血脑屏障上大中性氨基酸转运蛋白的选择性表达

摘要

大脑中的氨基酸可用性在调节大脑氨基酸代谢的几种途径中起着重要作用，包括神经递质合成、，秒-腺苷甲硫氨酸的生产和蛋白质合成(1). 必需氨基酸从血液到脑细胞内空间的运输涉及氨基酸通过两个串联的生物膜的运动：血脑屏障（BBB）和脑细胞（神经元、胶质细胞）的质膜。脑毛细血管内皮细胞质膜形成血脑屏障体内因为脑细胞膜的表面积比血脑屏障的表面积大几个数量级(2)，通过BBB的转运是氨基酸从血液向脑细胞内空间移动的速率控制步骤。

大的中性氨基酸通过BBB的转运由大的中性氨基转运体介导(1)类似于外周组织中的亮氨酸（L）优先系统，现在指定LAT为大型中性氨基酸转运蛋白(三). 然而，BBB的L系统具有更高的亲和力（更低K_米)与外周组织中的L-系统相比，氨基酸(1). 鉴于K_米L系统在外周组织中的含量在1–10 mM范围内K_米BBB L系统对大的中性氨基酸的转运约为10–100μM(4). 低水平的选择性表达-K_米BBB的LAT是大脑对高氨基酸血症病理效应选择性易感性的基础(1).

卡奈和同事(5)最近利用青蛙卵母细胞表达系统从C6大鼠胶质瘤细胞克隆了LAT1，该系统涉及4F2hc抗原mRNA的共注入。这些结果表明，大的中性氨基酸的转运是由4F2hc重链和LAT1轻链的异二聚体组成的系统介导的(5)类似于其他氨基酸转运蛋白(6,7). 这个K_米注入C6大鼠胶质瘤细胞LAT mRNA的青蛙卵母细胞的亮氨酸转运率较低，为18.1±3.4μM(5)，该值近似于K_米亮氨酸在BBB中的转运体内(4). 这种相似性K_米值表明LAT1或相关亚型可能介导大分子必需中性氨基酸通过BBB的转运体内因此，本研究描述了BBB LAT的分子克隆、测序、表达和Northern印迹，并表明该基因的表达约为其他组织（包括C6大鼠胶质瘤细胞）的100倍。

实验程序

牛脑毛细血管mRNA的分离和分离。

牛脑毛细血管聚（A）的尺寸分级⁺用蔗糖梯度超速离心法检测mRNA(9). 新鲜牛脑（从12个脑中提取2035 g）用于分离脑毛细血管（图。​（图11B类)和140μg聚（A）⁺通过一步法从脑毛细血管中分离出RNA(10). mRNA在5–20%蔗糖梯度中进行大小分馏，蔗糖梯度在Beckman L8–70M超离心机中形成，使用SW28转子，转速35000 rpm，温度4°C，持续17小时（155000×g），收集10种不同密度的不同蔗糖梯度组分（每个1 ml）。来自组分2–3的RNA用于构建pSPORT载体中的大小分馏cDNA文库。

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图1

(A类)大鼠LAT1 cDNA由大鼠C6 poly（A）的反转录-PCR扩增产生⁺RNA。用0.8%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的重复等分样品，凝胶的溴化乙锭染色显示与扩增的rat-LAT1 cDNA相对应的约290-nt条带。DNA标准的大小（kb）如左图所示。对凝胶进行扫描，图像被反转。(B类)新鲜分离的牛脑毛细血管显微照片，这些毛细血管不含邻近脑组织；红细胞被困在毛细血管腔内。（×100.）聚乙烯（A）⁺从脑毛细血管制剂中分离出RNA。(C类)大脑毛细血管mRNA在5–20%蔗糖梯度下进行大小分级，前7个梯度组分的0.5μg等分样品进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行溴化乙锭染色；RNA标准如左图所示。

牛LAT在非洲爪蟾卵母细胞。

如前所述分离青蛙卵母细胞(11). 使用纳升注射器（World Precision Instruments，Sarasota，FL）向卵母细胞注射50 nl水或cRNA溶液（即牛LAT和/或大鼠4F2hc），并在18°C下在Barth's/庆大霉素溶液中保存4-5天，以使mRNA在卵母细胞内表达。为了进行转运试验，将五个健康的卵母细胞转移到一个装有10 ml Hepes缓冲液（0.1 M NaCl/2 mM KCl/1 mM MgCl）的小瓶中₂/1 mM氯化钙₂/10 mM Hepes，pH 7.5），并在22°C下孵育30分钟。使用1.0 ml Hepes缓冲液进行分析，该缓冲液含有2μCi[^三H] 色氨酸和0.08μCi[¹⁴C] 22°C下蔗糖3分钟。初步时间进程研究表明[^三H] 对照卵母细胞对色氨酸的摄取在45分钟内呈线性。用10 ml冰镇胆碱缓冲液（0.1 M胆碱/2 mM KCl/1 mM MgCl）停止反应₂/1 mM氯化钙₂/10 mM Hepes，pH 7.5），然后用胆碱缓冲液额外清洗3次。卵母细胞分别在60°C下溶于0.5 ml 1 M NaOH中30 min。在双窗口液体闪烁计数器中测量放射性(^三H、，¹⁴C） 计数。氨基酸分配量(V（V）_D类)每个卵母细胞的单位μl计算如下：

[¹⁴C] 蔗糖提供了一个内部标准来纠正任何不完全清洗。典型的蔗糖V（V）_D类孵育2分钟和135分钟时每个卵母细胞分别为0.0079±0.0008和0.037±0.008μl（平均值±SE，n个= 4). 这个V（V）_D类除以孵育时间（3min）得出清除率（μl/卵母细胞/min），清除率数据符合Michaelis–Menten方程，

式中S=总色氨酸浓度，V（V）_最大值是最大运输速度，K_米是半饱和常数，以及K_D类是不饱和输运的常数(1,4). 通过使用非线性回归分析（来自加州大学洛杉矶分校BMDP计算设施开发的BMDP统计软件的P3R）将数据拟合到方程中。数据按1/（间隙）加权².

结果

使用大鼠LAT1特异性引物和poly（A）产生的cDNA通过PCR产生290bp的DNA片段⁺从C6大鼠胶质瘤细胞中分离出的mRNA（图。​（图11A类). 使用290-bp LAT1 DNA片段筛选λgt11载体中的牛脑毛细血管cDNA文库。通过放射自显影术筛选阳性克隆，其中一个克隆含有最大的插入物2.0kb（指定克隆LAT IV-5）；该插入物在Bluescript质粒中亚克隆。DNA测序表明，这个2.0-kb的克隆包含大约一半的ORF和大鼠LAT1牛类似物的3′-非翻译区（UTR）。λgt11牛脑毛细血管cDNA文库的进一步筛选没有产生包含全长牛LAT cDNA的克隆。因此，准备了一个新的图书馆。从新鲜牛脑中分离出牛脑毛细血管，并在无RNase条件下纯化至均匀（图。​（图11B类). 这些毛细血管被提取出来，牛脑毛细血管衍生聚（A）⁺分离RNA，并通过蔗糖密度超速离心法对140μg该mRNA进行大小分级（图。​（图11C类). 从各个组分生成单独的文库，从组分2–3生成的文库筛选出大量牛BBB LAT克隆。从pSPORT大小分级文库中共筛选出240000个克隆³²P标记克隆LAT IV-5，共鉴定出186个阳性克隆，频率为0.078%。

从牛脑毛细血管pSPORT文库中分离出全长cDNA，该克隆的测序结果如图所示。​图2。2全长cDNA的长度为4039个核苷酸，由93个核苷酸的5′-UTR片段、1515个核苷酸的ORF和2431个核苷酸的3′-UTR组成，带有短聚（a）尾（图。​（图2）。2). 牛LAT由505个氨基酸组成，预测分子量为55072道尔顿。爆炸高通量基因组序列数据库（hgts）的搜索将牛LAT序列定位为克隆PAC536B24（登录号：。AC007442型)，对应于智人染色体16q24.3工作草案。

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图2

强调了牛LAT序列的核苷酸和推导的氨基酸序列在物种间UTR中具有高度保守性。在5′-UTR中，牛LAT的28-67核苷酸分别与人和大鼠LAT1相似70%和68%。在3′-UTR中，下划线区域与大鼠LAT1相似88%。还强调了腺苷尿苷结合蛋白（AUUUA）的假定结合位点。

使用含有全长克隆的pSPORT质粒通过在体外转录牛脑毛细血管LAT-poly（A）⁺mRNA，并将该mRNA单独或与大鼠4F2hc mRNA一起注入青蛙卵母细胞[^三H] 色氨酸和[¹⁴C] 4-5天后，通过注射mRNA的卵母细胞测定蔗糖。如图所示。​图3三A类，略有增加[^三H] 在卵母细胞注射牛BBB LAT mRNA或大鼠4F2hc mRNA后观察到色氨酸转运(5). 然而[^三H] 4F2hc和牛BBB LAT mRNA共注入后，色氨酸进入卵母细胞（图。​（图3三A类). [^三H] 500μM浓度的中性小氨基酸（丙氨酸）、碱性氨基酸（精氨酸）或酸性氨基酸（谷氨酸）不抑制色氨酸向与牛BBB LAT mRNA和4F2hc mRNA共注射的卵母细胞的转运，但亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、，或2-氨基双环[2.2.1]庚烷-2-羧酸（BCH），一种亮氨酸（L）系统先导合成氨基酸（图。​（图3三B类). 胆碱阳离子化学计量取代转运介质中的钠阳离子不会对色氨酸转运到注射了信使核糖核酸的卵母细胞中造成任何抑制。丙氨酸（A）优先系统特有的模型氨基酸，N个-甲基氨基异丁酸（MeAIB）没有竞争色氨酸转运到mRNA注射的卵母细胞中（图。​（图3三B类). 在色氨酸的nM和μM浓度下，分别测量了单独注射4F2hc或注射4F2hc加牛BBB LAT mRNA的卵母细胞的色氨酸饱和曲线，这些饱和曲线如图所示。​图3三C类.对这些饱和度数据的非线性回归分析表明K_米无论是单独注射4F2hc mRNA还是注射4F2hc mRNA加上牛BBB LAT mRNA，色氨酸在卵母细胞中的转运都没有显著差异，但色氨酸转运增加了10倍V（V）_最大值在注射4F2hc mRNA和牛血脑屏障LAT mRNA的卵母细胞中（表​（表1）。1).

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图3

牛LAT在爪蟾 莱维斯卵母细胞。卵母细胞注射50 nl水或含有80 ng牛LAT和/或10 ng大鼠4F2hc的cRNA溶液，并在18°C下培养4天。(A类)配送量(V（V）_D类)第页，共页[^三H] 4F2hc mRNA和牛LAT mRNA共注入后，卵母细胞中的色氨酸增加(B类)牛LAT介导的抑制作用[^三H] 添加500μM浓度的氨基酸对色氨酸的吸收。2-氨基双环[2.2.1]庚烷-2-羧酸；墨西哥国际银行，N个-甲氨基异丁酸。(C类)LAT介导的摄取的动力学分析[^三H] 色氨酸。卵母细胞单独注射4F2hc cRNA(♦, ▴ 在里面插入)或与牛LAT（■）联合使用。通过改变[^三H] 色氨酸（14–140 nM）或增加未标记色氨酸的水平（0.3–500μM）。这个插入表示主图中所示曲线的起点，用于证明K_米.每个条或点代表平均值±SE，n个= 5.

Northern印迹研究³²P标记的克隆LAT IV-5表明，牛LAT的mRNA在脑毛细血管中显著上调（图。​（图4）。4). 图的顶部螺栓。​图44A类显示了从新分离的牛脑毛细血管中获得的mRNA中的4.1-kb LAT转录物（图。​（图11B类)，在室温下使用2μg poly（a）仅暴露2小时后检测到该转录物⁺每条车道的mRNA。在滤光片与x射线胶片的短暂接触中，未观察到大鼠全脑或C6大鼠胶质瘤细胞中检测到LAT mRNA（图。​（图44A类，顶部螺栓）。相反，在大鼠全脑和C6胶质瘤mRNA样本中均检测到4F2hc和actin转录物（图。​（图44A类、中间和底部斑点）。出乎意料的是，无论是全脑还是C6胶质瘤细胞，脑毛细血管（BBB）样本中4F2hc mRNA的水平都小于4F2hcmRNA值的10%，并且只有在过度曝光胶片后才能检测到BBB 4F2hc-转录信号（图。​（图44A类，中间螺栓）。如图的顶部印迹所示，长时间暴露胶片后，在C6胶质瘤细胞和大鼠全脑中检测到LAT mRNA。​图44B类在这些研究中，2μg聚（A）⁺mRNA在每条车道上施用，x射线胶片在−70°C下暴露7天。在大鼠心脏、肾脏、肝脏或肺中，LAT mRNA在该暴露下没有可测量的表达（图。​（图44B类)尽管在所有样本中都检测到4F2hc mRNA，除大鼠肝脏外，所有样本中的肌动蛋白转录物都可以测量。当10μg聚（A）⁺在每条车道上施用mRNA，过滤器在−70°C下暴露7天，如图所示。​图44C类LAT mRNA在四个不同大鼠的RNA组分中具有可比性，在肺或心脏中未检测到LAT mRNA，但在暴露7天时，使用10μg聚（A）在大鼠脾脏或睾丸中可测量到LAT⁺每条车道的RNA（图。​（图44C类); 该过滤器还用于肌动蛋白Northern印迹，该印迹显示所有大鼠组织中的肌动蛋白信号具有可比性。

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图4

poly（A）的Northern印迹分析⁺RNA使用³²P标记牛LAT克隆IV-5、4F2hc或肌动蛋白。Northern印迹用2μg(A类和B类)或10μg(C类)聚（A）⁺RNA。将膜暴露于柯达BioMax胶片和增感屏，如下所示：A类，LAT，22°C下2小时；4F2hc和肌动蛋白，在−70°C下20小时；B、，LAT，在−70°C下7天；4F2hc和肌动蛋白，在−70°C下20小时；和C、，LAT，在−70°C下7天。mRNA来源于大鼠脑、肺、脾、睾丸或心脏；C6大鼠胶质瘤细胞；或牛脑毛细血管（BBB）。

讨论

这些研究的结果与以下结论一致。首先，与任何其他组织相比，BBB的LAT mRNA有着深刻的上调（图。​（图4）。4). 其次，克隆和表达的牛BBB LAT不依赖钠，对大的中性氨基酸具有特异性，并且与K_米31.5±5.5μM（图。​（图3，三，表​表1），1)，而这个K_米值与相关K_米通过BBB测定色氨酸转运的测量值体内(4). 第三，牛LAT的氨基酸序列对应于LAT1亚型，该序列在四个物种（大鼠、人、小鼠和牛）中高度保守，并且LAT1 mRNA的5′-UTR和3′-UTR-核苷酸序列也存在系统发育保守性（图。​（图22).

图中的Northern印迹研究。​图44表明LAT1转录物在BBB选择性表达体内在组织培养的C6大鼠胶质瘤细胞中，LAT1转录物的水平与大鼠其他组织中的水平一样高（图。​（图4）。4). 大鼠LAT1对应于TA1(17)是一种癌胚抗原，主要在胎儿组织和癌细胞（如C6胶质瘤细胞）中表达(5). LAT1转录物也在睾丸和胎盘等屏障组织中表达(5). LAT1在人胎盘中的表达与人脑中LAT1的表达近似(18)LAT1 mRNA在大脑中的表达与C6胶质瘤细胞中的表达相似（图。​（图4）。4). 然而，C6胶质瘤细胞中LAT1的表达比BBB中LAT1mRNA的表达少很多倍，因为BBB LAT1 Northern blot的形成时间是C6细胞LAT1北部blot形成时间的1/100（图。​（图4）。4). pSPORT文库中LAT1转录物的高频率（0.078%）也表明了BBB处LAT1的高丰度(结果). 在C6胶质瘤细胞中，4F2hc mRNA与LAT1 mRNA的比率为≫1，但在BBB中为≪1（图。​（图4）。4). 如果4F2hc mRNA的相对缺乏与BBB处4F2hc蛋白的缺乏相关，那么4F2hc-蛋白的可用性可能是LAT1异二聚体形成的速率限制。

LAT1转录物在BBB处的选择性分布也可以通过大鼠肝脏、心脏、肺或肾脏中LAT1的缺失来显示（图。​（图4）。4). LAT1在脑细胞（神经元、胶质细胞）中的表达体内也可以忽略不计，因为7天暴露后看到的大脑LAT1信号可能仅代表来自大脑毛细血管的LAT1 mRNA（图。​（图4）。4). 如前所述，这个问题可以通过对毛细血管缺失的mRNA进行Northern印迹来解决(19). 这些考虑表明，其他未知的LAT1亚型在非BBB组织中起作用，以介导大的中性氨基酸的细胞膜转运。最近，大鼠和人LAT2的cDNA已经被克隆出来(20,21)有人认为LAT2是在BBB起作用的LAT亚型(20). 然而，一些证据表明LAT1是BBB LAT亚型。首先，LAT1（而非LAT2）对大的中性氨基酸具有选择性（参考文献。5,20、和21; 图。​图3三B类)这与BBB处大的中性氨基酸比小的中性氨基酸运输量大有关体内(22). 其次，与任何其他组织相比，BBB处LAT1 mRNA的浓度非常高（图。​（图4）。4). 第三，LAT2较高-K_米系统，作为K_米对于LAT2的亮氨酸转运，120±34μM(20)，比K_米亮氨酸通过LAT1转运(5)和低K_米LAT1亚型与低K_米氨基酸通过BBB的转运体内(1). 这个K_米大量中性氨基酸转运到外周组织体内比K_米BBB处大量中性氨基酸的转运(1). 这个K_米色氨酸的克隆和表达牛BBB LAT1，31.5±5.5μM（表​（表1），1)，近似于K_米色氨酸在大鼠BBB中的转运体内，48±6μM，根据颈动脉注射技术测定(4)，自体内值是对实际值的高估K_米注射溶液与大鼠血浆混合的二次反应体内(23). BBB（英国广播公司）K_米对于大的中性氨基酸，近似于氨基酸的现有血浆浓度，这意味着BBB LAT1通常会被现有循环大中性氨基酸浓度严重饱和。相反，肝、心、肺或肾等外周组织的LAT远未饱和，因为K_米这些组织中的氨基酸浓度是现有血浆氨基酸浓度的许多倍(1). 高亲和力（低K_米)通过血脑屏障的大量中性氨基酸转运为大脑选择性易受高氨基酸血症的病理影响提供了物理基础(24). 大脑中的氨基酸供应因血浆中单个大的中性氨基酸浓度的增加而改变，如苯丙酮尿症，这会导致血脑屏障相对于外周组织的选择性竞争效应。

BBB LAT1的氨基酸序列在物种间高度保守，因为在比较牛和人的LAT1时，氨基酸序列有92%的一致性(18)牛LAT1和大鼠LAT1的同源性为89%(5)或鼠标LAT1(25). 牛BBB LAT1转录物的长3′-UTR超过2400 nt（图。​（图2）。2). 在比较牛和人LAT1序列时，3′-UTR的1448nt具有54%的一致性(18). 类似地，在比较牛和人的LAT1转录物时，在5′-UTR的40nt长度上存在70%的同一性（图。​（图2）。2). 这一发现表明，5′-UTR或3′-UTR-含有调节BBB LAT1转录物翻译效率或稳定性的顺调控序列。从转录物的poly（a）尾部约185 nt处有一个单一的AUUUA五聚体序列（图。​（图2）。2). AUUUA顺式元件与一系列细胞AU结合蛋白结合，参与转录后水平基因表达的调节，影响mRNA的稳定性(26,27).

总之，这些研究描述了牛BBB LAT1全长cDNA的克隆和表达，它们表明，LAT1转录物在BBB的表达出乎意料地高，与C6大鼠胶质瘤细胞等其他组织相比，在BBB处的富集度超过100倍。与LAT1相比，x射线胶片的曝光时间必须延长10倍，以检测BBB 4F2hc或肌动蛋白（图。​（图4），4)这表明BBB处LAT1转录物的丰度远高于4F2hc或肌动蛋白转录物。BBB LAT1 mRNA的含量也比葡萄糖转运蛋白1BBB的成绩单(19)、和葡萄糖转运蛋白1是血脑屏障的主要葡萄糖转运蛋白体内(28). 例如葡萄糖转运蛋白1牛脑毛细血管poly（A）的Northern印迹⁺mRNA必须在−70°C下培养几天(10)，但LAT1 Northern印迹在室温下仅2小时内形成（图。​（图44A类). LAT1 mRNA水平高于葡萄糖转运蛋白1与对照组相比，BBB处的mRNA可能与较高数量的LAT1转运蛋白无关葡萄糖转运蛋白1蛋白质，因为最大运输速度(V（V）_最大值）对于d日-BBB处的葡萄糖转运比V（V）_最大值用于大的中性氨基酸运输(1). 然而，BBB处丰富的LAT1 mRNA可能意味着该转录物具有较高的转换率。BBB LAT1转录物的长3′-UTR表明，在BBB调控LAT1基因表达的一种机制可能是转录后。BBB LAT1基因表达的调节可能在大脑对异常血浆氨基酸供应的适应性反应中发挥重要作用。这一点至关重要，因为通过脑蛋白合成将氨基酸并入脑蛋白的速率与穿过血脑屏障的氨基酸流入速率大致相同体内(24). 大脑选择性地免于营养不良引起的低氨基酸血症(29)这可能是由于BBB LAT1 mRNA的基因表达上调所致。

致谢

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脚注

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