跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
临床投资杂志。2007年4月2日；117(4): 961–970.
2007年4月2日在线发布。 数字对象标识：10.1172/JCI29115
预防性维修识别码：项目经理1839241
PMID：17404619

胚胎内分泌胰腺和成熟β细胞获得α和PP细胞表型阿尔克斯表达不当

帕特里克·科伦巴特,1 雅各布·赫克谢尔·索伦森,2 延斯·克鲁尔,1 约阿希姆·伯杰,三 迪特马尔·里德尔,4 佩德罗·埃雷拉,5 Palle Serup公司,2和艾哈迈德·曼苏里1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

Arx最近被证实参与胰腺α细胞命运规范，同时抑制β和δ细胞谱系。为了确定Arx是否不仅是必需的，而且足以指示内分泌祖细胞中α细胞的命运，我们使用了一种获得功能的方法来生成有条件地错误表达该因子的小鼠。强迫小鼠阿尔克斯在胚胎胰腺或发育中的胰岛细胞中的表达导致严重的高血糖，最终死亡。进一步分析表明β和δ细胞大量丢失。同时，显示α细胞或胰腺多肽（PP）细胞特征的细胞数量显著增加。值得注意的是阿尔克斯在胚胎或成年β细胞中诱导导致β细胞表型的丢失，同时伴有一些具有α或PP细胞特征的细胞的增加。结合定量实时PCR和血统追踪实验，我们证明，在成年小鼠中阿尔克斯而不是其过度表达，在体内促进β细胞转化为胰高血糖素或PP生成细胞。这些结果为正确的胰腺内分泌细胞分配和细胞身份获得的复杂机制提供了重要的见解。

介绍

胰腺通过合成和分泌酶和激素，在维持营养平衡方面发挥着关键作用。哺乳动物胰腺由三种组织类型组成：腺泡、导管和内分泌。外分泌胰腺由分泌消化酶的腺泡细胞组成，这些消化酶被排入胰管，胰管是由上皮管细胞组成的复杂的小管网络。内分泌细胞组织在朗格汉斯胰岛中，包括5种细胞类型，α、β、δ、ε和PP细胞，分别产生胰高血糖素、胰岛素、生长抑素、ghrelin和胰多肽（PP）。胰岛素和胰高血糖素拮抗调节血糖水平，而生长抑素和PP控制额外激素和酶的产生(1–三). ghrelin的功能尚不清楚(4,5). 胰腺的形态发生大约始于E9.5，在前肠/中肠交界处出现2个原始肠内胚层外翻。这些突起或胰腺芽进一步发育，相互旋转，最终融合，从而形成胰腺(6).

在胰腺发育的同时，内分泌组织的形成在E9.5开始，导致早期胰高血糖素生成细胞的出现(7–9). 此外，这些细胞的一个子集在接下来的24小时内启动胰岛素和有时PYY的表达(8). 在E14.5处，“二次过渡”(10)结果发育出大量成熟的胰岛素和胰高血糖素表达细胞，第二天出现第一个生长抑素产生δ细胞。最后，在出生前不久，PP细胞分化，内分泌细胞开始形成组织良好的朗格汉斯胰岛，在出生后的2-3周内进一步成熟。

最近的研究结果揭示了内分泌细胞发生的一些遗传决定因素。胰腺祖细胞首先通过几种转录因子的作用进入胰腺谱系，包括含有同源结构域的因子Pdx1(11–15). 随后，通过激活小鼠胰腺上皮中的基本螺旋环螺旋因子Neurogen3（Ngn3）启动内分泌分化程序(16–20). 因此，小鼠缺乏Ngn3号机组不能产生任何内分泌细胞(21)，而Ngn3号机组在Pdx1页启动子导致大多数胰腺细胞分化为内分泌细胞(16,19). 随后，一个复杂的转录因子网络被激活，以逐步和差异地指定内分泌亚型谱系。这些包括同源域蛋白Nkx2.2、Nkx6.1、Arx、Pax4和Pdx1(22–26). 一旦确定了细胞命运，额外的转录因子，如Isl1、Pax6、MafA、MafB和Pdx1，就可以维持特定胰岛细胞的表型(11,13,27–32).

Arx和Pax4在4种经典内分泌细胞命运分配中发挥的关键作用最近被揭示。因此，在携带靶向突变的阿尔克斯基因，检测到成熟α细胞丢失，β和δ细胞数量成比例增加，因此胰岛细胞总含量保持不变(24). 这种表型变化与在Pax4型-缺陷小鼠(25). 此外，已经确定，在内分泌发育的早期阶段，Arx和Pax4之间存在相互转录抑制，以分配不同的内分泌细胞命运(24). 这些发现表明，在早期胰岛细胞分化过程中，内分泌祖细胞表现出接受β/δ或α细胞命运的潜力，而这种替代命运分别需要Pax4和Arx的活性。在阿尔克斯/Pax4型双突变小鼠，表现出所有已知δ细胞特征的细胞以β和α细胞为代价生长(33)这表明β/δ细胞祖细胞中Pax4是β细胞命运规范的次要需求。

为了进一步了解不同内分泌亚型发展背后的遗传程序，我们使用功能获得方法来表达阿尔克斯胰腺上皮或胰岛前体细胞。这些小鼠出现了明显的高血糖，缺乏β和δ细胞，最终死亡。我们的研究结果表明，Arx对于促进内分泌祖细胞向α和有趣的PP细胞系分化既必要又充分。我们还展示了迄今为止尚未被认可的阿尔克斯在PP电池中。最重要的是，我们的数据表明阿尔克斯在胚胎或成人中，产生胰岛素的β细胞将其转化为具有α或PP细胞特征的细胞。

结果

转基因动物有条件地错误表达Arx。

The consequences of阿尔克斯和/或Pax4型失能突变与Arx和Pax4在支持α细胞或β/δ细胞命运中的拮抗作用一致(24,33). 为了进一步了解Arx和Pax4在整个胰腺形态发生过程中的命运决定活性，我们利用Cre-LoxP系统生成转基因小鼠，该转基因小鼠能够条件性错误表达阿尔克斯基因（cArxOE小鼠）。所使用的构建体由人β-肌动蛋白启动子（CAG）上游的CMV增强子组成，该增强子控制电子GFPLoxP位点两侧的基因（图​（图1，1，顶部）。这个阿尔克斯cDNA被克隆到电子GFP以及IRESβ-半乳糖苷酶编码序列。通过原核注射，建立了5个独立的转基因株系。在缺乏Cre重组酶活性的情况下，我们确认只有电子GFP结合β-半乳糖苷酶基因（数据未显示）和荧光显微镜（图​（图1，1，插图）。随后，在不同的基因启动子（包括Pdx1页（Pdx1Cre），第6页（Pax6Cre），或胰岛素（InsCore）启动子(17,34,35). 因此，在产生的双转基因动物中，Cre重组酶以时间和空间限制的方式表达，有望触发持续的细胞特异性阿尔克斯表达式（图​（图1，1，底部）。对这些双转基因小鼠的检测是通过结合基因分型PCR进行的Cre重组酶和β-半乳糖苷酶基因和荧光显微镜。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为JCI0729115.f1.jpg
动物有条件地表达错误阿尔克斯基因。

描述由噬菌体P1-Cre重组酶诱导的2个LoxP位点重组之前（顶部）和之后（底部）的靶向载体的示意图。β-半乳糖。, β-半乳糖苷酶插图：在荧光灯下对具有代表性的Cre阴性E10胚胎和成人胰腺进行目视检查。原始放大倍数，×40。

早期胰腺中Arx的错误表达导致了与胰高血糖素或PP-表达细胞命运的流行相关的剧烈和致命的高血糖症，而β和δ细胞谱系则被破坏。

为了解决内分泌祖细胞中的Arx功能是否足以促进α细胞命运的问题，我们首先诱导阿尔克斯早期胰腺前体细胞的表达。这是通过用Pdx1Cre（允许异位表达阿尔克斯在胰腺内胚层中）或Pax6Cre（以允许异位表达阿尔克斯内分泌前体）动物(17,34). 双转基因cArxOE:：Pdx1Cre和cArxEO:：Pax6­Cre动物正常出生。然而，在产后2-6周内，cArxOE:：Pdx1Cre小鼠出现生长迟缓和胰腺发育不全（表​（表1）。1). cArxOE:：Pdx1Cre和cArxEO:：Pax6­Cre小鼠在出生后约2–12周死亡，表现出严重的高血糖（表​（表1）：1)：在死亡前不久，发现血糖和尿糖含量急剧增加，其值超过了我们葡萄糖监测系统的最大检测阈值（>600 mg/dl，n个=126）与年龄匹配的对照动物（尿液，38±22 mg/dl；血液，72±29；n个= 189).

表1

cArxOE:：Pdx1Cre-或cArxEO:：Pax6Cre-杂交动物后代中葡萄糖水平的测定

保存图片、插图等的外部文件。对象名为JCI0729115.t1.jpg

评估因错误表达阿尔克斯在里面Pdx1页-或帕x6-表达祖细胞的6周龄小鼠的胰岛通过免疫组织化学方法检测4种内分泌细胞类型的存在（图​（图2）。2). 我们没有观察到WT和cArxOE胰腺之间有任何明显差异，后者显示了统一的GFP标记（数据未显示，图​图2A）。2A） ●●●●。值得注意的是，cArxOE:：Pax6Cre和cArxEO:：Pdx1Cre胰岛的GFP均为阴性，β-半乳糖苷酶均为阳性（图​（图2，2、B和C以及插图）。此外，几乎所有胰腺cArxOE:：Pdx1Cre细胞似乎都是GFP–/β-半乳糖苷酶+（图​（图2C2C和插图）。对cArxOE:：Pax6Cre和cArxEO:：Pdx1Cre胰岛的检查显示，与对照组相比，胰岛素生成细胞数量显著减少（图​（图2，2，D–F），仅检测到少量分散的生长抑素表达细胞（图​（图2，2，G–I）。相反，在这些动物中观察到胰高血糖素产生细胞数量急剧增加（图​（图2，2，D–O）。有趣的是，在这两种基因型中，PP-标记细胞的数量也显著增加（图​（图2，2，J–L）。Colocalization实验使我们能够清楚地确定胰高血糖素和PP从未共存（图​（图2，2，J–L）。正如所料，在C阳性动物中，阿尔克斯在几乎所有产生胰高血糖素的细胞中都能检测到，但令人惊讶的是，在许多缺乏胰高血糖素的细胞中也能检测到（图​（图2，2、N和O以及插图）；这表明PP细胞的标记（因为没有胰岛素和生长抑素标记的细胞）。共检测阿尔克斯由于技术原因，之前未尝试使用PP激素。然而，使用新开发的豚鼠抗PP抗体（Linco），我们确定Arx在对照和双转基因动物的PP生成细胞中表达（图​（图2，2，P–R）。出于技术原因Pax4型无法通过原位杂交或免疫组织化学方法进行评估；然而，使用定量RT-PCR方法，胰腺定量帕克4该年龄段的成绩单未发生变化（数据未显示）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为JCI0729115.f2.jpg
有条件的阿尔克斯局限于早期胰腺的错误表达导致胰高血糖素或PP-生成细胞的命运受惠，而β和δ细胞谱系则受损。

检查6周龄小鼠切片中cArxOE中是否存在胰腺激素(A类,D类,G公司,J型,M（M）、和P（P）)，cArxOE:：Pax6Cre(B类,E类,H（H）,K（K）,N个、和问)和cArxOE:：Pdx1Cre(C,F类,我,L（左）,O（运行）、和R（右）)动物免疫荧光法。(A类–C)制服GFP公司cArxOE小鼠中的表达(A类)预计被排除在cArxOE:：Pax6Cre动物的胰岛之外(B类)cArxOE:：Pdx1Cre胰腺组织中缺失(C). 相反，在cArxOE:：Pax6Cre胰岛中可以清楚地检测到β-半乳糖苷酶活性(B类，插图）和cArxOE:：Pdx1Cre胰腺(C，插图）。(D类–R（右）)Cre-mediated的错误表达阿尔克斯在里面第6页或Pdx1页表达域促进β细胞丢失(D类–F类)和δ电池(G公司–我)人口，同时产生胰高血糖素的数量增加(D类–O（运行）)或PP-生产(J型–L（左）)单元格编号。在cArxOE:：Pax6Cre和cArxEO:：Pdx1Cre小鼠的内分泌组织中可以均匀地检测到Arx的生成(M（M）–O（运行）). 请注意阿尔克斯存在于胰高血糖素标记的细胞中，最有可能存在于PP阳性细胞中（插入N个和O（运行）). 对照组中均显示Arx和PP共表达(P（P）)以及在双转基因动物中(问和R（右）). 每张图片代表6-15只独立的动物。葡聚糖、胰高血糖素；胰岛素；Som，生长抑素。原始放大倍数，×40。

为了扩展我们的数据，进行了定量分析：对cArxOE:：Pax6Cre和cArxEO:：Pdx1Cre小鼠的独立阶段匹配胰腺进行切片，并在每10个切片中测定激素免疫活性细胞的数量。将报告的平均计数与总内分泌人群进行比较得出的结果（图​（图3三和表​表2）2)证实胰岛素生成细胞显著减少（平均减少93%），生长抑素表达细胞数量急剧减少（减少66%）。相比之下，与对照窝友相比，这些动物中胰高血糖素和PP生成细胞的平均数量显著增加（分别为+75%和+2200%）。值得注意的是，cArxOE:：Pax6Cre和cArxOE:：Pdx1Cre胰腺的总内分泌细胞含量在统计学上没有变化（表​（表2）2)与对照组相比。有趣的是，在cArxOE:：Pdx1Cre小鼠中发现外分泌细胞质量显著降低，这表明阿尔克斯在里面Pdx1页表达域可能诱导外分泌前体细胞提前分化。事实上，对这些动物胰腺中增殖细胞的脉冲期标记（从E12.5到E16.5）表明，与对照组相比，分裂外分泌细胞的数量减少了17%，而凋亡率似乎没有变化。初步结果表明，外分泌细胞表达正常的转录因子补体（数据未显示）。总之，我们的发现表明，双转基因胰腺中缺失的激素分泌细胞获得了另一种内分泌细胞命运。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为JCI0729115.f3.jpg
靶向性错误表达后激素产生细胞内容物表型改变的量化阿尔克斯.

对估计大小相同的6周龄独立胰腺进行连续切片，每10个切片按指示进行染色，阳性细胞的数量被计数并报告给胰岛细胞总含量（使用针对不同内分泌激素的抗体混合物在相邻切片上估计）。数据显示为激素阳性细胞占总内分泌人群的百分比±SEM。一般来说阿尔克斯在胰腺早期形成期间，β和δ细胞大量丢失，而胰高血糖素和PP标记细胞的含量则成比例增加*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.n个≥ 8.

表2

靶向性错误表达后激素产生细胞内容物表型改变的量化阿尔克斯

保存图片、插图等的外部文件。对象名为JCI0729115.t2.jpg

为了确定这些胰岛改变在胚胎发生期间是否已经明显，在发育过程中进一步检查内分泌细胞发生并通过细胞计数进行量化。事实上，观察到的缺陷与产后发现的缺陷相似，表明在这些动物的胰腺内分泌发育过程中，β和δ细胞系不受欢迎（图​（图4，4，A–F和V–X），被重定向至胰高血糖素或PP生成细胞的命运（图​（图4，4、A–U和Y–DD）。胰岛素生成细胞的丢失进一步与β细胞特异性因子Nkx6.1、Pdx1、Glut2、Isl1、HB9和MafA的表达显著降低相关（图​（图4，4，M–U，补充图1，A–C，以及未显示的数据；本文在线提供的补充材料；doi:10.1172/JCI29115DS1）。类似地，CART的表达专门标记δ细胞(36)，发现有所减少（图​（图4，4，V–X）。相反，在大多数胰高血糖素产生细胞中检测到Brn4和MafB，证实了它们在所有基因型中的正常α细胞表达（图​（图4，4，Y–AA和补充图1，D–F）。cArxOE:：Pax6Cre和cArxEO:：Pdx1Cre基因型中的PP或胰高血糖素生成细胞对Pax6呈阳性反应（图​（图4，4，BB–DD）。通过对E15全胰腺进行定量RT-PCRPax4型与对照组相比，在双转基因中观察到转录物（cArxOE:：Pax6Cre为-77%±6%；cArxEO:：Pdx1Cre为-85%±8%）。电子显微镜（补充图2和补充方法）和内分泌激素水平的血液检查（表​（表2）。2). 总之，这些结果表明Arx的异位激活Pdx1页-或第6页-表达细胞通过抑制Pax4型表达并促进其向谱系发展，最终导致细胞表现出α或PP细胞的大多数特征。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为JCI0729115.f4.jpg
在cArxOE:：Pax6Cre或cArxEO:：Pdx1Cre胰腺内分泌胰腺形态发生期间，以牺牲β和δ细胞谱系为代价，有利于胰高血糖素和PP-生成细胞的命运。

(A类–尽职调查)在指定的胚胎阶段，具有代表性的胰腺切片与指定的抗体组合相结合。单尾Student’s估计的Cre阴性和Cre阳性小鼠之间内分泌变化的量化t吨测试，以匹配颜色的每组图片下的百分比表示(n个≥ 3,P（P）< 0.05). β的明显损失(A类–C)和δ(D类–F类和V（V）–X（X）)动物的细胞表达不良阿尔克斯同时，胰高血糖素增加(A类–U型和Y（Y）–尽职调查)或PP(G公司–我)出现细胞含量，在大多数内分泌组织中检测到Arx(J型–L（左）)在cArxOE:：Pdx1Cre的情况下，也存在于外分泌细胞中(L（左），箭头）。用β细胞特异性标记物Nkx6.1标记的细胞数量(M（M）–O（运行）)，Pdx1(P（P）–R（右）)，和Glut2(S公司–U型)在Cre阳性小鼠中显著减少。同样，正常标记δ细胞的CART的表达也显著降低(V（V）–X（X）)而α细胞特异性基因Brn4的表达增强(Y（Y）–AA公司). 内分泌标记物Pax6阳性细胞的含量不受影响(BB公司–尽职调查). 每张图片代表了不同窝中的3-8只动物。U、 保持不变。原始放大倍数，×40。

胰岛素分泌细胞中Arx表达后，β细胞转化为具有α或PP分泌细胞特征的细胞。

前面描述的获得功能实验表明阿尔克斯早期内分泌祖细胞诱导其分化为α和PP细胞，但以β和δ细胞系为代价。因此，我们想知道类似的功能是否也适用于分化的β细胞。因此，通过cArxOE小鼠首先与InsCre系杂交，其次与诱导型Pdx1Cre（IndPdx1Cre）系杂交，产生了2种不同的转基因系(17). 在第一例（cArxOE:：InsCre）中，胰岛细胞的定量显示阿尔克斯在容易表达胰岛素激素的细胞中，最终导致PP或胰高血糖素标记细胞的含量增加，而β细胞数量减少，δ细胞含量保持不变（表​（表3）。三). 重要的是，在第二种交配方案中，在4周龄cArxOE:：IndPdx1Cre动物中诱导噬菌体P1-Cre重组酶（Pdx1在该年龄段通常仅限于β细胞），随后表达阿尔克斯在β细胞中，促进了类似的表型（表​（表3）。三). 因此，早在诱导后1周就观察到胰岛素表达细胞的丢失和PP或胰高血糖素阳性细胞数量的成比例增加（表​（表3三和图​图5，5，A–D），内分泌细胞总数无明显变化。在这两种情况下，双转基因动物都出现了严重的高血糖，最终死亡。重要的是，随后在绝大多数胰高血糖素或PP生成细胞中检测到β细胞中特异性触发的β-半乳糖苷酶表达（图​（图5E），5E） ，这些也在外生出Arx（图​（图5，5，C和D），而Pax4型发现表达式未更改。这些结果表明，先前表达β细胞遗传决定因子的细胞随后激活了胰高血糖素或PP激素。通过对众多内分泌亚型特异性因子的定量分析，进一步确定了这一点（表​（表3）。三). 沿着同样的路线阿尔克斯在胰岛素表达的MIN6和βTC3细胞系中，还发现胰岛素产生细胞转化为产生胰高血糖素或PP的细胞（补充图3）。总之，似乎触发了阿尔克斯胰岛素表达细胞在体外或体内的表达会导致其分子特性的丧失，这表明这些细胞会重新编程为细胞，最终呈现通常与α或PP细胞相关的特征。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为JCI0729115.f5.jpg
阿尔克斯错误表达将成熟的β细胞转化为产生胰高血糖素或PP的细胞。

(A类–D类)使用所示抗体对三苯氧胺处理的cArxOE:：IndPdx1Cre胰腺中发现的内分泌细胞含量变化进行代表性染色和量化。(E类)β-半乳糖苷酶（红色）协同免疫化学检测胰高血糖素（蓝色）和PP激素（绿色）。请注意，胰高血糖素或PP生成细胞对β-半乳糖苷酶呈阳性反应。每张图片代表了4到7只来自不同窝的动物。原始放大倍数，×40。

表3

阿尔克斯错误表达将成熟的β细胞转化为胰高血糖素或PP-生成细胞

保存图片、插图等的外部文件。对象名为JCI0729115.t3.jpg

成熟β细胞中Arx的错误表达足以引起内分泌细胞命运的改变。

值得注意的是，上述报道的表型变化在与InsCore系杂交的5个不同cArxOE系的后代中相似。为了排除观察到的内分泌组织改变与非生理水平阿尔克斯表达，我们使用实时RT-PCR评估阿尔克斯生产。因此，阿尔克斯在5个cArxOE:：InsCore双转基因株系中发现表达是可变的，反映了转基因的不同插入位点。考虑到成年小鼠阿尔克斯通常在α和PP细胞中表达，即在大约23%的总内分泌人群中表达（图​（图2，2（对照组），人们预计在生理水平上强制β细胞（约占胰岛细胞的68%）在体外表达将使其胰腺浓度增加约3.95[（23+68）/23]倍。值得注意的是，在我们的两个cArxOE:：InsCore转基因株系中阿尔克斯mRNA表明没有达到这个阈值，总的增加量分别为阿尔克斯与对照组相比，转录本内容为2.6和3.4（表​（表4）。4). 重要的是，即使在这些动物中，也可以清楚地检测到内分泌细胞含量的显著变化。这表明阿尔克斯在β细胞中，低于或接近生理浓度的剂量足以触发β细胞表型的丧失，并诱导表达胰高血糖素或PP的细胞遗传决定簇。

表4

4周龄cArxOE:：InsCore胰腺转录物含量的量化

保存图片、插图等的外部文件。对象名为JCI0729115.t4.jpg

讨论

先前的研究表明Arx和Pax4在内分泌胰腺规范化过程中发挥相互拮抗的作用(24,33). 因此，根据功能丧失表型，我们认为Arx是内分泌祖细胞的α细胞规范所必需的，而Pax4首先是β/δ细胞命运所必需的并且随后是β细胞谱系分配所必需的。这些研究清楚地证明了Arx和Pax4活性对正确的胰岛细胞规格的必要性。然而，他们也提出了一个重要的问题：Arx和Pax4是否也足以指示内分泌祖细胞分别采用α细胞命运或β（δ）细胞谱系？为了解决这个问题，我们采用了获得功能的方法，并产生了有条件表达错误的转基因动物阿尔克斯.

为了评估Arx在胰腺早期形态发生中是否具有指导作用，首先在胰腺早期诱导该因子的表达。因此，老鼠表达错误阿尔克斯在里面Pdx1页或第6页由于低胰岛素血症，表达域出现明显的高血糖，最终死亡。通过电子显微镜和免疫组织化学，β和δ细胞的数量显著减少，同时胰高血糖素或PP生成细胞的数量也相应增加。在cArxOE:：Pdx1Cre小鼠中也检测到胰腺发育不全。重要的是，发现总内分泌细胞数量与对照组相比没有变化，尽管在cArxOE:：Pdx1Cre小鼠中观察到外分泌细胞数量减少而没有身份改变（P.Colombat，未发表的观察结果）。的表达式阿尔克斯在α和PP细胞中，这两种细胞系对阿尔克斯cArxOE:：Pdx1Cre或cArxEO:：Pax6Cre胰岛中的错误表达表明α和PP细胞可能共享一个共同的祖细胞。然而，这与之前支持PP表达可能是β细胞谱系标志的观点的实验相矛盾：PP细胞消融导致β和δ细胞的伴随丢失(37)细胞谱系追踪显示，PPCre转基因也标记了β细胞(35). 后者也可能与早期β/δ前体细胞中PP的低表达一致。这两种可能性之间的区分需要额外的实验，例如，使用ArxCre系进行基于Cre-LoxP重组的谱系追踪分析。

为了验证阿尔克斯β细胞中的表达将赋予它们α或PP细胞特性，阿尔克斯在胚胎发生过程中，一旦成熟的胰岛素分泌细胞或成年β细胞中启动激素分泌，就会在体外表达。在这两种情况下，均观察到致命的高血糖，同时β细胞含量显著减少，胰高血糖素或PP生成细胞数量成比例增加，而δ细胞数量不变。结合定量实时PCR和血统追踪实验，对cArxOE:：InsCore和他莫昔芬处理的cArxEO:：IndPdx1Cre动物进行进一步分析，确定（a）阿尔克斯此类小鼠β细胞中的转录物含量不超过阿尔克斯α或PP细胞中正常检测到mRNA；（b） 在三苯氧胺诱导下，β细胞特异性和永久性的β-半乳糖苷酶标记仅限于α和PP细胞；和（c）内分泌细胞总含量在统计学上保持不变（数据未显示）。值得注意的是，InsCore小鼠中噬菌体P1-Cre重组酶在90%以上的胰岛素生成细胞中表达（参考文献。33; P.Collombat，未发表的意见）。以类似的方式阿尔克斯体外实验发现，可以诱导MIN6和βTC3胰岛素生成细胞转化为胰高血糖素或PP表达细胞。

因此，我们的数据支持Arx能够驱动内分泌祖细胞走向α或PP细胞命运或诱导胰岛素生成细胞转化为α或PP电池的观点。这两个功能应该明确定义。在第一种情况下Pax4型转录被强调。这与之前的数据一致，表明在缺乏Pax4型，Arx普遍存在于内分泌前体中，并阻止它们采用aβ/δ细胞命运。在第二种情况下，我们还发现Arx能够在成年小鼠或体外自动覆盖β细胞表型，并促进α和PP细胞的鉴定。这是在没有任何可检测的修改的情况下实现的Pax4型表达式。然而，在这个年龄，Pax4型表情要么缺乏，要么很低。因此，从我们的分析中，我们可以得出结论，Arx功能不仅是将内分泌前体从β/δ细胞命运中驱赶出去，而且还积极参与α或PP细胞身份的获得。此外，我们证明分化的β细胞保留成为其他胰岛细胞亚型的潜力。

事实上阿尔克斯错误表达诱导α或PP细胞谱系是有趣的，并提出了几个问题：（a）选择这两种命运的机制是什么？（b） 为什么我们没有观察到任何对胰高血糖素和PP激素都呈阳性的细胞？（c） 为什么内分泌细胞在缺乏Pax4型? （d） 同样，为什么PP细胞数在阿尔克斯变种人？关于α或PP细胞命运的差异规范（问题a和b），逻辑上的解释是两种命运相互排斥。这很容易通过两种转录因子的相互抑制来实现，正如Arx和Pax4在早期发育阶段所发生的那样，一种因子促进α细胞命运，另一种因子则促进PP细胞谱系；Arx是否是其中之一尚不清楚。或者，辅因子的选择性存在、Arx的差异翻译后修饰、Pax4的一种未知功能、Arx依赖于发育阶段的作用和/或不同的Arx蛋白阈值可以解释一个谱系优于另一谱系的原因。很明显，还需要进一步的工作来区分这些可能性：酵母2-杂交筛选以发现潜在的Arx结合伙伴，以及对我们手中不同功能丧失和获得线的转录组的聚类分析正在进行中，应该可以进一步了解所涉及的机制。

关于功能丧失和功能丧失动物之间PP细胞含量的差异（问题c和d）：阿尔克斯在内分泌组织中明确显示其参与PP细胞的生成。然而，Arx与PP细胞谱系之间的分子机制尚不清楚。事实上，在阿尔克斯和/或Pax4型突变体中，未发现PP细胞含量发生统计学变化。应该强调的是，由于正常胰岛中的PP细胞数量很少，这一分析非常复杂：很可能是在Arx或Pax4缺失后，如果样本数量没有显著增加，就无法从统计学上确定PP细胞含量的变化。有趣的是，通过使用微阵列方法结合定量RT-PCR，PP转录物或PP细胞相关标记mRNA减少了约1.9倍阿尔克斯突变体（P.Collombat，未发表的观察结果），表明阿尔克斯实际上，缺失可能导致PP细胞数量减少。然而，如果这是真的，与双转基因动物相比，PP细胞含量的改变幅度将大大降低。此外，增加了模型的复杂性，前面提到的内分泌细胞消融实验表明，PP细胞的丢失可能与β和δ细胞的丢失有关。这一发现可能表明，除了Arx的参与外，PP细胞的发生可能与β和δ细胞的发生有关。因此，很明显，要充分了解PP细胞发生的分子机制，需要涉及多种方法的深入研究，例如（a）Arx和Pax4的假定伙伴和靶点的特征；（b） 胰腺形态发生过程中两种因子潜在翻译后修饰的测定；（c） 表征Pax4型胚胎发育后期和整个成年期的表达；和（d）对WT、功能丧失和功能获得基因型中Arx-、Pax4-和PP表达细胞的联合血统追踪分析。

我们的研究表明阿尔克斯能够通过细胞自主将分化的β细胞转化为具有α和PP细胞特征的细胞，但也表明分化后的β细胞存在可塑性。在这方面，之前的几项研究表明，特定内分泌细胞的命运可能是可逆的。事实上，Wang等人(38)体外研究表明，INS-1细胞中主要负形式Pdx1的过度表达导致β细胞特异性标记物的显著减少，同时α细胞决定簇的增加。类似地，在删除Pdx1页在β细胞基因中，β细胞含量减少，同时α细胞数量增加(14). 最有趣的是观察到大量细胞同时表达胰岛素和胰高血糖素，这表明在β细胞表型转化为α细胞表型的过程中存在过渡状态。尽管阿尔克斯在这些研究中没有对表达进行分析，这些结果与目前的研究结果之间的相似性表明可能涉及导致表型转换的共同机制。

总之，我们的分析表明，Arx是必要的，也足以指导内分泌祖细胞以牺牲β和δ细胞系为代价，采用产生胰高血糖素的细胞身份。此外，Arx似乎在促进PP产生细胞的命运中具有未被怀疑的作用。重要的是，当Arx在成熟的成人β细胞中体外表达时，Arx能够重新指定β细胞表型，并赋予这些细胞α或PP细胞特性。鉴于在内分泌胰腺规范化过程中Arx和Pax4活性之间的拮抗作用，可以想象Pax4型和/或抑制阿尔克斯可能促进内分泌祖细胞向β细胞谱系的专一性规范和/或将内分泌细胞转化为β细胞，从而为治疗目的开辟了有趣的前景。

方法

转基因动物的产生。

用于生成cArxOE鼠标线的策略如图所示​图1。1.用Pdx1Cre、Pax6Cre或InsCore小鼠进一步繁殖转基因动物(17,34,35)并结合荧光显微镜进行GFP检测和基因分型PCR进行基因分型Cre公司和β-半乳糖苷酶基因。在第二个育种方案中，cArxOE小鼠与诱导型Pdx1Cre系杂交。如前所述进行三苯氧胺诱导(39)一周后对4周大的动物进行检查。德国奥尔登堡Nidersäxhsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmitetelsicherheit委员会批准了动物护理和实验用途。

免疫组织化学。

组织在4°C下用4%多聚甲醛固定过夜，并包埋在石蜡中，并将6μm切片应用于载玻片。如前所述对这些切片进行分析(24). 为了进行共同保护实验，根据制造商的说明，通过延长在温石蜡中的培养时间（最多2天）和在无遮蔽溶液（Vector Laboratories）中对切片进行压力清洗，消除转基因动物中发现的GFP信号。用VECTASTAIN ABC试剂盒（Vector Laboratories）以四氯化二氨基联苯胺为底物，进行β-半乳糖苷酶表达的免疫组织化学评估。使用的主要抗体如下：小鼠单克隆抗胰岛素、抗胰高血糖素（1:1000；Sigma-Aldrich）、抗Ngn3（1:500）和抗β-半乳糖苷酶（1:1000，Promega）；豚鼠抗胰岛素、抗胰高血糖素（1:1000；Sigma-Aldrich）和抗PP（1:200）；以及兔抗生长抑素（1:600；Dako）、抗PP（1:200；Dako）、抗谷氨酸（1:500；Chemicon）、抗Pdx1（1:500，Chemicon”）、抗Brn4（1:1000；Chemiconic）、抗Nkx6.1（1:3000）、抗-Nkx2.2（1:1000，由美国纽约哥伦比亚大学T.Jessell善意提供）、抗-Brn4（1:2000；由G善意提供。罗森菲尔德（Rosenfeld），霍华德·休斯医学院（美国加利福尼亚州拉荷亚），抗Pax6（1:500；由S.Saule，CNRS UMR 146，Orsay，France善意提供），抗Arx（1:1000），抗CART（1:11000），抗MafA（1:1500；由I.Artner，Vanderbilt University Medical Center，Nashville，Tennesse，USA善意提供）和抗MafB（1:500，由I善意提供。阿尔特纳）。使用的二级抗体（1:1000；Invitrogen）为594 Alexa抗小鼠、488 Alexa防小鼠、594 Alexa抗兔、488 Allxa抗兔，594 Alexa抗豚鼠和488 Alexa防豚鼠。用共焦显微镜（Olympus）分析染色切片。

葡萄糖、胰岛素和胰高血糖素水平测定。

使用OneTouch葡萄糖监测试剂盒（强生公司）和15μl外周血测定葡萄糖水平（mg/dl）。血糖水平表示为平均±SEM（在某些情况下，血糖水平超过仪器的600 mg/dl检测阈值；随后将该值用于统计目的）。根据制造商的说明，使用RIA（Linco）对胰岛素和胰高血糖素水平进行量化。

β-半乳糖苷酶染色。

分离胰腺组织并将其固定在4%多聚甲醛中过夜。接下来，在PBS中清洗胚胎和组织，然后在染色溶液（4 mM K3[Fe（CN）]6）、4 mM K4[Fe2，和0.4 mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚基-d日-吡喃半乳糖苷。切片前，组织通过乙醇系列脱水，在甲苯中清除，并包埋在石蜡中进行进一步切片。

胰岛素产生细胞系的转染。

为了允许阿尔克斯转染MIN6和βTC3胰岛素生成细胞系（脂质内酰胺；Invitrogen），构建如图所示​图11（上图）在移除Cre表达细菌中的GFP盒后。使用原始结构（表达GFP）作为转染对照。转染48小时后收集数据。

定量RT-PCR分析。

根据制造商的说明，使用QuantiTect SYBR Green RT-PCR试剂盒（QIAGEN）和经验证的引物（QIAGE；补充表1）进行RNA分离、cDNA合成和RT-PCR。PCR反应和检测在Mastercycle ep上进行实丛循环器，使用GAPDH和HPRT1作为内部控制，以实现正常化。

统计。

文本和图例中描述了用于数据比较的不同方法。简单地说，单因素方差分析结合纽曼-凯尔斯检验用于多人群比较，而单尾学生的t吨检验用于比较单方差群体。P（P）小于或等于0.05的值被认为是显著的。

补充材料

补充数据：
单击此处查看。（879K，pdf）

致谢

我们非常感谢G.Gradwohl、G.Mellizer和M.Diaconu的讨论，以及Pascal Dowling对手稿的仔细阅读。我们还感谢T.Mündiger、R.Faubel、U.Franke和S.Schrötter提供了出色的技术援助，以及U.Teichman和我们的动物设施工作人员对小鼠的支持。我们感谢T.Jessell、I.Artner和S.Saule提供试剂，感谢D.A.Melton为我们提供小鼠。这项工作得到了马克斯·普朗克学会（A.Mansouri和P.Collombat）、H.Storz博士和Alte Leipziger基金会（A.Mansuri）、瑞士国家科学基金会（P.L.Herrera）、JDRF（青少年糖尿病研究基金会）欧洲β细胞治疗中心（P.Serup和P.L.Errera）的支持，和NIHβ细胞生物学联合会（授予U19 DK072495-01；P.Collombat、J.Heckesher-Sörensen、P.L.Herrera、P.Serup和A.Mansouri）。

脚注

使用的非标准缩写：Arx，Aristaless-related同源异型盒；cArxOE（小鼠），转基因小鼠能够有条件地错误表达阿尔克斯基因；诱导型Pdx1Cre；Ngn3、Neurogenin3；PP，胰多肽。

利益冲突：提交人声明，不存在利益冲突。

本文引文： 临床杂志。投资。 117:961–970 (2007). doi:10.1172/JCI29115

参见第页开头的相关评论971.

工具书类

1Adrian T.E.、Bloom S.R.、Hermansen K.、Iversen J.分离灌流犬胰腺的胰多肽、胰高血糖素和胰岛素分泌。糖尿病。1978;14:413–417.[公共医学][谷歌学者]
2Csaba Z.，Dournaud P.生长抑素受体的细胞生物学。神经肽。2001;35:1–23.[公共医学][谷歌学者]
三。Roncoroni L.，Violi V.，Montanari M.，Muri M.。生长抑素对外分泌胰腺的影响对肿瘤性全胰腺外瘘的评估。美国胃肠病学杂志。1983;78:425–428.[公共医学][谷歌学者]
4Heller R.S.等。胰腺ε细胞发育的遗传决定因素。开发生物。2005;286:217–224.[公共医学][谷歌学者]
5Wierup N.、Svensson H.、Mulder H.、Sundler F.ghrelin细胞：人类胰腺中一种新的发育调节胰岛细胞。雷古尔。佩普。2002;107:63–69.[公共医学][谷歌学者]
6Edlund H.胰腺器官发生：发育机制和治疗意义。Nat.Rev.基因。2002;三:524–532.[公共医学][谷歌学者]
7Herrera P.L.等。小鼠内分泌胰腺的胚胎发生：胰腺多肽基因的早期表达。发展。1991;113:1257–1265.[公共医学][谷歌学者]
8Teitelman G.、Alpert S.、Polak J.M.、Martinez A.、Hanahan D.小鼠内分泌胰腺的前体细胞共表达胰岛素、胰高血糖素和神经元蛋白酪氨酸羟化酶和神经肽Y，但不表达胰腺多肽。发展。1993;118:1031–1039.[公共医学][谷歌学者]
9Upchurch B.H.、Aponte G.W.、Leiter A.B.在发育中的小鼠胰腺中所有四种胰岛细胞类型中肽YY的表达表明一个共同的肽YY产生祖细胞。发展。1994;120:245–252.[公共医学][谷歌学者]
10.Pictet R.L.、Clark W.R.、Williams R.H.、Rutter W.J.胚胎胰腺发育的超微结构分析。开发生物。1972;29:436–467.[公共医学][谷歌学者]
11.Jonsson J.、Carlsson L.、Edlund T.和Edlund H.小鼠胰腺发育需要胰岛素促动因子1。自然。1994;371:606–609.[公共医学][谷歌学者]
12Ahlgren U.，Jonsson J.，Edlund H.在IPF1/PDX1缺乏小鼠中，胰腺间质的形态发生与胰腺上皮的形态发生是不耦合的。发展。1996;122:1409–1416.[公共医学][谷歌学者]
13Offield M.F.等。PDX-1是胰腺生长和十二指肠头端分化所必需的。发展。1996;122:983–995.[公共医学][谷歌学者]
14Ahlgren U.、Jonsson J.、Jonson L.、Simu K.、Edlund H.小鼠Ipf1/Pdx1基因的β-细胞特异性失活导致β-细胞表型丢失和成熟型糖尿病。基因发育。1998;12:1763–1768. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
15Grapin-Botton A.、Majithia A.R.和Melton D.A.胰腺形成的关键事件是由胰腺调节基因的异位表达在肠道内胚层触发的。基因发育。2001;15:444–454. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
16Apelqvist A.等人。Notch信号控制胰腺细胞分化。自然。1999;400:877–881.[公共医学][谷歌学者]
17.Gu G.，Dubaskaite J.，Melton D.A.胰腺谱系的直接证据：NGN3+细胞是胰岛祖细胞，与导管祖细胞不同。发展。2002;129:2447–2457.[公共医学][谷歌学者]
18Jensen J.等人，从表达神经生长素3的前体独立发育胰腺α和β细胞：notch通路在抑制过早分化中的作用。糖尿病。2000;49:163–176.[公共医学][谷歌学者]
19Schwitzgebel V.M.等人。神经生长素3的表达揭示了胰腺中的胰岛细胞前体群。发展。2000;127:3533–3542.[公共医学][谷歌学者]
20Sommer L.、Ma Q.和Anderson D.J。神经原，一个新奇的家族无调性的-相关bHLH转录因子是揭示发育中的CNS和PNS中祖细胞异质性的假定哺乳动物神经元决定基因。.分子细胞。神经科学。1996;8:221–241.[公共医学][谷歌学者]
21Gradwohl G.、Dierich A.、LeMeur M.、Guillemot F。神经生长素3是胰腺四种内分泌细胞系发育所必需的。.程序。国家。阿卡德。科学。美国。2000;97:1607–1611. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
22Sussel L.等人。缺乏同源域转录因子Nkx2.2的小鼠因胰腺β细胞分化受阻而患有糖尿病。发展。1998;125:2213–2221.[公共医学][谷歌学者]
23Sander M.等人。同源框基因Nkx6.1位于Nkx2.2的下游，是胰腺中β细胞形成的主要途径。发展。2000;127:5533–5540.[公共医学][谷歌学者]
24Collombat P.等人。Arx和Pax4在内分泌胰腺发育中的对抗作用。基因发育。2003;17:2591–2603. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
25Sosa-Pineda B.、Chowdhury K.、Torres M.、Oliver G.、Gruss P.。Pax4基因对于哺乳动物胰腺中胰岛素分泌β细胞的分化至关重要。自然。1997;386:399–402.[公共医学][谷歌学者]
26Smith S.B.，Ee H.C.，Conners J.R.，德国M.S.配对同源结构域转录因子PAX4在胰腺早期发育中起转录抑制因子的作用。分子细胞。生物。1999;19:8272–8280. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
27Ahlgren U.、Pfaff S.L.、Jessell T.M.、Edlund T.和Edlund H.胰腺间质和胰岛细胞形成中ISL1的独立需求。自然。1997;385:257–260.[公共医学][谷歌学者]
28Artner I.等。MafB：胰高血糖素基因的激活剂，在发育中的胰岛α和β细胞中表达。糖尿病。2006;55:297–304.[公共医学][谷歌学者]
29遗传分析表明，PAX6是胰腺激素基因正常转录和胰岛发育所必需的。基因发育。1997;11:1662–1673.[公共医学][谷歌学者]
30St-Onge L.、Sosa-Pineda B.、Chowdhury K.、Mansouri A.、Gruss P.Pax6是分化小鼠胰腺中产生胰高血糖素的α细胞所必需的。自然。1997;387:406–409.[公共医学][谷歌学者]
31Guz Y.等。小鼠STF-1（一种推测的胰岛素基因转录因子）在个体发育期间在胰腺、十二指肠上皮、胰腺外分泌和内分泌祖细胞中的表达。发展。1995;121:11–18.[公共医学][谷歌学者]
32Matsuoka T.A.等人。MafA转录因子似乎负责胰岛素的组织特异性表达。程序。国家。阿卡德。科学。美国。2004;101:2930–2933. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
33Collombat P.等人。Arx和Pax4基因的同时缺失促进了生长抑素产生细胞的命运规范，但损害了小鼠内分泌胰腺中的α细胞和β细胞谱系。发展。2005;132:2969–2980.[公共医学][谷歌学者]
34Ashery-Padan R.等人。胰腺中Pax6的条件性失活会导致糖尿病的早期发病。开发生物。2004;269:479–488.[公共医学][谷歌学者]
35Herrera P.L.成人胰岛素和胰高血糖素产生细胞从两个独立的细胞系分化而来。发展。2000;127:2317–2322.[公共医学][谷歌学者]
36Jensen P.B.等人。下丘脑饱食肽CART在厌食症和非厌食症胰岛肿瘤以及正常胰岛中表达。FEBS信函。1999;447:139–143.[公共医学][谷歌学者]
37Herrera P.L.等人。通过靶向表达激素驱动的毒物基因消融胰岛内分泌细胞。程序。国家。阿卡德。科学。美国。1994;91:12999–13003. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
38Wang H.等。Pdx1水平定义了胰腺基因表达模式和细胞谱系分化。生物学杂志。化学。2001;276:25279–25286.[公共医学][谷歌学者]
39Zhang H.，Fujitani Y.，Wright C.V.，Gannon M.三苯氧胺诱导的Cre重组酶在胰岛中的有效重组。起源。2005;42:210–217..[公共医学][谷歌学者]
来自的文章临床研究杂志由以下人员提供美国临床研究学会