1型受体（CD120a）是可溶性肿瘤坏死因子的高亲和力受体

摘要

肿瘤坏死因子（TNF）是一种多效性细胞因子，是免疫和病理生理反应的主要介质。与许多其他细胞因子一样，在病理生理状态下体液中发现的TNF浓度通常很低(1,2). 培养细胞的各种细胞反应都可以由低浓度的微粒体甚至飞沫体TNF启动(三–6). 由于TNF与其细胞表面受体的结合是TNF应答的先决条件，因此应假设具有相同亲和力常数的TNF的高亲和力结合位点。

两种不同的TNF膜受体（TNF-Rs）的表观分子量分别为55–60 kDa（TNF-R1）和70–80 kDa。7). 这两种肿瘤坏死因子受体一直是激烈的生理和生化研究的对象。同样，TNF-Rs的配体结合特性也被广泛研究(8–11)尽管只有在克隆了这两个单独的受体分子之后，才能进行详细的分析。平衡结合研究¹²⁵I-标记TNF(¹²⁵I-TNF）在0°C下定义TNF与两种TNF-R的高亲和力结合K（K）_d日TNF-R1的值约为300–600 pM，TNF-R2的值为70–200 pM(12–18).

虽然大多数细胞系和原代组织同时存在这两种受体类型，但细胞对可溶性17-kDa形式TNF的反应似乎主要取决于与TNF-R1的相互作用(19–21). 另一方面，我们最近在不同的细胞系统中显示，26-kDa跨膜形式的TNF（跨膜TNF）而不是可溶性形式可以强烈刺激TNF-R2，这表明跨膜TNF-R2是TNF-R2的主要生理激活剂(22). 因此，TNF-R2对可溶性TNF诱导的细胞反应的贡献似乎主要是支持性或调节性的。在最近的一份报告中，TNF–TNF-R2结合和解离的快速动力学被视为假设一种称为“配体传递”的模型的基础，在该模型中，结合TNF-R2的配体可以传递给TNF-R1，以增强TNF-R2信号传递(23). 因此，在同时存在这两种受体的细胞中，TNF与TNF-R1的有效结合率将显著增加，这解释了低TNF浓度足以触发细胞反应的原因。然而，对于仅表达TNF-R1的细胞，也可以证明其对TNF具有相当显著的细胞敏感性(24)如此低的TNF浓度如何有效的问题尚未解决。

在本研究中，我们检测了37°C时TNF-R1和TNF-R2对可溶性TNF的结合亲和力，因此类似于生理条件。离解常数的测定(K（K）_d日)通过在37°C下测量各自的结合/解离速率，与在0°C下的结合研究相比，TNF与TNF-R1的结合亲和力显著更高。从这些数据可以明显看出，TNF-R1，而不是TNF-R2，是可溶性TNF的高亲和力受体，这为TNF R1在可溶性TNF诱导的细胞反应中的主要作用提供了理论依据。

材料和方法

结果

37°C下TNF结合动力学参数的测定。

通过0°C下的稳态结合实验，对两种TNF-R的TNF结合亲和力进行了广泛研究。为了阐明TNF与两种TNF-R在更多生理条件下的相互作用，我们在37°C下进行了结合研究。然而，由于37°C下的平衡饱和等温线受到次要事件的影响，如配体介导的受体内化和受体周转，配体-受体亲和力（表示为解离常数，K（K）_d日)根据独立确定的关联和分离率计算。为了独立研究TNF与两种受体结合的动力学，我们使用HeLa细胞，几乎只表达TNF-R1(19,20)和KYM-1细胞，主要（>90%）表达TNF-R2(17).

的折扣率¹²⁵通过置换实验测定TNF-R1和TNF-R2中的I-TNF。将HeLa和KYM-1细胞与放射性标记配体在0°C孵育1.5小时后，将细胞快速转移到含有过量未标记配体的预热（37°C）培养基中，然后减少细胞结合¹²⁵跟踪I-TNF。这些实验在不到8分钟的时间内进行，其中配体内化被控制在总配体结合量的15%以下。所有值都针对非特定绑定进行了更正。图中的数据。​图11A类显示TNF与TNF-R2快速分离，半衰期为1.1分钟(k个_远离的值0.631±0.241 min⁻¹,n个=4），结果与之前的研究一致(22). 相反，TNF与TNF-R1的分离（图。​（图11A类)发现速度非常慢(t吨½=33.2分钟；k个_远离的值=0.021±0.009分钟⁻¹,n个= 7).

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图1

解离和缔合动力学¹²⁵37°C下的I-TNF结合。(A类)约4×10⁵KYM-1细胞（□，每个细胞约30000 TNF-R2）和HeLa细胞(▪, 每个细胞约3000个TNF-R1）与抗TNF-R1-抗体H398（KYM-1）预先孵育或不处理（HeLa），然后与300 pM的¹²⁵I-TNF在4°C下持续1小时。随后¹²⁵在37°C下，将TNF-Rs中的I-TNF稀释为未标记TNF的200倍，并通过在指定时间点通过一层邻苯二甲酸盐油离心细胞来测定细胞结合放射性。所示为典型实验（KYM-1，n个= 4; HeLa，n个=7）在时间0时，KYM-1和HeLa细胞分别具有31535 cpm和2017 cpm的特异性结合。非特异性结合分别为3482 cpm和182 cpm，已减去。(B类)缔合动力学4.5×10⁵HeLa细胞(▪) 和KYM-1细胞（□）在37°C下以300 pM孵育不同时间¹²⁵I-TNF。然后通过邻苯二甲酸盐油离心细胞，去除未结合的配体，并测量细胞结合放射性。典型实验（KYM-1，n个= 4; HeLa，n个=7）分别显示了KYM-1和HeLa细胞的41640 cpm和2451 cpm的最大特异结合。减去在存在60 nM未标记TNF的情况下测定的非特异性结合。通过数据的连续曲线A类和B类通过使用单指数时间依赖性曲线从最佳拟合参数值计算。

图。​图11B类显示了¹²⁵I-TNF，并证明TNF与两种TNF-Rs结合的动力学非常迅速，与TNF-R1的关联比与TNF-R2的关联稍慢。净关联率(k个_{光突发事件})0.34分钟⁻¹和1.49分钟⁻¹对于TNF-R1和TNF-R2，分别通过最佳拟合单指数时滞图从数据中计算。利用0.1–1.6 nM的TNF浓度进行了类似的关联动力学实验（数据未显示）。所得实验观察到的净缔合速率、碘化配体浓度[L]和各自的离解速率常数用于计算缔合速率常数。推导值为1.1±0.2×10⁹(n个=7）对于TNF-R1和1.5±0.6×10⁹M（M）⁻¹●最小值⁻¹(n个=4）对于TNF-R2。结合和解离速率常数用于计算K（K）_d日值，描述TNF-R1和TNF-R2对TNF的亲和力。派生的K（K）_d日值为4.2×10⁻¹⁰TNF-R2和1.9×10的M⁻¹¹M代表TNF-R1。最值得注意的是，在生理温度下，与在0°C下进行的平衡结合研究相比，TNF-R1对TNF的亲和力大约高出20倍（见上文）。

为了进一步证实TNF对TNF-R1的高亲和力，我们采用了两种额外的实验方法来确定动力学常数。首先，我们测量了37°C下TNF与HeLa细胞的净结合率，作为不同TNF浓度的函数（图。​（图2A2A插图). 产生的结果k个_{光突发事件}正如双分子反应所预期的那样，数值与所使用的TNF浓度线性相关（图。​（图22A类). 在该图中，纵坐标上的截距表示离解速率常数，斜率等于离解速率常量(27). 三个独立实验得出的平均值为0.039±0.012 min⁻¹对于离解速率常数和1.01±0.10×10⁹M（M）⁻¹·最小值⁻¹关联速率常数，因此与上述实验中获得的值非常一致（图。​（图1）。1).

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图2

测定缔合和解离速率常数的替代方法。(A类)用HeLa细胞进行关联实验，如图所示。​图11通过使用各种¹²⁵I-TNF浓度（100、200、400、800和1600 pM）(插入). 获得的净关联率值与¹²⁵I-TNF浓度最初存在于测定中，以确定解离速率常数（纵坐标截距）和缔合速率常数（斜率）。所示为典型实验(n个= 3). (B类)HeLa细胞在37°C和250 pM下培养¹²⁵I-TNF以获得所示的关联动力学(▪). 孵育2、5和7分钟后（箭头所示），在预加热的结合缓冲液中向等分试样补充200倍多余的未标记TNF，并额外跟踪细胞结合放射性7分钟（○）。穿过数据的虚线曲线表示根据图所示实验获得的离解速率常数计算出的离解动力学。​图11。

其次，我们在37°C下用碘化配体短期培养细胞后，跟踪TNF的分解过程。进行这些实验是为了更严格地排除观察到的TNF从TNF-R1中缓慢解离动力学是由人工制品引起的，这是由于细胞与放射性标记配体在冰上预孵育或随后温度移到37°C所致。因此¹²⁵在关联时间过程的2、5和7分钟后，添加过量的未标记TNF可诱导I-TNF（图。​（图22B类). 该实验装置中的数据证实了TNF与TNF-R1的缓慢分离。

因此，这些数据表明，TNF-R1而非TNF-R2是可溶性TNF的高亲和力受体。此外，这些发现强调了在生理条件下分析细胞因子结合参数以确定相关亲和力值的重要性。不同的原因是什么K（K）_d日在0°C和37°C下获得的值？首先，我们已经证实，通过平衡结合研究直接测定和通过动力学实验计算这两种技术显示出相似的结果K（K）_d日0°C时的值。特别是，0°C下的动力学参数为0.037 min⁻¹(k个_远离的)和5.9×10⁸M（M）⁻¹●最小值⁻¹(k个_在)对于TNF-R2和0.0015分钟⁻¹(k个_远离的)和1.3×10⁷M（M）⁻¹●最小值⁻¹(k个_在)对于TNF-R1。计算结果K（K）_d日数值为6×10⁻¹¹TNF-R2和1×10的M⁻¹⁰与7–20×10相比，TNF-R1为M⁻¹¹TNF-R2和3–6×10的M⁻¹⁰通过0°C下的平衡饱和结合研究确定TNF-R1的M(12–18). 有趣的是，在0°C时，TNF与TNF-R1的分离速度也很慢，因此需要约40小时的孵育时间才能达到0°C下的平衡结合。因此，大多数出版物K（K）_d日从冰上进行的平衡结合研究中获得的值可能被低估了。总之，在0°C和37°C下测量的TNF-R1对TNF的亲和力值不同的主要原因在于TNF与TNF-R1的结合率不同（84倍）。更重要的是，37°C时TNF与TNF-R1和TNF-R2结合的差异主要是由不同的解离动力学引起的。

TNF-R1/TNF-R2-共表达细胞上的TNF结合参数。

由于大多数细胞同时表达两种TNF-R，我们很想知道是否可以检测到影响上述配体结合特性的某种类型的受体干扰。组织细胞系U937的细胞已被广泛研究TNF–TNF-R相互作用，以约2:1的比例共表达TNF-R2和TNF-R1，并已被证明对TNF介导的通过TNF-R1而非TNF-R2的作用唯一敏感(19,28,29). 首先，我们通过用受体特异性Fab片段预孵育U937细胞，然后测量TNF-R1和TNF-R2的分离率和结合率，分别分析了TNF-R2与TNF的结合动力学¹²⁵37°C时的I-TNF。获得的离解速率（图。​（图3三A类)和关联率（图。​（图3三C类)U937细胞上的TNF-R1和TNF-R2与HeLa和KYM-1细胞上的测定结果相似，表明TNF-R1和TNF-R2的结合特性不是细胞特异性的。

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图3

U937细胞上的TNF结合动力学，共表达TNF-R1和TNF-R2。U937电池（1×10⁶细胞）与受体特异性抗体在冰上预孵育1小时(A类和C类)或未经治疗(B类和D类).¹²⁵细胞与TNF-R1的I-TNF解离及结合动力学(▪), 如图所示，在37°C下进行TNF-R2（□）或两种受体（）的检测。​图1。1.通过数据的连续曲线是通过使用单指数时滞曲线从最佳拟合参数值计算得出的(A类和C类)或两相指数时滞曲线(B类)图中给出了得到的速率常数。穿过数据的虚线D类表示基于TNF-R1和TNF-R2各自的净结合率计算的双相指数结合动力学(C类). 所示为典型实验(n个= 3).

接下来，我们分析了U937细胞上的TNF关联和解离时间过程，没有阻断任何一个TNF-R。解离曲线被发现是双相的，因为数据点的最佳非线性回归产生了双相指数衰减的最佳结果，指示值为k个_{关闭（1）}和k个_{关闭（2）}（图。​（图3三B类). 因此，可以观察到两个独立的结合位点，它们最可能代表TNF-R1和TNF-R2，这是从两个发现中得出的结论。(我)两者都派生k个_远离的当单独分析受体时，这些值与离解速率常数密切相关（图。​（图3三A类). (ii（ii）)根据两个重叠离解曲线的非线性回归拟合计算出的跨距[11370 cpm用于跨距（1），5284 cpm用于跨度（2）]对应于¹²⁵I-TNF与两个单独的受体群结合。这可以通过在0°C下与受体特异性抗体平行进行的竞争结合试验来证明，该受体特异性血清可竞争10510 cpm（TNF-R2特异性抗体）和5052 cpm（TNF-R1特异性抗体¹²⁵I-TNF绑定。因此，这些关于U937细胞的动力学数据表明，正如在0°C下进行的研究所表明的那样，两个TNF-R在37°C下的独立解离过程(23).

37°C下TNF与U937细胞的结合实验数据（两种受体都可用）没有显示出明显的双相指数配体结合。这是因为37°C时TNF-R1和TNF-R2的单个TNF净结合率相似（图。​（图11B类和​和3三C类). 然而，使用TNF-R1和TNF-R2各自的净关联率计算出的两相关联曲线取自图。​图3三C类与U937电池上的实验测量数据点非常吻合（图。​（图3三D类)因此，论证了37°C时TNF与单个TNF-R的独立关联动力学。

LT的生物活性与TNF-R1的解离速率相关。

LT（以前也称为TNF-β）已被证明与两种TNF-R结合，但在人类细胞的许多TNF-R1依赖性细胞反应中，其生物效力显著较低（例如，见参考文献。24,30–32). 图中显示了一个示例。​图44A类与TNF相比，LT在诱导HeLa细胞细胞毒性方面的生物活性大约低10倍。迄今为止，这些发现与从0°C平衡结合研究中得出的TNF和LT与人TNF-R1结合的类似离解常数不一致(18,33,34). 然而，就目前的研究而言，很容易推测LT与TNF-R1在生理温度下的不同结合特性。事实上，与人HeLa细胞的解离结合动力学显示LT从人TNF-R1中解离的速度大约快8倍(k个_{关闭（LT）}=0.157±0.029分钟⁻¹;n个=6）与TNF相比（图。​（图11A类和​和44C类). LT和TNF与人TNF-R1的关联率差异不太明显，净关联率为0.22±0.01 min⁻¹(n个=3）对于LT和0.39±0.02 min⁻¹(n个=3）当使用350 pM的相应放射性标记配体时，用于TNF。这些数据表明，TNF和LT对人类细胞生物活性的差异主要在于TNF-R1的不同脱落率。

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图4

TNF和LTα在人和小鼠细胞上的生物活性和分离率的比较。在人HeLa细胞上滴定TNF（•）和LTα（○）(A类)和小鼠MethA细胞(B类)在标准细胞毒性试验中。注意，2 nM LTα无法达到TNF的全部细胞毒性作用。The dissociation rates of¹²⁵I-TNF（•）和¹²⁵来自HeLa细胞的I-LT（○）(C类)和MethA细胞(D类)如图所示确定。​图1。1所示为典型实验（HeLa，n个= 6; 方法A，n个= 3).

根据上述推理预测，在TNF和LT具有类似生物活性的细胞系统中，两种细胞因子在37°C时应显示类似的动力学结合参数。因此，我们分析了已经证明人LT和人TNF只与小鼠TNF-R1结合而不与小鼠TNF-R2结合的小鼠细胞，更重要的是，揭示了类似的生物活性(三,31,34). 事实上，在小鼠细胞系MethA中（图。​（图4）4)和L929（数据未显示），人LT和人TNF在诱导细胞毒性方面同样有效（图。​（图44B类)并在37°C下分析时显示出类似的解离动力学（图。​（图44D类).

讨论

一般来说，细胞因子以浓度依赖的方式发挥作用。细胞内信号启动的先决条件是配体与受体的结合，这种结合也遵循类似的浓度依赖性，这表明了因果关系。平衡结合研究通常用于表征给定配体/受体系统的亲和力。为了防止配体-受体复合物内化或脱落等二次反应，这些实验通常在0°C下进行。然而，这种实验方法只有在结合和解离动力学（以及K（K）_d日值）与生理温度下的值相似。

对于TNF系统，通过平衡结合研究在0°C下获得的离解常数对于TNF-R1通常在300-600 pM范围内，对于TNF-R2通常在70-200 pM范围之内（见上文）。然而，这些实验值与细胞对不同TNF反应的非凡敏感性不同。例如，肿瘤坏死因子的细胞毒性作用或转录因子NF-κB的激活可由低浓度的微粒体或甚至是股骨微粒体的肿瘤坏死因子诱导(三,4,6,24). 换句话说，如果K（K）_d日在0°C的平衡结合研究中得出的值被用作计算在如此低的TNF浓度下TNF-R所占百分比的基础，这意味着在受体占位小于1%时，细胞对TNF已经产生了显著的反应(三,24,35).

在此，我们检测了两种TNF-R在生理温度下的配体-受体结合特性。不同的实验方法得到了关于两个TNF-R分子的生理配体亲和力的一致图片。在图中所示的实验中。​图1，1，我们直接测定了放射性标记TNF对每个受体的结合和解离动力学，并计算了常数k个_在和k个_远离的其中。由于动力学较慢，通过曲线拟合精确测定TNF-R1的解离速率常数很困难。因此，我们用第二种方法测定了结合率和解离率，如图所示。​图22A类，测量关联率与TNF浓度的相关性。这两种方法得出了可比较的值。因此，这些结果有力地证明，在生理温度下，TNF-R1而非TNF-R2是可溶性TNF的高亲和力受体。

因此，我们的研究很容易解释为什么大多数细胞对可溶性TNF的反应主要由TNF-R1控制，即使有相当数量的TNF-R2共存。当考虑到两种TNF-R的不同亲和力时，低微粒体浓度的TNF可以有效触发TNF-R1，但作为信号分子的TNF-R2的积极参与需要明显更高的配体浓度。例如，在给定的TNF浓度为10 pM时，34%的TNF-R1将在平衡状态下结扎，但只有2%的TNF-R2。可以想象，在这些条件下，TNF-R1可以诱导显著的细胞反应，但TNF-R2不能仅仅因为亚临界配体相互作用有限而这样做。

最近，以0°C下TNF的缔合和解离动力学研究为基础，建立了一个模型，在该模型中，TNF-R2由于其快速开关速率，将TNF分子传递给TNF-R1(23,36). 该模型可能解释了为什么在低TNF浓度下，TNF-R2特异性抗体可以在某些TNF反应中作为拮抗剂，其中只有TNF-R1具有功能(23). 然而，对这一现象也可能存在其他可能的解释，例如，异聚TNF-R复合物的形成(37). 另一方面，在37°C时，TNF-R1和TNF-R2在配体结合和解离方面彼此没有实质性影响（图。​（图3）三)宁愿反对此类复合体中占主导地位的一部分。无论如何，TNF-R1依赖性细胞对TNF的超敏反应并不一定依赖于TNF-R2分子“配体传递”的存在，因为这种敏感性也存在于仅表达TNF-R2的细胞系中。

两个TNFR分子结合特性的一个重要方面是TNF与TNF-R1和TNF-R2的分离速率之间的显著差异（图。​（图11A类). 该参数代表了可逆条件下各个配体-受体系统的真实物理常数，TNF-R2的该参数是TNF-R1的30倍（图。​（图11和​和2）。2). 因此，TNF–TNF-R1复合物具有非凡的稳定性(t吨½=33.2分钟），而配体迅速从TNF-R2中解离(t吨½=1.1分钟）。这些值对应于单个配体-受体复合物的平均生存时间47.9分钟（TNF-R1）和1.6分钟（TNF-R2）。

然而，在重要细胞的生理条件下，由于次级反应，主要是配体-受体复合物的内化和/或脱落，不会发生真正可逆的配体结合。因此，本研究中确定的离解率可能会因二次反应而产生偏差。事实上，已有研究表明，结扎后TNF-R1主要内化，而TNF-R2迅速脱落(38,39). 然而，最近通过在可逆结合条件下使用纯化的可溶性受体IgG融合蛋白，提出了这两种受体在配体解离动力学上的主要差异(40). 因此，无论本研究中获得的完整细胞的离解常数值是否代表细胞膜上这些配体/受体系统的真实物理常数，或者这些值是否部分受到二次反应的影响，它们显然代表了生物学相关参数。因此，绝大多数TNF–TNF-R1复合物很可能被内在化(t吨½=10–20分钟；参考文献。8和41和未发布的数据），而不是取消关联(t吨½=33分钟），可以有效形成信号复合物，甚至可以在细胞内以活性状态持续较长时间。另一方面，TNF-R2复合物的形成更为短暂，可能由于配体分离和受体脱落而限制了信号传递。

因此，这种推理表明配体-受体复合物的不同稳定性是决定TNF-R信号能力的重要参数。这一论点得到了不同研究结果的支持。首先，我们最近观察到，通过单克隆抗体稳定TNF–TNF-R2复合物导致通过TNF-R2强烈增强可溶性TNF的信号传递效力。同时，我们可以证明TNF-R2可以被跨膜TNF而不是可溶性TNF强烈刺激。这两种药物（即跨膜TNF和可溶性TNF加稳定抗体）都能够诱导TNF反应，其数量和质量是可溶性TNF饱和浓度所无法诱导的(22).

其次，我们在此研究了LT与TNF-R1和相应的小鼠同源物（muTNF-R1）结合的动力学关联和解离参数。长期以来，可溶性同三聚体LT分子的生理作用一直是一个深入研究的课题，目前仍存在争议(32). 这主要是基于这样一个事实，即尽管LT在生理条件下比TNF更稳定(34)诱导或多或少与TNF相同的细胞反应模式，但生物活性较低。同样，饱和LT浓度无法诱导高浓度TNF容易获得的最大响应（参考文献。32和33和图。​图44A类). 然而，在小鼠细胞上，人LT的生物活性与人TNF相似（图。​（图44B类). LT的这种生物活性模式与在0°C下测定的配体-受体亲和力不对应（数据未显示），但与相应LT-受体复合物的稳定性密切相关（图。​（图44 B类和C类).

观察到的配体-受体复合物的平均存活时间如何以定量甚至定性的方式确定信号传递？这可能取决于二次反应，可能取决于更高受体聚集体的形成或构象变化(42). 事实上，x射线晶体学分析表明，TNF-R与配体的化学计量比为3:1(43). 此外，还提出了无隔离TNF-R1的两种可能的第四纪结构布置(44). 这些可能性中的每一个都预计TNF-R1与TNF三聚体的相互作用是一个耗时且依赖温度的过程。因此，构象过程以及生理活性过程可能影响TNF-R1的配体结合特性是合理的，这也为在0°C和37°C下进行的TNF结合研究的不同结果提供了理由。

最后，配体-受体复合物的稳定性将直接影响信号分子与连接受体细胞质尾部的结合，如TNF家族另一成员APO-1/Fas抗原所示(45). 由于两种TNF-R都没有任何酶活性，因此受体连接后细胞信号的启动也依赖于细胞质蛋白的结合。事实上，最近已经鉴定出几种能与TNF-R1和TNF-R2结合并参与这些受体信号转导的蛋白质(46–49). 可以想象，这种细胞质信号复合物的形成是一个时间依赖的过程，并且这种受体相关因子的动力学可用性可能控制单个配体的相应细胞敏感性。

致谢

脚注

工具书类