肝细胞样祖细胞具有小的嗜碱性细胞核、稀少且高度空泡化的细胞质，并形成缺乏血窦或发育良好的肝板的簇。PH后3至10天，这些细胞的体积小且高度空泡状外观持续存在于肝脏再生的早期阶段（图1）到PH后14天，膨胀的结节状聚集物中的小肝细胞样细胞簇被组织成单细胞厚板，中间有窦状物，单个细胞缺乏早期细胞所特有的空泡状外观，与对照大鼠的肝细胞在形态学上无法区分（图1）.
在其出现时，小肝细胞样细胞表达肝细胞特异性分化标记物，包括白蛋白和转铁蛋白。在PH后5天，所有观察到的小肝细胞簇均明确表达白蛋白（图4A），转铁蛋白（图4B）和单克隆抗体H.4识别的肝细胞特异性抗原（图4C）此外，小肝细胞样细胞具有胆管（图4D）并储存糖原（图4，E和F）胆管标记物BD.1、BD.2和GST-π的单克隆抗体在任何时候都不能识别小的肝细胞样细胞。超微结构观察证实了这些细胞的肝细胞特异性表型（数据未显示）。透射电子显微镜显示小的肝细胞样细胞和形成良好的胆管之间紧密连接，在新出现的病灶中有微绒毛。单个小肝细胞样细胞具有丰富的线粒体、糖原花环、粗面内质网和过氧化物酶体（根据存在带结晶内含物的单膜细胞器进行鉴定）。
PH后5天逆转录酶暴露大鼠小肝细胞样细胞的表型特征。A-F：福尔马林固定、石蜡包埋的肝脏切片和固定的肝脏冷冻切片显示成簇的小肝细胞样细胞对肝细胞分化标记物染色阳性。答：间接免疫过氧化物酶分析显示小肝细胞样细胞簇呈蛋白阳性。B类：间接免疫过氧化物酶分析显示小肝细胞样细胞簇转铁蛋白阳性。抄送：间接免疫荧光分析表明，小肝细胞样细胞对肝细胞特异性单克隆抗体H.4识别的细胞表面抗原呈阳性。医生：肝冷冻切片上的ATP酶组织化学染色证明，小肝细胞样细胞具有形态良好的胆管。电子邮箱：PAS反应证明，小肝细胞样细胞含有丰富的细胞多糖。传真：通过唾液淀粉酶预处理，确定糖原是主要的多糖成分。棒材，50μm。箭头表示小的肝细胞样细胞。
小肝细胞与卵圆细胞的潜在血缘关系
逆转录酶/PH大鼠PH后3天，小肝细胞样细胞即表达肝细胞分化标记物（图5、C和D）。由于当时难以在冷冻切片中识别少量卵圆细胞标记阳性的小肝细胞，因此不可能在PH后3天确定是否存在卵圆细胞标志阳性的小细胞。然而，PH后5天，当小肝细胞在冰冻切片中很容易识别时，这些细胞的一个子集被卵圆形细胞标记OC.2的抗体修饰（图5A）OC.5（图5B）此时，大约30%的小肝细胞簇具有OC.2阳性细胞，15%具有OC.5阳性细胞。在每个阳性簇中，大约20%的小肝细胞样细胞对OC.2或OC.5呈阳性。连续切片检查表明，这些标记物在相同的小肝细胞亚群上共存，OC.5的表达在OC.2之前丢失。相比之下，仅逆转录病毒大鼠的所有OC.2阳性和OC.5阳性细胞都表现出卵圆细胞的形态学特征（数据未显示）。在任何时候，OV6都没有小肝细胞样细胞阳性。PH后7天，这些卵圆细胞标记物在小肝细胞样细胞中的表达消失。
涉及小肝细胞样细胞的潜在谱系关系。A类和B类：PH后5天逆转录酶暴露大鼠肝脏冷冻切片中卵圆细胞标记物OC.2和OC.5的间接免疫荧光分析。C类和医生：PH后第3天逆转录酶暴露大鼠肝切片上白蛋白和转铁蛋白的间接免疫过氧化物酶分析(A类)和OC.5(B类)卵圆细胞标记物，但对OV6不阳性。卵巢细胞标记物随后在PH后7天丢失。小的肝细胞样细胞在PH 3天后能够明确识别时，立即表达肝细胞分化标记物，白蛋白染色阳性(C类)和转铁蛋白(D类). 棒材，50μm。箭头表示小的肝细胞样细胞。
PH后小肝细胞完全恢复肝质量
逆转录酶暴露大鼠能够在PH后完全再生其肝脏重量（图6A）和肝脏/体重比（图6B）PH后5至30天内，小肝细胞样细胞在肝实质面积中所占比例增加，从而促进再生（图6C）逆转录酶/PH大鼠的肝脏重量在PH后14天内保持在3-4克左右。PH后第14天，小肝细胞样细胞增殖，按面积包围了近50%的肝实质，但该时间点的肝脏重量（平均=3.16克）与肝脏重量（均数=3.02克）无显著差异PH后1天(P（P）= 0.495). 逆转录酶/PH大鼠在肝再生早期（PH后0–14天）肝脏重量没有增加，这可能反映了大细胞肝细胞通过凋亡从实质持续丢失。在此期间，所有逆转录酶/PH大鼠的肝脏中都存在凋亡体，仅逆转录酶大鼠的肝中很少观察到凋亡体，而对照组和对照/PH大鼠肝中从未观察到凋亡。从PH后17至30天，逆转录酶/PH肝脏的大小逐渐增加，最终接近对照/PH大鼠的肝脏重量。在PH后30天，逆转录酶/PH组和对照/PH组之间的肝脏重量和肝脏/体重比率没有显著差异(P（P）=0.982和P（P）分别为0.294）。此时，小肝细胞样细胞的后代几乎占据了逆转录酶/PH大鼠的整个实质（87%按面积计算）。对照/PH大鼠的肝脏重量在3天后几乎翻了一番，基本上再生了10天，是逆转录酶/PH大白鼠的三倍（图6A）.
PH后，小肝细胞样细胞重建肝块。答：肝重量表明，PH后，小肝细胞样细胞的子代重建肝块。与对照组大鼠相比，完全重建的时间表延迟了，但基本上在PH后30天完成。B类：肝脏/体重比证明的肝脏质量重建。抄送：小肝细胞样细胞在肝实质中所占比例按面积递增。n个=每个时间点3–6个。误差线表示SEM。
讨论
逆转录酶诱导的肝细胞损伤严重损害了完全分化的大鼠肝细胞在手术PH后复制和参与肝质量恢复的能力，卵圆形细胞未发生显著增殖。然而，逆转录酶暴露的大鼠可以在PH后通过出现和扩大（新的？）群小肝细胞样祖细胞来替换其整个肝组织，这些细胞表达胎儿成肝细胞、卵圆细胞和完全分化肝细胞的一些表型特征，但各有明显差异。在其他以肝细胞复制受损为特征的肝损伤模型中，未发现小肝细胞样祖细胞激活、增殖和完全再生正常肝结构。在本研究中，我们描述了逆转录酶暴露大鼠肝脏再生的时间过程，并部分描述了所涉及的细胞类型。我们为PH后肝脏再生的新机制提供了证据，该机制通过在成年大鼠特定病理生理环境下参与肝组织修复过程的小肝细胞样祖细胞的选择性扩增介导。
小肝细胞样祖细胞表达独特的细胞表型
本研究中描述的小肝细胞样祖细胞与胎儿成肝细胞、卵圆细胞和完全分化的肝细胞具有一些表型特征，但各不相同（表1）完全分化的肝细胞（和逆转录酶/PH大鼠中的反应性衍生巨细胞）表达白蛋白、转铁蛋白和单克隆抗体H.4识别的抗原，储存糖原，并具有胆管，但不表达卵圆细胞（OV6、OC.2、OC.5、OC.4、OC.10）和胆管标记物（BD.1、BD.2）。E18-E20大鼠胚胎的胎肝母细胞（胎肝细胞）也表达这些细胞特征。8,33,42,43逆转录酶/PH大鼠PH后第7天，扩张簇中的小肝细胞样祖细胞表达细胞表型，与E18-E20胎儿肝细胞或成人肝肝细胞无明显区别（表1）然而，在此时间点之前（PH后5天），小肝细胞样祖细胞的一个子集也表达卵圆细胞标记物OC.2和OC.5（图5）这些标记物往往在较小集群的小肝细胞样祖细胞中瞬时表达，表明最早出现的细胞与较大细胞聚集物中的（更成熟的？）子代相比表现出不同的（更原始的？）表型。OC.2和OC.5的表达区分早期小肝细胞样祖细胞和完全分化的肝细胞。胆道上皮细胞表达所有检测到的卵圆细胞和胆管标记物，而逆转录酶暴露大鼠中增殖的卵圆形细胞表达OV6、OC.2、OC.5和BD.2（表1）因此，早期小肝细胞样祖细胞与胆管上皮细胞和卵圆细胞共同表达OC.2和OC.5。然而，多种肝细胞特异性标记物的表达和OV6阳性的缺乏清楚地将小肝细胞样祖细胞与胆管上皮细胞和卵圆细胞区分开来。小肝细胞样祖细胞的总体表型与双潜能E14成肝细胞和E18-E20胎儿肝细胞之间的过渡细胞类型的预期表型相似。43这些结果综合起来表明，小肝细胞样祖细胞与其他肝上皮细胞群具有多种细胞特征，但表达的总表型各不相同。
表1。
逆转录病毒素暴露大鼠再生肝和发育中肝细胞祖细胞反应细胞类型的表型比较
| 细胞谱系标记 | 肝细胞巨细胞* | 卵圆细胞* | 二苯醚* | 上海医药股份有限公司* | 早期未分化成肝细胞（E10）† | 双潜能成肝细胞（E14）† | 胎儿肝细胞（E18-20）† |
|---|
| 白蛋白 | + | +/− | − | + | − | + | + |
| 转铁蛋白 | + | − | − | + | − | + | + |
| H.4段 | + | − | − | + | − | − | + |
| 糖原 | + | − | − | + | − | − | + |
| 胆道 | + | − | − | + | − | + | + |
| OV6型 | − | + | + | − | − | − | − |
| OC.2公司 | − | + | + | +/− | − | + | − |
| OC.5号机组‡ | − | + | + | +/− | − | − | − |
| BD.1版 | − | − | + | − | − | − | − |
| BD.2版 | − | + | + | − | − | − | − |
| OC.4公司‡ | − | − | + | − | − | − | − |
| 10月10日‡ | − | − | + | − | − | − | − |
逆转录病毒暴露大鼠肝脏再生过程中可能存在的世系关系
与其他组织一样，肝脏的假定干样祖细胞尚未在显微镜下鉴定出来，也未从肝脏中分离出纯形式的干细胞，这部分反映了干细胞及其表型特征在很大程度上是直观的概念。8同样，在逆转录酶暴露大鼠的再生肝脏中，导致小肝细胞样祖细胞簇扩大的最终祖细胞尚未在当前研究中明确确定。然而，由小的肝细胞样祖细胞表达的表型可以提供关于它们的起源细胞或与成年肝脏的其他细胞的谱系关系的线索。相关细胞的一些可能候选细胞包括（i）已有的抗逆转录酶肝细胞群，（ii）增殖性胆管上皮细胞（卵圆细胞），或（iii）未知（新）干样细胞室。
小的肝细胞样祖细胞在细胞形态上与成熟的肝细胞相似，表达许多肝细胞特异性特征，并出现在小叶肝实质的不同部位。这些观察结果支持了这种可能性，即这些细胞可能来源于先前存在的抗逆转录酶肝细胞群。逆转录酶通过P450酶的作用代谢为毒性吡咯代谢物。44,45因此，缺乏适当P450酶表达或表达某些其他保护机制的细胞不会受到逆转录酶介导的细胞复制抑制，并且可以增殖以应对PH产生的肝损伤。鉴于分化肝细胞的广泛增殖能力，14-17少量抗逆转录酶肝细胞的存在可能是逆转录酶暴露大鼠肝脏再生活性的原因。然而，逆转录酶暴露大鼠PH后早期小肝细胞样祖细胞表达的卵圆细胞标记物OC.2和OC.5将这些细胞与成熟肝细胞区分开来。尽管尚未有文献记载，但在PH后暴露于逆转录酶的大鼠肝脏中，在病理生理条件下，增殖性（可能具有抗性）肝细胞可能表达卵圆细胞抗原。或者，这些抗原在小肝细胞样祖细胞中的表达可能反映了这些反应细胞与分化程度较低的干细胞之间的谱系关系。典型的卵圆细胞在逆转录酶肝再生模型中适度增殖，28,46表明它们（和/或它们的来源细胞）对逆转录酶的有丝分裂抑制作用具有抗性。先前的研究表明，卵圆细胞对多种不同的致癌物具有抵抗力，这些致癌物对成熟肝细胞具有有丝分裂抑制作用，因为缺乏致癌物激活的P450酶。47-50在使用这些有丝分裂抑制剂的肝再生模型中，包括改良的Solt-Farber肝癌模型40,50-52半乳糖胺坏死性肝损伤模型，19,39卵圆细胞大量增殖以再生肝实质。卵圆细胞起源于肝脏的门脉周围区域，被认为来源于门脉周围实质中的未分化干细胞群或增生性胆管。7,8,53这些细胞表达多潜能分化能力33并在适当的实验条件下产生肝细胞在体外54,55和体内.50,51因此，小肝细胞样祖细胞和卵圆细胞之间共享表型特征的表达可能反映了它们来源于共同的创始细胞（增殖性胆管上皮细胞或未分化干细胞）或直接的前驱-生殖关系。然而，这些细胞类型表达的整体细胞表型（表1）它们出现的小叶下部位证明了这些细胞类型的不同起源。最后一种可能性是，小的肝细胞样祖细胞可以代表一种新的上皮祖细胞群，不同于完全分化的肝细胞和成年大鼠肝脏的卵圆细胞，这在其他肝再生模型中尚不被认识。本研究的结果强烈表明，逆转录酶暴露大鼠PH后的肝脏再生通过一种以前没有描述过的新的细胞反应进行。然而，还需要进行额外的研究来识别细胞谱系关系，并确定该模型系统中小肝细胞样祖细胞的最终来源细胞。
小肝细胞样祖细胞可能与再生可移植肝细胞有关
PH后正常肝再生的研究表明，表达完全分化表型的成熟肝细胞可以复制足够的时间来恢复肝细胞数量和肝质量。10,12,56尽管如此，近年来，完全分化成人肝细胞的增殖能力一直是深入研究的主题。利用肝细胞损伤和肝细胞移植的转基因小鼠模型，几位研究人员已经产生了啮齿动物肝细胞具有广泛（可能无限）复制能力的证据。在白蛋白启动子增强子指导下在肝脏中表达尿激酶基因的转基因小鼠中，大多数肝细胞被有毒的转基因产物杀死，但一些残留的肝细胞使有毒的转基因失活并增殖，经历10到12个细胞分裂周期以产生离散的结节聚集物（克隆）重新填充肝实质。57同样，当将正常（未分化）肝细胞移植到这些转基因小鼠中时，子代肝细胞的结节会重新填充受损的肝脏。15,58在一个类似的实验系统中，Grompe和他的同事16检测了移植的正常（未分化）肝细胞对转基因小鼠肝脏的再生能力，这些转基因小鼠由于靶向性破坏了延胡索乙酰乙酸水解酶的第5外显子而缺乏酶活性法赫基因。59这些研究人员表明法赫-表达肝细胞比宿主表现出选择性生长优势法赫-缺乏肝细胞并有效地重新填充突变小鼠的肝脏。在这些研究中，估计移植的肝细胞在突变肝脏的重新填充过程中至少通过15次细胞分裂增殖。16在最近的研究中，这些研究人员通过一系列的移植、恢复和移植周期，检查了正常肝细胞的重新繁殖和增殖潜力，每次移植10三到106细胞。17在六个连续的恢复和移植周期中保持了完全的重新填充潜力，相当于自第一次移植以来移植细胞至少加倍86个细胞，假设每个移植周期的移植效率为15%。根据系列移植实验的结果，Overturf等人提出，移植肝细胞的一个子集，他们称之为再生可移植肝细胞（RTH），表现出很高的再生能力。17令人感兴趣的是，推测与本研究中确定的小肝细胞样祖细胞类似的细胞可能负责PA处理的肝脏的重新填充27和逆转录酶暴露28大鼠移植未分化的肝细胞，这些细胞可能是Grompe提出的RTH。17逆转录酶/PH大鼠中增殖的小肝细胞样祖细胞的后代形成不断膨胀的结节状细胞聚集体，最终取代大细胞（受损的肝细胞），并以与这些转基因小鼠模型中观察到的不可区分的方式重塑成具有正常结构的薄壁组织。15,17,57,58
