泛素是一种高度保守的蛋白质，有76个氨基酸残基，可以在翻译后附着到其他蛋白质上（综述见参考文献）。1——三). 该反应涉及泛素的羧基末端甘氨酸残基和受体蛋白的赖氨酸残基的ɛ-氨基之间形成异肽键。泛素的所有已知功能，包括其在选择性蛋白质降解中的作用，都被认为是通过这种反应介导的。泛素结合通过涉及泛素激活（E1）和泛素结合（E2）酶以及泛素-蛋白质连接酶（E3）的反应级联进行。E1酶水解ATP，并在其活性位点的半胱氨酸残基和泛素的羧基末端之间形成高能硫酯中间体。泛素随后被传递给E2酶，E2酶以类似的方式与泛素形成硫酯。最后，泛素通过E2酶或E3酶共价连接到底物蛋白，如观察到至少一些E3酶通过硫代酯的形成被E2酶负载泛素(4).
酵母酿酒酵母基因组包含几个编码推测E1酶的同源基因(UBA公司基因）。UBA1公司对生存能力至关重要，并编码泛素结合所需的激活酶(5).UBA2（UBA2）也是生存所必需的，编码一种较小的蛋白质，其半胱氨酸残基位于与UBA1活性位点半胱氨酸类似的位置(6). A类uba2该突变体表达一种不含半胱氨酸的蛋白质，是不可见的，表明这种保守的残基也参与了硫酯的形成。然而，令人惊讶的是，纯化的UBA2未能与泛素形成硫酯复合物，这表明它可能在不同的途径中发挥作用(6). 事实上，UBA2最近被证明与另一种被称为AOS1的蛋白质合作激活SMT3，SMT3是一种含有98个氨基酸残基的蛋白质，与泛素的序列相似性为17%(7). 有趣的是，同样由一个必需基因编码的AOS1和UBA2分别与UBA1蛋白的氨基和羧基末端结构域显示出序列相似性。这表明在异二聚化时，UBA2和AOS1在SMT3的激活中类似于E1酶(7).
与泛素类似，SMT3是游离的或共价连接在其他蛋白质上(7). 因为null突变体表面贴装3,uba2，或aos1这种类泛素分子的结合物是不可见的，有望发挥重要的细胞作用。SMT3结合的功能目前尚不清楚，但最近的证据来自对一种相关哺乳动物蛋白SUMO-1的研究[参考文献。8也称为GMP1(9)，PIC1(10)，UBL1型(11)或sentrin(12,13); 有关审查，请参阅参考。14]提示它可能在蛋白质定位中起作用。SUMO-1与SMT3具有50%的序列同源性，被发现与RanGAP1共价连接，Ran GTPase的激活蛋白参与调节核质转运(8,9). SUMO-1与RanGAP1的结合将细胞溶质蛋白靶向核孔复合体。因此，SUMO-1及其酵母同源物SMT3可能作为翻译后添加的靶向设备，将共轭底物导向不同的细胞隔室。
13种不同的E2酶基因(UBC公司基因）已经在酵母基因组中被鉴定(三,15). 编码酶是相关蛋白质，含有高度保守的（～160个氨基酸），即所谓的UBC结构域(15). 在这个域中，E2酶具有一个特定的半胱氨酸残基，被认为在泛素E2酶硫酯形成中起作用。酵母E2酶参与多种细胞功能，包括体蛋白降解、抗应激、镉耐受、DNA修复、过氧化物酶体生物生成和细胞周期进展(15). 泛素通过这些酶结合通常以蛋白酶体降解的蛋白质底物为目标。遗传学研究表明，在13种酵母中UBC公司只有两个基因对生存能力至关重要：UBC3（UBC3）和UBC9公司UBC3蛋白，也称为CDC34，是G所必需的1–S细胞周期转换和靶向（以及其他底物）细胞周期调节器SIC1和G1泛素/蛋白酶体依赖性降解的细胞周期蛋白CLN1和CLN2(三). 相反，抑制UBC9合成阻止细胞周期在G2或M期早期，导致具有单个细胞核、短纺锤体和复制DNA的大芽细胞积聚(16). 在ubc9号机组发现突变株CLB5（S期细胞周期蛋白）和CLB2（M期细胞周期素）均稳定(16).
我们现在报道UBC9及其哺乳动物同源物是用于SMT3/SUMO-1结合的E2酶。酵母细胞突变UBC9公司无法形成SMT3共轭物体内此外，我们还表明，酵母和哺乳动物UBC9可以分别与SMT3和SUMO-1形成硫酯络合物。因此，UBC9是SMT3途径的一部分，与UBA2–AOS1酶异二聚体一起在SMT3结合中发挥作用。数据进一步表明，观察到的缺陷ubc9型细胞周期进展和细胞周期蛋白降解中的突变可能是SMT3蛋白结合缺陷和可能的核质转运的结果。
材料和方法
酵母菌株和培养基。
酿酒酵母菌株生长在含有2%葡萄糖、2%棉子糖或2%半乳糖作为碳源的富含（YP）或合成（S）培养基中。酵母转化是通过标准方案进行的(17). 在缺乏尿嘧啶的选择性培养基上选择转化子（SD，−ura）。野生型（WT；DF5）和ubc9–1号机组温度敏感突变体如下所述(16). 菌株YWO61(材料α,his3、leu2、lys2、trp1、ura3、ubc2(放射性6)∷HIS3型)是一个ubc2型(放射性6)无效突变体。
质粒和蛋白质表达。
这个SMT3型基因（GenBank登录号。{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“U27233”，“term_id”：“881371”，“term_text”：“U27233“}}u2723欧元)以基因特异性引物和基因组酵母DNA为模板，通过PCR进行克隆。生成的322-bp产品在之后被克隆千磅我和Pst（磅/平方英尺）限制性内切酶消化为YIplac211的衍生物(18)包含镀锌1–10三重血凝素（HA）标签前的启动子和ADH1（ADH1）转录终止子。所得质粒pKM092在两条链上测序，并在URA3公司基因依据生态RV消化，以便与尿酸3变换后的轨迹。对于细菌表达SMT3型cDNA（氨基酸1-98）克隆到pGEX-2TK（5′巴姆HI和3′Sma公司我；见下文）。通过使用来源于HeLa细胞的细胞质RNA，编码SUMO-1的cDNA[ORF的氨基酸1-97(8,9)]通过逆转录和PCR扩增进行克隆。PCR产物克隆到pGEX-2TK（5′巴姆HI和3′Sma公司一） ●●●●。
谷胱甘肽S公司-转移酶融合蛋白（SMT3、SUMO-1和泛素）表达于大肠杆菌DH5α，在谷胱甘肽-Sepharose（Pharmacia）上亲和纯化，并在[γ-32P] 列车自动防护系统(19). 用10 mM谷胱甘肽洗脱放射性标记的融合蛋白，并用凝血酶（Novagen）裂解，分别产生游离SMT3、SUMO-1和泛素。切割后，凝血酶在75°C孵育15分钟后失活。使用放射性标记的切割产物（SMT3、SUMO-1和带有氨基末端蛋白激酶A磷酸化位点的泛素）进行硫代酯实验。
对于细菌表达，cDNA编码酿酒酵母分别用PCR扩增UBC9、突变蛋白UBC9-C93S和小鼠mUbc9，用Nde公司我和巴姆HI，并克隆到pET-3a中。用于PCR的质粒已被描述(16,20).酿酒酵母UBC9和UBC9-C93S、mUbc9和人UbcH5在大肠杆菌BL21（DE3）(21). 这个酿酒酵母UBC2(RAD6型)已经描述了表达质粒(22). 在硫酯分析中，粗细菌提取物被用作不同E2酶的来源。
蛋白质程序。
酵母蛋白提取物的制备基本上按照所述进行(22). 粗提取物用作SMT3激活酶的来源，用于硫酯分析。对于蛋白质印迹分析，在12%SDS-PAGE凝胶上分离等量的蛋白质，然后在聚（偏二氟乙烯）膜上印迹。按照标准ECL方案，用1:300稀释的抗HA单克隆抗体（12CA5）组织培养上清液培养，然后用过氧化物酶偶联抗鼠IgG培养，检测HA标记蛋白。作为SUMO-1激活酶活性和泛素激活酶的来源，从汇合的NIH 3T3细胞在1%Nonidet P-40/20 mM Tris-HCl中制备蛋白质提取物，pH 8.0/100 mM NaCl/1 mM DTT/抑肽酶（1μg/ml）/亮氨酸蛋白酶（1μg/ml）/0.01%苯甲基磺酰氟中。用10个10厘米的细胞板制备的提取物在1毫升Mono Q柱上进行色谱分析。用25 mM Tris●HCl（pH 7.6/50 mM NaCl/1 mM DTT）清洗柱，用400 mM Na Cl在25 mM Tris●HCl中洗脱结合蛋白，pH 7.6/1 mM DTT。
硫醇测定。
不同E2酶的硫酯加合物的形成如所述(21). 反应混合物包含20μg酵母提取物或10μg NIH 3T3细胞提取物的Mono Q组分、500 ng各自的E2和300 ng32P标记的SMT3、SUMO-1或泛素，存于20 mM三氯化钠中，pH 7.6/50 mM氯化钠/4 mM三磷酸腺苷/10 mM氯化镁2/0.2 mM DTT。在25°C下培养5分钟后，通过在30°C下将混合物在50 mM Tris●HCl中培养15分钟，pH 6.8/4 M尿素/2%SDS/10%甘油中，或通过在含有100 mM DTT而非尿素的上述缓冲液中煮沸混合物来终止反应。反应混合物在4°C的14%SDS/PAGE凝胶上分离，并通过放射自显影术显示放射性标记带。
结果
SMT3结合需要酵母UBC9在体内.
研究酵母SMT3与细胞蛋白的结合体内，SMT3蛋白用HA表位的三个拷贝进行氨基末端标记(哈SMT3）。将编码该融合蛋白的基因置于诱导型镀锌1–10启动子并整合到酵母基因组中。当在WT酵母中表达时，使用抗HA抗体对总细胞提取物进行的Western blot分析显示，表达的蛋白质大小与哈SMT3。此外，还观察到其他一些大小从～40到100 kDa以上的抗-HA反应蛋白（图。). 这些带很可能代表SMT3与不同细胞蛋白的结合(7). 与抗泛素蛋白印迹检测到的大量泛素蛋白结合物形成鲜明对比（数据未显示），SMT3结合物的底物数量似乎有限。
SMT3蛋白结合需要UBC9体内.重量，ubc9–1号机组、和ubc2型(放射性6)用携带HA标记SMT3基因的整合质粒转化细胞(哈SMT3）受诱导物控制镀锌1–10启动子。菌株在YPRaf培养基中预培养，然后转移到YPGal培养基中诱导哈SMT3基因在28°C下表达12小时。制备蛋白质提取物，并用抗HA抗体（12CA5）进行Western blot分析。哈SMT3单体表现为双峰。高分子量SMT3蛋白偶联物用括号表示。几乎没有哈SMT3共轭物可以在ubc9–1号机组突变细胞已经处于其允许温度（23°C）。
与泛素结合类似，除了异二聚体UBA2–AOS1复合物的E1活性外，SMT3结合还需要一种E2酶，该酶将活化的SMT3转移到细胞蛋白。这种酶的明显候选者是大型酵母UBC家族的成员。为了测试这种可能性，哈SMT3在不同的酵母细胞突变体中表达不同的酵母E2酶(ubc公司突变体）。在缺乏主要泛素结合酶的菌株中，包括UBC2（RAD6），SMT3结合没有发现差异（图。)和UBC4（数据未显示）。然而，SMT3蛋白偶联物在条件ubc9号机组尽管有突变哈SMT3在这些细胞中的表达水平相似（图。). 根据这些数据，我们得出结论，SMT3结合需要酵母UBC9 E2体内试验。与SMT3结合途径中的功能一致，UBC9酶是细胞生存所必需的（参见讨论).
酵母UBC9与SMT3形成硫酯体外.
酵母UBC9与其他E2酶具有35%的序列同源性，包括保守的假定活性位点半胱氨酸残基。该残基被其他氨基酸取代导致UBC9功能完全丧失体内(16). 由于放射性标记的UBC9与总酵母细胞提取物孵育导致ATP依赖性地形成硫代酯键UBC9蛋白加合物，我们先前得出结论，UBC9可以与泛素形成硫代酯类在体外(16). 然而，该试验没有区分由泛素或泛素样蛋白形成的UBC9硫酯。因此，根据上述结果，观察到的加合物可能代表UBC9与SMT3的复合物，而不是泛素。为了测试这种可能性，UBC9用大肠杆菌在酵母细胞提取物存在下，将细菌裂解物与放射性标记的SMT3和ATP孵育（图。). 作为对照，表达UBC2（RAD6）或ubc9号机组突变体(ubc9-C93S)其中假定的催化半胱氨酸残基被改为丝氨酸。如图所示。一，只有含有WT UBC9的细菌提取物介导了～30 kDa的放射性标记复合物的形成，与SMT3和UBC9之间加合物的大小一致。该络合物对还原条件下的沸腾很敏感，表明加合物确实通过硫酯键连接（图。b条). 此外，硫酯的形成取决于提供SMT3激活活性的酵母提取物（UBA2和AOS1）的存在（数据未显示）。这些发现表明，酵母UBC9可以与SMT3在依赖于UBA2/AOS1激活酶的反应中形成硫酯。与UBC9在SMT3共轭中的中心作用一致体内，E2酶是总酵母细胞提取物中唯一的内源性蛋白质，可以与SMT3形成硫酯复合物（图。; 比较车道2和6）。
SMT3和酿酒酵母UBC9.所含硫代酯反应32P-标记的SMT3，来自酵母WT（泳道2-5）或来自ubc9–1号机组突变株（6-8道）(16)以及从表达各种E2酶的细菌中提取的粗提物，如图所示（通道1仅显示SMT3；通道2和6，无细菌表达的E2酶）。ubc9-C93S酶是ubc9的一个突变体，其中位于93位的假定催化位点半胱氨酸残基被改变为丝氨酸。使用与考马斯蓝染色测定的E2酶数量相似（数据未显示）。在25°C下5分钟后，反应停止(一)或存在(b条)然后对产物进行SDS/PAGE，然后进行放射自显影。自由的位置32显示了P标记的SMT3和UBC9硫酯络合物。注意，在存在WT衍生的蛋白质提取物的情况下酿酒酵母检测到与重组UBC9的SMT3-硫代酯复合物（通道3）相结合的带（通道2、通道4和通道5）。因为在与来自ubc9–1号机组突变体（通道6），该条带可能代表SMT3与WT菌株提取物中存在的内源性UBC9的硫酯加合物。
小鼠UBC9与SUMO-1形成硫酯体外.
最近有研究表明，酵母UBC9的一种接近小鼠的同源物，称为mUBC9，可以弥补条件酵母的细胞周期缺陷ubc9号机组上述突变体(20). 此外，据报道，哺乳动物SMT3同源物SUMO-1可以与细胞蛋白共价连接(8,9,13). 因此，这表明，与酵母UBC9类似，mUBC9可能参与SUMO-1结合。为了验证这个假设，mUbc9表达于大肠杆菌并用SUMO-1和泛素（作为对照）进行硫酯形成试验。如图所示。在所用条件下，mUBC9确实能够与SUMO-1形成硫酯络合物，但不能与泛素形成硫酯配合物。相反，酵母UBC4/UBC5的人类同源物UbcH5的硫酯复合物形成(21)仅在泛素中观察到，而在SUMO-1中未观察到，表明了各自反应的特异性。此外，mUBC9与SUMO-1形成硫酯络合物的能力取决于可能提供SUMO-1激活活性的小鼠细胞提取物（数据未显示）的存在。尽管迄今为止尚未鉴定出小鼠SUMO-1激活酶，但生化研究表明，类似于酵母的SMT3激活酶(7)它不同于特性良好的泛素激活酶（S.E.S.和M.S.，未发表的结果）。
小鼠mUBC9与SUMO-1但不与泛素形成硫酯复合物。(一)32如图所示，P标记的SUMO-1与NIH 3T3细胞提取物和表达mUBC9（第3道）或UbcH5（第4道）的细菌的粗提取物衍生的Mono Q组分孵育（第1道仅显示SUMO-1；第2道没有细菌表达的E2酶）。使用类似量的相应E2酶，如通过考马斯蓝染色测定的（数据未显示）。在25°C下5分钟后，在没有或存在DTT的情况下停止反应，并进行SDS/PAGE，然后进行放射自显影。自由的位置32显示了P标记的SUMO-1和各自的E2硫酯加合物。(b条)类似于一但是32P标记的泛素与NIH 3T3细胞提取物和表达mUBC9（第2道）或UbcH5（第3道；第1道没有细菌表达的E2酶）的细菌提取物培养。星号标记的带可能代表泛素，泛素通过一个异肽键与UbcH5共价连接。注意，NIH 3T3 Mono Q组分包含激活泛素和SUMO-1所需的酶活性。然而，SUMO-1激活酶的活性与特征明确的泛素激活酶不同（数据未显示）。
讨论
泛素与细胞蛋白的结合以蛋白酶体介导的降解为靶点。然而，最近已经描述了泛素蛋白结合物的替代目的地。某些细胞表面蛋白的泛素化似乎通过内吞途径将这些底物导向溶酶体蛋白水解(23). 因此，可以假设泛素主要作为翻译后添加的靶向模块发挥作用，引导底物蛋白质进行蛋白水解破坏。有人建议(23)不同的命运（蛋白酶体与溶酶体介导的降解）由修饰的性质（即多泛素化与单泛素化）控制，但区别的分子机制仍然是个谜。
最近在所有真核生物中发现的泛素样蛋白质表明，通过共价连接其他蛋白质对蛋白质进行翻译后修饰似乎是一种比先前假设的更普遍的现象。干扰素诱导的蛋白UCRP可能局限于哺乳动物细胞，可以与其他蛋白共价连接，并似乎将其导向细胞骨架(24). 最近，发现酵母SMT3及其明显的哺乳动物同源物SUMO-1与一组独特的细胞蛋白形成偶联物。在哺乳动物细胞中，RanGAP1似乎是SUMO-1结合的主要底物(8,9). SUMO-1将这种细胞溶质蛋白附着到核孔复合体的RanBP2蛋白上，这是一种对核蛋白导入至关重要的反应。然而，RanGAP1的酵母同源物RNA1的表位标记形式似乎没有被SMT3缀合修饰（D.L.、K.M.和S.J.，未发表的数据）。SMT3结合物在酵母中的功能目前尚不清楚，但与SUMO-1结合物类似的功能有望实现，因为SUMO-1可以补充酵母表面贴装3空突变体(14).
本文分别将UBC9及其哺乳动物同源物mUBC9鉴定为酵母SMT3和哺乳动物细胞SUMO-1的结合酶（E2）。我们证明这些酶可以与泛素样蛋白形成硫酯复合物在体外重要的是，在酵母中ubc9号机组SMT3与其他细胞蛋白的突变结合明显被取消，表明UBC9在SMT3结合中起着关键作用体内与SMT3结合途径的其他蛋白质（即SMT3、UBA2和AOS1）一样，UBC9酶对生存能力至关重要。条件突变体表面贴装3或ubc9号机组在G处累积细胞2/非允许温度下细胞周期的M期(14,16). 此外，UBC9的缺失导致酵母B型细胞周期蛋白的稳定(16). 这种表型与SRP1（酵母α-导入蛋白）基因中的突变体惊人地相似(25)，和CSE1，在细胞周期蛋白稳定突变体的筛选中鉴定(26)带有假定的Ran装订图案(27). 因此，有理由推测，酵母中B型细胞周期蛋白的稳定性由SRP1/CSE1依赖性蛋白导入途径控制，而这又可能由SMT3/UBC9依赖性蛋白修饰事件控制。B型细胞周期蛋白的破坏通过泛素/蛋白酶体系统进行，并由一种称为后期促进复合物或环体的大蛋白复合物控制(26). 因此，一个有吸引力但有推测性的假设是，细胞周期调控的细胞周期蛋白破坏需要后期促进复合体/环体复合体的成分或激活剂的特定输入。
来自高等真核生物的UBC9同源物是SUMO-1偶联酶的间接证据来自最近的报道，证明了UBC9与SUMO-1的物理相互作用(11)和RanBP2，SUMO-1结合的RanGAP1结合的核孔复合体蛋白(28). UBC9也在许多与其他蛋白质的双杂交相互作用分析中被鉴定。其中包括非常有趣的分子，如腺病毒E1A(20)，人乳头瘤病毒16型E1蛋白(29)，IκB(30)，聚ADP核糖聚合酶(31)，p53(11)，E2A(32)，6月(33)，糖皮质激素受体(33)，Fas/CD95(34)、RAD51和RAD52(11,35). 然而，所有这些相互作用是否具有生物相关性仍有待证明。UBC9与RAD51的交互可能特别有趣(11,35)因为RAD51与乳腺癌易感基因产物BRCA1和BRCA2相互作用。此外，RAD51、BRCA1和BRCA2与UBC9在成对减数分裂染色体的突触复合体上共定位(35)这表明了一种有趣的可能性，即减数分裂的某些步骤是由UBC9介导的SUMO-1结合控制的。然而，UBC9功能的全貌必须等待整个UBC9目标集的识别和表征。
