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分子生物学细胞。2007年4月；18(4): 1421–1429.
数字对象标识：10.1091/桶。E06-09-0780
预防性维修识别码：项目编号1838981
PMID：17287396

Prox1通过整合素α9和其他信号级联诱导淋巴内皮分化保存图片、插图等的外部文件。对象名为dbox.jpg保存图片、插图等的外部文件。对象名为vbox.jpg

三岛光一,*† 水井裕久,* 斋藤明,* 吉松康弘,* Natsuko Imaizumi公司,* Shinji Masui公司,‡ Masanori Hirashima公司,§ 托鲁·莫里萨达,§ 小池裕一,§ 荒井诚,† Niwa Hitoshi,‡ Hajime Kubo先生,‖ Toshio Suda公司,§和Kohei Miyazono先生通讯作者*
本·马戈利斯，监控编辑器
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补充资料

摘要

在胚胎淋巴发育过程中，同源盒转录因子Prox1在血管内皮细胞亚群向VEGF-C表达细胞的萌发和迁移中起着重要作用。然而，Prox1对内皮细胞行为的影响仍有待阐明。在这里，我们表明Prox1通过诱导整合素α9的表达，抑制片状形成并刺激内皮细胞的运动。Prox1表达的BEC通过上调整合素α9和VEGF受体3（VEGFR3）的表达优先向VEGF-C迁移。在小鼠胚胎中，与BEC相比，表达Prox1的淋巴管内皮细胞（LECs）中VEGFR3和整合素α9的表达增加。敲低人LECs中Prox1的表达导致整合素α9和VEGFR3的表达降低，导致对VEGF-C的化学反应性降低。这些发现表明，Prox1通过调节多个信号级联在赋予和维持LECs特性方面发挥着重要作用，整合素α9可能是Prox1下游淋巴管生成的关键调节因子。

简介

淋巴管的主要作用是排出从毛细血管漏出的间质液体并将其返回血管。此外，淋巴系统通过将巡逻组织的免疫细胞输送到淋巴器官来发挥免疫功能(威特等。, 2001). 淋巴管的不足或阻塞会导致淋巴水肿，其特征是使受累组织无法肿胀。此外，在许多类型的癌症中，淋巴管是肿瘤转移的主要途径，区域淋巴结转移已被证明与癌症进展相关(Karpanen和Alitalo，2001年).

尽管淋巴管在正常和病理条件下都很重要，但由于缺乏特异性标记物，淋巴管生成的研究进展受到阻碍。最近的研究揭示了在淋巴管发育中起重要作用的各种转录和信号成分。胚胎淋巴管内皮细胞（LECs）从颈静脉中萌芽并迁移形成初级淋巴丛(奥利弗，2004年). 在E10小鼠胚胎中繁荣-相关转录因子Prox1在主静脉内皮细胞的一个子集中表达，它们从中萌芽形成初级淋巴囊(威格尔和奥利弗，1999年;维格勒等。, 2002). 在探头1-在胚胎期（E）10.5天，从静脉中萌发的LEC似乎未受影响，但在E11.5–E12.0左右，它们的迁移被阻止，导致淋巴管系统完全缺失。Prox1是一种同源盒转录因子，已被证明能上调成熟BEC中淋巴管内皮细胞（LEC）标记物的表达，下调血管内皮细胞（BEC）标记(商行等。, 2002;佩特罗娃等。, 2002). 这些发现表明，Prox1通过重新编程BEC和LECs特异标记物的表达谱来调节胚胎BEC向LECs分化的程序。然而，在淋巴管生成过程中，哪些靶基因诱导Prox1的功能尚不清楚。缺乏一些Prox1靶基因（包括足蛋白和血管内皮生长因子受体3（VEGFR3））的小鼠缺乏淋巴血管生成。

VEGFR3是淋巴管特异性VEGFs、VEGF-C和VEGF-D的受体。VEGF-C-对淋巴管的正常发育很重要，因为淋巴管中的素食主义者导致小鼠胚胎中淋巴管系统完全缺失(卡卡宁等。, 2004). 在素食主义者-空白小鼠，LECs最初在主静脉中分化，但不能迁移并形成初级淋巴囊，这表明VEGF-C是胚胎淋巴管生成过程中一个重要的趋化因子和生存因子。素食者3缺失导致妊娠中期血管重构缺陷和胚胎死亡，表明其在早期血管发育中的重要性(杜蒙特等。, 1998).

最近，整合素α9β1被证明是VEGF-C和VEGF-D的受体(弗拉哈基斯等。, 2005).整合素α9-null小鼠在6-12天龄时死于双侧乳糜胸，表明淋巴发育存在潜在缺陷(Huang（黄）等。, 2000). 此外，整合素α9被证明是肝细胞生长因子（HGF）介导的信号的靶基因，在组织修复和炎症过程中诱导新淋巴管生成(卡吉亚等。, 2005). 血小板衍生生长因子受体β（PDGFRβ）是PDGF-BB的受体之一，这两种受体酪氨酸激酶也可诱导新淋巴生成(曹等。, 2004)以及作为FGF-2受体之一的成纤维细胞生长因子受体3（FGFR3）(小腿等。, 2006). 值得注意的是，最近发现Prox1可以诱导BEC中FGFR3的表达(小腿等。, 2006).

尽管各种信号级联与胚胎和/或成人淋巴管生成有关，但它们与Prox1的关系仍不清楚。此外，尽管Prox1已被证明能激活VEGF-C/VEGFR3和FGF-2/FGFR3信号，但Prox1对内皮细胞行为的直接影响尚未阐明。为了解决这些问题，我们在两种类型的内皮细胞中表达Prox1，即小鼠胚胎干细胞（ESC）衍生的内皮细胞和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）。我们发现，Prox1表达通过调节血管和淋巴信号成分的表达来调节内皮细胞的趋化性、片状形成和迁移，并首次将整合素α9确定为Prox1的靶基因。有趣的是，我们的发现揭示了整合素α9在LECs的片状形成和迁移中起着关键作用。这些发现在发育中的小鼠胚胎中得到证实，表明它们在体内具有重要意义。此外，Prox1在LECs中的表达下调导致VEGFR3和整合素α9的表达降低，导致对VEGF-C的化学反应性降低。这些发现表明Prox1通过调节与淋巴管生成相关的多个信号级联，改变了BECs的特性，并维持了LECs的特征。

材料和方法

细胞培养与腺病毒感染

从亲代MGZ5TcH2细胞建立Tc诱导的ES细胞系如下所述(马叙伊等。, 2005). MGZ5 ES细胞的维护、分化、培养和细胞分选如所述(山下等。, 2000). 除非另有说明，否则每个实验中均使用VEGF-A（30 ng/ml）、VEGF-C（300 ng/ml。HUVEC从Sanko Junyaku获得，并按所述进行培养(奥塔等。, 2002). 人真皮淋巴管内皮细胞（HDLECs）从克隆人（加利福尼亚州圣地亚哥）获得，并在含有5%胎牛血清（FBS）和EC生长补充剂（克隆人）的内皮基础培养基（EBM）中培养。按所述制备并使用带有野生型和突变型小鼠Prox1的重组腺病毒(藤饭等。, 1999).

RNA干扰和寡核苷酸

如前所述，将小干扰RNA（siRNAs）引入细胞(小菊（Koinuma）等。, 2003). 人Prox1 siRNA的靶序列为5′-CACTTTATTCGAGAGTGCAA-3′。对照siRNA从Ambion（Austin，TX）获得。

免疫组织化学和Western Blot分析

用于免疫组织化学的血小板内皮细胞粘附分子1（PECAM1；Mec13.3）和α-平滑肌肌动蛋白（SMA；1A4）单克隆抗体分别购自BD PharMinen（加州圣地亚哥）和Sigma（密苏里州圣路易斯）。按说明对培养细胞进行染色(山下等。, 2000). 使用相控显微镜（IX70型；奥林巴斯，梅尔维尔，纽约州）或共焦显微镜（LSM510 META型；卡尔蔡司显微成像，纽约州桑伍德）拍摄染色细胞。所有图像都以JPEG或TIFF格式导入Adobe Photoshop（加利福尼亚州圣何塞），用于对比度处理和图形组合。用于蛋白质印迹分析和免疫组织化学的FLAG和α-微管蛋白抗体从Sigma获得。Western blot分析和免疫组化分别从eBioscience（加利福尼亚州圣地亚哥）、RDI（新泽西州佛兰德斯）、Santa Cruz Biotechnology（加利福尼亚州圣克鲁斯）和Chemicon（加利福尼亚州特梅库拉）获得小鼠VEGFR3、足蛋白、人VEGFR4和Prox1的抗体。按说明进行蛋白质印迹分析(川端康成等。, 1998).

荧光激活细胞分类

为了对LEC和BEC进行分类，我们使用FACS Vantage（加利福尼亚州山景城Becton Dickinson）对小鼠胚胎细胞进行荧光激活细胞分类（FACS），如前所述(莫里萨达等。, 2005). 简单地说，分离E14小鼠胚胎，并对CD45-哌啶素叶绿素蛋白（PerCP）花青素5.5（Cy5.5）进行抗体染色，以分类CD45-非造血细胞，以便进一步分析。随后，用生物素化的抗LYVE-1抗体（ALY7）培养细胞，然后用别藻蓝蛋白结合的链霉亲和素（加州圣地亚哥PharMinen）培养细胞。对于双重或三重染色，细胞用CD31-藻红蛋白（PE）/FITC、CD34-PE（PharMinen）和TEK4-PE.14染色。

RNA分离和RT-PCR

根据制造商的说明，使用ISOGEN试剂（日本东京，日本）制备总RNA，并通过随机启动和上标第一链合成试剂盒（加利福尼亚州卡尔斯巴德，Invitrogen）进行反向转录。使用GeneAmp 5700序列检测系统（日本东京应用生物系统公司）进行定量RT-PCR分析。如补充表1所示，PCR产物的引物序列和预期大小可在线获取。

迁移分析

使用细胞培养插入物（8-μm孔径，BD Biosciences，San Jose，CA）测定趋化性。共5×104将细胞接种于含有0.5%血清的培养基中，并在下室中作为化学引诱剂迁移至各种生长因子中4 h。当检测抗整合素α9β1中和抗体（Chemicon）时，用胰蛋白酶/EDTA分离细胞，与中和抗体（30μg/ml）孵育，并在上室播种。用棉花芽小心地去除上腔中的细胞，将膜底部的细胞固定并用0.2%/甲醇20%的结晶紫染色。通过计数染色细胞进行量化。至少进行三次分析。

视频时间推移显微镜

在装有硬件控制运动台的Leica DM IRB显微镜（伊利诺伊州迪尔菲尔德）上，在37°C/5%CO的血清减少（0.5%）培养基中24小时以上，对迁移细胞进行时间成像2每15分钟使用徕卡DC350F CCD相机获取图像，并使用Image J软件（马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）进行分析。通过测量细胞核在24小时内移动的距离来分析每个细胞的迁移(米歇尔等。, 2005). 通过分析每组至少10个细胞来计算平均迁移速度。

结果

Prox1在ESC衍生内皮细胞中的表达诱导形态学改变并抑制片状物形成

为了检测Prox1表达对胚胎内皮细胞的影响，我们使用了来自小鼠胚胎干细胞的体外血管分化系统(山下等。, 2000). 该系统允许我们诱导内皮细胞和壁细胞从表达VEGF受体2（VEGFR2，Flk1）的共同祖细胞衍生而来。因为我们想诱导分化内皮细胞中Prox1的表达而不是未分化的ESC，所以我们建立了携带四环素（Tc）可调节Prox1转基因（Tc-Prox1）或无转基因（Tc-Empty；补充图1A；马苏等。, 2005). 从未分化的Tc-Prox1细胞培养物中去除Tc，但不去除Tc-Empty细胞培养物，诱导了FLAG表位标记的Prox1基因的表达（补充图1B）。

为了检测Prox1表达对血管发育的影响，我们在Tc存在下将Tc Empty和Tc-Prox1 ES细胞分化为表达Flk1的（Flk1+）血管祖细胞，从而不诱导转基因表达。使用抗Flk1抗体对Flk1+细胞进行分类，并在有或无Tc的情况下进行再分化。如图1A、 Prox1转基因表达仅在不含Tc的情况下在来源于Tc-Prox1 ES细胞的血管细胞中诱导。来源于ESC的血管细胞的Prox1基因表达水平大约是来源于E14小鼠胚胎的LEC内源性表达水平的两倍（补充图S1C）。当Prox1不表达时，ESC衍生的内皮细胞形成一个细鹅卵石样的内皮层结构(图1A） ●●●●。然而，当表达Prox1时，内皮细胞呈现纺锤形，无法形成片状结构。

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Tc调节的Prox1表达对ESC衍生EC和HUVEC的形态和片状形成的影响。（A） Flk1+内皮祖细胞从分化的ESC中分离出来，ESC携带Tc调节的转基因编码FLAG表位标记的小鼠Prox1（Tc-Prox1）或对照转基因（Tc-Empty），并在有（+）或无（-）Tc的情况下进行再分化，以获得PECAM-1阳性的EC（底部，红色）和平滑肌α-肌动蛋白（SMA）-阳性壁细胞（底部，绿色）。检测FLAG-Prox1（顶部，蓝色）的表达以及内皮细胞（底部，红色）的形态和片状形成。比例尺，100μm。（B） 菌落形成、EC和壁细胞生成以及内皮层形成的定量。将来自Tc-Prox1 ESCs的Flk1+细胞与10%胎牛血清在无Tc或有Tc的情况下稀疏培养4 d，并对PECAM1（红色）和SMA（绿色）进行染色。计算每孔不同类型的菌落数，以确定Prox1对Flk1+细胞菌落形成的影响。观察到四种菌落类型：纯内皮细胞形成片状结构（内皮细胞片状，红色）；纯散射EC（EC散射，粉红色）；纯壁细胞（MC，绿色）；以及由内皮细胞和壁细胞组成的混合菌落（Mix，黄色）。实验重复至少三次，结果基本相同。棒材，50μm。（C） 感染编码LacZ、DNA-结合突变体（Mut）或野生型（WT）Prox1的腺病毒的HUVEC的形态学。棒材，100μm。

为了进一步分析Prox1在内皮细胞膜形成中的作用，我们进行了定量集落形成分析。当Flk1+细胞在VEGF-a的存在下以较低的密度进行培养时，它们从单个Flk1+细胞中形成四种类型的集落(山下等。, 2000;渡边等。, 2003)：PECAM1（CD31）+具有或不具有片状结构的纯内皮细胞（分别为片状内皮细胞和散射内皮细胞）、纯壁细胞（MC）以及两者的混合物（Mix；图1B） ●●●●。尽管在Prox1表达缺失和存在的情况下，纯EC菌落（EC散射和片状）的频率为～25%，但内皮片的形成受到Prox1的显著影响(图1B） ●●●●。在没有Prox1的情况下培养单个Flk1+细胞时，纯内皮细胞集落中形成片状物的频率为82%。当Prox1被表达时，大多数内皮细胞集落表现出分散的表型（片状形成的频率为22%）。此外，即使在没有Tc（未公布的数据）的情况下，95%来自Tc-Prox1 ESCs的薄片形成EC也无法表达Prox1，进一步表明ESC衍生EC中的Prox1表达抑制薄片形成。

Prox1诱导HUVECs的形态学变化并抑制其薄片的形成

接下来我们研究了Prox1转基因表达是否也调节了成熟静脉内皮细胞的形态和片状形成。我们使用编码野生型Prox1（Ad-Prox1WT）的腺病毒，这是一种Prox1突变体，在其DNA-结合域（Ad-Prod1Mut）中含有两个氨基酸替换(彼得罗娃等。, 2002)和LacZ（Ad-LacZ）作为对照。当90%以上的HUVEC受到感染时，野生型和突变型Prox1的表达水平在moi 100时是可比较的（补充图2A）（补充图2B）。Prox1转基因表达水平约为HDLECs内源性Prox1表达水平的三倍（补充图S2，B-D）。

内皮细胞的形态和薄片形成也受到Prox1的影响(图1C） ●●●●。尽管感染了编码LacZ或突变型Prox1的腺病毒的HUVEC形成了一个平坦的鹅卵石状结构，但表达Prox1基因的HUveC呈纺锤状，并没有形成片状结构。

Prox1表达增加内皮细胞的活动性

Prox1表达细胞失去鹅卵石样结构的现有发现促使我们研究Prox1对内皮细胞运动的影响。使用视频延时显微镜追踪单个内皮细胞显示，Prox1表达显著增加了ESC衍生内皮细胞（补充视频1和2以及图2A）和HUVEC（补充视频3和4以及图2B）的运动能力。这些发现表明，Prox1的表达导致内皮细胞的形态学改变，抑制细胞膜形成，并诱导内皮细胞运动，所有这些都可能是胚胎淋巴管生成进展的关键现象。

Prox1通过诱导整合素α9表达增加内皮细胞运动

接下来，我们研究了Prox1调节BEC形态变化的分子机制。彼得罗娃等。(2002)据报道，腺病毒介导的Prox1在人皮肤微血管内皮细胞（HDMECs）中的表达导致BEC标记表达下调和LEC标记表达上调。我们还发现，BEC标记（VE-cadherin和VEGFR2）和LEC标记（足蛋白和VEGFR3）的转录水平分别受到HUVEC中Ad-Prox1WT感染的下调和上调（补充图2），这表明Prox1对HUVECs中的血管和淋巴基因表达进行了重编程。

然后我们研究了Prox1激活VEGFR3信号是否介导Prox1诱导的形态学变化。然而，显性负向VEGFR3突变体对Prox1表达的HUVEC中VEGFR4信号的抑制(卡卡宁等。, 2000)未能诱导Prox1介导的表型逆转（补充图3），这表明VEGFR3信号不直接参与Prox1诱导内皮细胞形态变化。

最近，整合素α9，一个在LECs中优先表达的整合素家族成员(彼得罗娃等。, 2002)，被证明是VEGF-C和VEGF-D的受体(弗拉哈基斯等。, 2005). 此外，整合素α9-null小鼠出现淋巴系统缺陷(Huang（黄）等。, 2000). 因此，为了研究整合素α9在Prox1介导的形态学变化中的作用，我们首次研究了Prox1在整合素β9表达调控中的作用。如所示图3A和B，Prox1表达增加了ESC衍生EC和HUVEC中整合素α9的表达。

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整合素α9在HUVEC迁移中的作用。（A和B）通过定量实时PCR分析，在ESC衍生的EC（A）和HUVEC（B）中测定整合素α9转录物的表达。（C和D）HUVEC感染编码DNA-结合突变体（Mut）或野生型（WT）Prox1的腺病毒，并在存在对照IgG或抗整合素α9（intα9）中和抗体的情况下进行24小时的视频显微镜检查。显示了HUVEC（C）和综合细胞运动（D）的最终图像。棒材，100μm。每个值代表10次测定的平均值；巴，SD（E）通过Boyden室测定法测量细胞迁移。HUVEC感染编码DNA-结合突变体（Mut）或野生型（WT）的腺病毒（Ad），并在Boyden培养箱上放置对照IgG或抗整合素α9（intα9）-中和抗体，VEGF-C放置在下孔中。结果表示为迁移细胞数量与对照组（无引诱剂）的比例。每个值代表三次测定的平均值；巴，标准偏差。

为了阐明整合素α9在Prox1诱导表型改变中的作用，我们使用了抗人整合素β1中和（功能阻断）抗体。在培养基中加入抗整合素α9中和抗体后，观察到Prox1诱导的HUVEC形态改变的逆转和薄片形成的减少(图3C） ●●●●。此外，Prox1对HUVECs运动性的增加被抗整合素α9抗体降低到基础水平（补充视频5-8和图3D）。这些发现表明，Prox1诱导的HUVEC表型改变是由于整合素α9表达增加所致。

Prox1通过诱导整合素α9表达增加对VEGF-C的趋化作用

因为最近有报道称VEGF-C和VEGF-D是整合素α9β1的配体(弗拉哈基斯等。, 2005)，我们检测了Prox1上调整合素α9的表达是否有助于Prox1诱导内皮细胞向VEGF-C迁移的增加。腔室迁移分析表明，表达野生型Prox1的HUVEC向VEGF-C迁移，这种迁移被抗α9β1中和抗体阻断(图3E） 提示Prox1通过调节整合素α9的表达诱导内皮细胞向VEGF-C迁移。

Prox1表达抑制BEC对VEGF-A的趋化作用并通过调节其受体促进其对VEGF-C的趋化学作用

虽然我们的研究结果表明，VEGFR3的信号传导并不直接参与Prox1诱导的形态学变化（补充图3），但它可能在Prox1在内皮细胞中诱导的其他变化中发挥重要作用。表达VEGFR2的BEC和表达VEGFR3的LECs分别优先向其配体VEGF-A和VEGF-C迁移(马基宁等。, 2001). Prox1对HUVEC中VEGFRs表达的改变促使我们研究其对VEGFs的化学吸引力。培养箱迁移试验表明，VEGF-A而非VEGF-C刺激了表达突变型Prox1的HUVECs的趋化性(图4). 相反，VEGF-C（而非VEGF-A）诱导表达野生型Prox1的人运动。为了检测Prox1是否通过上调VEGFR3的表达来诱导HUVEC对VEGF-C的趋化性，我们使用编码野生型和显性负型VEGFR4的腺病毒。野生型VEGFR3的表达增强了HUVEC对VEGF-C的趋化性，但不改变其向VEGF-A的迁移。此外，显性负向VEGFR4信号的抑制显著降低了其对VEGF-C的趋化学性，这是由Prox1诱导的。这些发现表明，Prox1通过调节VEGFRs的表达以及整合素α9的表达来调节内皮细胞对VEGFs的趋化性。

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Prox1对VEGF-A和VEGF-C刺激的HUVEC迁移的影响。如材料和方法。HUVEC感染了编码DNA-结合突变体（Mut）或野生型（WT）Prox1的腺病毒（Ad），以及编码VEGFR3野生型（WT）、显性阴性突变体形式（d.n.Mut）、或Null（不编码转录物）的腺病毒，并将指示的化学引诱剂放置在Boyden培养箱的下孔中。使用Ad-Null对所有样本用相同数量的腺病毒感染HUVEC。结果表示为迁移细胞数量与对照组（无引诱剂）的比值。每个值代表三次测定的平均值；巴，标准偏差。

小鼠胚胎Prox1表达的LECs中VEGFR3和整合素α9的表达增加

为了研究Prox1诱导ESC衍生EC中VEGFR3和整合素α9表达的体内意义，我们比较了它们在E14小鼠胚胎LECs和BECs中的表达。我们之前提出了针对LEC标记物LYVE-1的单克隆抗体，并发现来自E14小鼠胚胎的分选CD45-CD31+CD34-lowLYVE-1+细胞代表LEC，CD45-CD1+CD34+LYVE-1-细胞代表BEC(莫里萨达等。, 2005). 我们证实，LYVE-1和Prox1的表达仅在分选的LEC中检测到(图5). 我们进一步检测了Prox1靶基因在LECs和BEC中的表达。在LEC和BEC组分的细胞中均检测到VEGFR3和整合素α9的表达，且它们在LEC中的表达水平高于BEC。这些发现共同表明，Prox1在体外诱导VEGFR3和整合素α9的表达可能模拟了胚胎淋巴管生成的过程。

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BEC和LEC标记在小鼠胚胎Prox1-expressing LECs中的表达。解剖E14小鼠胚胎，切除胚胎肝脏和脾脏。分离其他组织，并用抗CD45、LYVE1（ALY7）、CD31和CD34抗体进行FACS分选（见材料和方法). CD45−；CD31+；CD34+；LYVE1−BEC组分和CD45−；CD31+；CD34−；通过实时定量PCR分析LYVE1+LEC组分中LYVE1（A）、Prox1（B）、VEGFR3（C）和整合素α9（D）转录物的表达。每个值代表三次测定的平均值；巴，标准偏差。

LECs中Prox1基因敲除调控淋巴内皮标记物的表达及其细胞行为

Prox1的表达在胚胎淋巴管生成过程中启动，并在成熟LEC中保持，这促使我们研究敲低成熟LEC的Prox1表达是否会影响其特性。

我们在HDLEC细胞核中检测到内源性Prox1蛋白，而在HUVEC中未检测到Prox1蛋白质(图6A） ●●●●。HDLECs中Prox1、VEGFR3和整合素α9的转录物表达显著高于HUVECs（未发表的数据）。接下来，我们使用siRNAs降低Prox1水平(图6、B和C）。siRNA介导的Prox1的减少导致Prox1各种靶基因的表达减少，如VEGFR3和整合素α9(图6，D和E），而包括GAPDH在内的大多数基因的表达没有受到影响，这表明Prox1维持了HDLEC中LEC标记物的表达。

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内源性Prox1在HDLECs中的作用。（A） 用HUVECs（顶部）和HDLECs（底部）中的特异性抗体检测内源性Prox1（左侧；绿色）的表达，并用碘化丙啶（PI，中间；红色；右侧，合并）对细胞核进行反染。棒材，100μm。（B–E）通过实时定量PCR分析检测Prox1敲低对GAPDH（B）、Prox1（C）、VEGFR3（D）和整合素α9（E）表达的影响。一个加扰的siRNA序列（Ambion）被用作阴性对照siRNA（siNTC）。每个值代表三次测定的平均值；bars，SD。（F）Prox1基因敲除对HDLECs对VEGF-A（50 ng/ml）和VEGF-C（50 ng/ml）的趋化性的影响。通过Boyden小室试验测量细胞迁移，如材料和方法。用干扰siRNAs（siNTC）或Prox1-siRNAs转染HDLECs，并将其放置在Boyden培养箱上，将指定的化学引诱剂放置在较低的培养箱中。结果表示为迁移细胞数量与对照组（无引诱剂）的比值。每个值代表三次测定的平均值；条，SD。

据报道，成熟的LEC向VEGF-C迁移(马基宁等。, 2001). 为了研究Prox1敲除对HDLECs行为的影响，我们检测了它们对VEGFs的趋化性(图6F） ●●●●。尽管HDLECs向VEGF-A和VEGF-C迁移，但Prox1基因敲除导致了对VEGF-C的趋化性降低(图6F） ●●●●。这些结果表明，Prox1通过维持LEC标记的表达来维持LECs的特性。

讨论

最近的研究表明，淋巴管生成受VEGFs/VEGFR介导的各种信号级联调节(杜蒙特等。, 1998;卡卡宁等。, 2000;铃木等。, 2005)和整合素α9β1(Huang（黄）等。, 2000). 本研究表明，内皮细胞中Prox1的表达调节各种信号成分的表达，包括整合素α9、VEGFR2和VEGFR3，导致内皮细胞趋化性、片状形成和迁移的改变。我们还观察到Prox1调节血管生成素/Tie2介导的信号通路(莫里萨达等。, 2005)和FGF/FGFR3(小腿等。, 2006)在ESC衍生的EC和HUVEC中（未发布的数据）。此外，由于整合素α9与HGF介导的信号级联的调节有关(卡吉亚等。, 2005)，Prox1可间接调制HGF信号。这些发现以及先前的研究表明，Prox1是一种主转录因子，通过调节在淋巴管生成中起重要作用的多个信号级联，诱导内皮细胞分化为内皮细胞。

有趣的是，我们发现Prox1诱导来源于ESCs的Flk1+EC的生长，但抑制未分化ESCs的生长（未发表的数据）。这些发现表明，Prox1需要细胞型特异性调节剂来调节其转录活性，并进一步暗示了在胚胎淋巴分化过程中，在识别Prox1靶基因时选择合适的内皮细胞类型的重要性。虽然之前的研究使用成熟的人类皮肤内皮细胞来识别Prox1的靶基因(商行等。, 2002;彼得罗娃等。, 2002)，将ESC衍生的EC用于此目的将非常有趣。

Prox1对内皮细胞信号级联的改变分别导致血管内皮细胞膜形成减少、运动增强以及对VEGF-A和VEGF-C的趋化性下调和上调。一个重要的问题是，这些变化是否模拟了从BEC到LEC的分化。血管内皮和淋巴内皮在某些特定的形态学特征上有所不同。例如，毛细淋巴管比毛细血管大，管腔不规则或塌陷，基底膜不连续，细胞间连接复合体重叠，以及连接LEC和细胞外基质的锚定丝(威特等。, 2001). 体外培养的BEC和LEC的形态学观察结果存在争议。马基宁等。(2001)据报道，与从同一来源分离的BEC相比，使用抗VEGFR3抗体从人皮肤微血管细胞中分离的LEC在VEGF-C存在下呈现细长的细胞形状。然而，克里胡伯等。(2001)据报道，使用抗足蛋白抗体从真皮细胞悬浮液中分离出的LEC与从同一来源分离出的BEC在形态学上无法区分。这些结果的差异可能是由于分离和培养LEC和BEC的方法不同所致。

在胚胎淋巴管生成过程中，表达Prox1的内皮细胞从主静脉发芽并向表达VEGF-C的间充质细胞迁移(奥利弗，2004年). 这些观察结果表明，Prox1表达细胞需要移动才能形成初级淋巴囊。此外，Prox1诱导ESC衍生的内皮细胞和HUVEC的增殖（未发表的数据）。然而，这些细胞在VEGF-C表达区变得稳定，并形成毛细淋巴管。此外，目前的工作表明，Prox1诱导的内皮细胞形态变化并不依赖于VEGFR3（补充图S3），而是依赖于整合素α9(图3)对VEGF-C的趋化性增强需要VEGFR3和整合素α9(图3和​和4）。4). 这些研究结果表明，Prox1通过诱导整合素α9的表达激活内皮细胞，与VEGFR3协同对VEGF-C产生趋化性，VEGFR4的表达也由Prox1诱导，并通过主要由VEGF-C/VEGFR3.介导的信号稳定并诱导其成熟。观察到Prox1基因敲除抑制了成熟LEC的存活，这一假设得到了支持（未发表的数据）。因此，Prox1似乎是淋巴管生成的主转录因子，通过调节多个信号级联，在淋巴囊发育的大多数关键步骤中发挥关键作用，包括LECs的动员、迁移和增殖，以及淋巴毛细血管的稳定(图7).

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Prox1在血管内皮细胞（BEC）向淋巴管内皮祖细胞（LEPC）分化过程中的作用示意图。详见正文。

淋巴管在各种疾病的发病机制中起着重要作用，如淋巴水肿和癌症转移。本研究的结果表明，患者BEC和/或内皮祖细胞中Prox1的表达可能有助于淋巴水肿的再生医学治疗。或者，在癌症患者中敲除Prox1可能抑制肿瘤淋巴管生成并防止转移。

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Prox1对ESC衍生EC和HUVEC迁移的影响。通过视频延时显微镜测量细胞迁移，如材料和方法。（A） 来自Tc-Prox1 ESCs的EC接受24小时的视频显微镜检查（补充视频1和2）。（B） HUVEC感染编码DNA-结合突变体（Mut）或野生型（WT）Prox1的腺病毒（Ad），并进行24小时的视频显微镜检查（补充视频3和4）。结果表示为24小时内的综合细胞运动。每个值代表10次测定的平均值；巴，标准偏差。

补充材料

【补充材料】

致谢

我们感谢J.Yamashita博士、H.Miki、S.Nishikawa博士和东京大学分子病理学系成员的讨论。这项研究得到了日本教育、科学、体育和文化部科学研究补助金的支持。

使用的缩写：

欧盟委员会内皮细胞
电子稳定控制系统胚胎干细胞
PECAM1公司血小板内皮细胞粘附分子1
座椅模块组件α-平滑肌肌动蛋白
血管内皮生长因子血管内皮生长因子
贝克血管内皮细胞
LEC公司淋巴管内皮细胞。

脚注

这篇文章在年印刷之前在网上发表媒体中的MBC(http://www.molbiolcell.org/cgi/doi/10.1091/mbc.E06-09-0780)2007年2月7日。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为dbox.jpg保存图片、插图等的外部文件。对象名为vbox.jpg 本文的在线版本包含补充材料，网址为MBC在线(http://www.molbiolcell.org).

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文章来自细胞分子生物学由以下人员提供美国细胞生物学学会