跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
临床投资杂志。2007年5月1日；117(5): 1324–1334.
2007年4月5日在线发布。 数字对象标识：10.1172/JCI31240
预防性维修识别码：项目编号：1838928
PMID：17415416

MEF2信号和SRF活性介体STARS对不良心脏重塑的调节作用

久原光一郎,1 Gordon C.Teg管道,1 约翰·麦卡纳利,1 詹姆斯·理查德森,1,2 约瑟夫·A·希尔,1,三 朗达Bassel-Duby,1和埃里克·N·奥尔森1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

细胞骨架蛋白与心肌病的发病机制有关，但细胞骨架如何影响与不良心脏重塑相关的转录改变尚不清楚。条纹肌Rho信号激活剂（STARS）是一种定位于Z盘的肌特异性肌动蛋白结合蛋白，通过诱导肌球蛋白相关SRF共激活因子MRTF-a和-B的核转位来激活血清反应因子依赖性（SRF依赖性）转录。我们发现STARS在心肌肥大小鼠模型和衰竭人类心脏中表达上调。一个保守的区域星星启动子含有心肌细胞增强子因子-2（MEF2）的必要结合位点，是一种应激反应转录激活剂，它介导STARS的心脏表达，进而激活SRF靶基因。心脏中STARS的强制过度表达使心脏对压力过载和钙调神经磷酸酶信号敏感，导致心脏功能对这些肥厚刺激的反应过度恶化。这些发现表明，STARS作为MEF2和SRF之间的细胞骨架中介，调节心脏对应激信号的反应。

介绍

心脏对生物力学应激、组织损伤和神经体液激活的反应是肥大生长，伴随着心肌细胞大小和蛋白质含量的增加、细胞骨架重组和胎儿心脏基因的表达(1–三). 如果心脏肥大持续下去，会导致心肌病和心力衰竭，这是人类发病率和死亡率的主要原因。越来越多的证据表明，包括Z盘复合体在内的心肌细胞细胞骨架在扩张型心肌病和慢性心力衰竭的发病机制中起着关键作用(4,5). 心脏细胞骨架蛋白不仅参与细胞骨架的组织和生物力学力的产生，还参与应激信号的传递，导致心脏基因表达和功能的改变。然而，细胞骨架蛋白调节转录的精确分子机制基本上尚不清楚。

之前，我们报道了钙调素-1，一种Z盘蛋白，负调控心肌细胞中激活T细胞的钙调神经磷酸酶/核因子（钙调神经营养因子/NFAT）通路(6). 其他研究表明，细胞骨架蛋白FHL-2抑制ERK2介导的促肥大信号和血清反应因子介导的转录（SRF-介导转录）(7,8). 最近，研究表明，titin结合复合物通过调节MuRF2的定位来负调控SRF介导的转录，MuRF2是一种与SRF相互作用并抑制其活性的泛素连接酶(9). 虽然有证据表明肌聚蛋白与心肌肥大有关，但还需要进一步研究，以了解细胞骨架蛋白如何调节促肥大转录途径。

SRF通过结合保守序列[CC（a/T）调节即刻早期和肌肉特异性基因的表达6GG]称为CArG盒或血清反应元件(10,11). 大量研究表明，SRF参与心血管发育，并在心肌肥厚期间诱导胎儿心脏基因(12,13). 发育中心脏中SRF的靶向缺失导致致命的心脏缺陷，心脏特异性基因表达降低(14,15)而出生后心脏中SRF的过度表达会导致胎儿心脏基因表达增加的心肌病(16). 衰竭心脏中SRF的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3裂解也被证明产生一种显性负形式的蛋白质，这可能解释衰竭心肌中SRF靶基因的抑制(17).

肌钙蛋白和肌钙蛋白相关转录因子MRTF-A（MAL/MKL1）和MRTF-B（MKL2）构成SRF辅激活子家族(10,18–20). 心肌素在心脏和平滑肌细胞中特异性表达，对于SRF依赖性平滑肌基因的正常表达是足够和必要的(18,21,22). 相反，MRTF在广泛的细胞类型中表达(19)通过从细胞质到细胞核的重新分配，将肌动蛋白动力学和Rho信号通路耦合到SRF(23). 肌细胞增强因子-2（MEF2）是与肌肉发育相关的MADS盒基因家族的另一个成员(24–26).Mef2C型-null小鼠因心脏发育异常导致胚胎死亡(27). MEF2还与骨骼肌慢纤维型的维持、横纹肌代谢的控制以及通过直接和间接控制肌肉特异性靶基因的表达来应对应激信号的成人心脏病理重塑有关(28–31).

横纹肌Rho信号激活物（STARS）是一种肌特异性肌动蛋白结合蛋白，定位于肌节的I带（包括Z盘）和M线(32). STARS可通过诱导MRTF-A和-B的核移位激活SRF介导的转录(33). 在这里，我们发现STARS在心肌肥大小鼠模型和肌病人类心脏中的表达上调。心脏特异性和应激诱导型表达星星由近端启动子介导，该启动子包含一个重要的MEF2-结合位点。体内和体外STARS的心脏过度表达增加了SRF-依赖性胎儿心脏基因的表达，并使心脏对主动脉横带和钙调神经磷酸酶信号诱导的生物力学应激敏感。这些发现表明，STARS在MEF2和SRF之间起中介作用，并调节心脏应激反应。

结果

心肌肥厚和心肌病中STARS表达上调。

考虑到不良心脏重塑期间SRF靶基因表达的变化以及STARS刺激SRF活性的能力(12,13,32,33)，我们测试了STARS的表达是否可能在心肌肥大和心肌病模型中上调。如图所示​图1A，1A、，星星在胸主动脉结扎（TAB）诱导的压力过载小鼠心脏中，基因表达与心钠素（ANP）平行增加，心钠素是心脏重塑的典型标志物以及在心脏特异性α-肌球蛋白重链（α-MHC）启动子（Cn-Tg小鼠）控制下表达组成活性钙调神经磷酸酶的Tg小鼠的心脏中，这是一种心肌肥厚和心肌病模型(34)（图​（图1B）。1B） ●●●●。星星特发性心肌病患者心脏中的表达也显著增加（图​（图1C）。1C） ●●●●。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为JCI0731240.f1.jpg
实时RT-PCR分析心脏肥大和衰竭期间STARS的上调。

(A类)成绩单星星和ANP公司在TAB组和假手术对照组小鼠心脏中检测到。n个= 6. (B类)的表达式星星Cn-Tg小鼠和对照非Tg窝友（WT）的mRNA。n个= 6. (C类)的表达式星星mRNA在特发性心肌病（ICM）患者心脏和对照正常心脏中的表达。n个= 3. *P（P）< 0.05.

STARS启动子介导心肌特异性和应激诱导表达。

要识别顺式-控制星星转录后，我们产生了携带lacZ报告基因的Tg小鼠，该报告基因由小鼠上游的各种DNA片段控制星星基因。携带1581 bp 5'-上游区域的Tg小鼠星星该基因在E12.5和成年时显示了β-半乳糖苷酶的心脏表达（图​（图2，2，A–C）。该启动子还引导lacZ在成人骨骼肌中的表达。骨骼肌中的转基因表达在富含纤维的比目鱼肌中最为显著（图​（图2C）。2C） ●●●●。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为JCI0731240.f2.jpg
突变分析星星发起人。

(A类)的片段星星与hsp68最小启动子和lacZ连接的上游区域用于生成Tg小鼠。(B类)Tg小鼠E12.5的LacZ染色显示STARS-lacZ公司转基因。心脏的H&E染色切片如图所示。(C类)Tg小鼠横纹肌LacZ染色STARS-lacZ公司构造1。TA，胫骨前肌；指长伸肌；索尔、比目鱼。(D类和E类)测定心肌细胞中的荧光素酶活性(D类和E类)和COS-1细胞(E类)用荧光素酶报告质粒pGL3转染，该质粒连接到星星基因。(F类)突变的M1和M2区域的序列显示为红色(克)在M1和/或M2区域（mutM1、mutM2、mut1+M2）无突变或突变的-1581或-164STARS-luc转染的心肌细胞中测量荧光素酶活性*P（P）与无突变的报告者相比，<0.05。(H（H）)携带野生型构建物1或M1和M2区域（mutM1+M2）突变的构建物1的E12.5 Tg胚胎的LacZ染色。原始放大倍数，×2(B类、上部面板和H（H）); ×10 (B类，下部面板）。

这个顺式-监管要素星星通过分析Tg小鼠中一系列5'缺失的活性，进一步划定上游区域。转录起始位点上游-164bp的缺失并不影响心肌特异性表达，而进一步缺失-77bp则会抑制转基因的心肌表达，这表明-164bp到-77bp之间的区域对于心肌特异性的表达是必要的星星（图​（图2，2、A和B）。

的片段星星当–164到–77 bp区域被删除时，与荧光素酶报告子相关的启动子在心肌细胞中的活性显著降低（图​（图2D）。2D） 。在该区域内，我们发现两个亚区，即-138到-116 bp（M1）和-94到-77 bp（M2），调节心脏表达（图​（图2，2、E和F）。M1或M2序列的突变显著降低了-1581-bp和-164-bp的心脏活动星星启动子构建，并且双突变消除了心肌细胞中的启动子活性（图​（图2G）。2G） ●●●●。与这些发现一致，由-1581-bp控制的lacZ报告基因的表达星星M1和M2突变的启动子在Tg小鼠的心脏中显著减少（图​（图2H），2H） 表明M1和M2区域协同介导心脏表达。

评估–1581-bp星星启动子对肥厚应激有反应，我们将携带-1581STARS-lacZ转基因的Tg小鼠与表现出明显心肌肥厚的Cn-Tg小鼠杂交(34). 如图所示​图3A，三A、 STARS-lacZ转基因在Cn-Tg背景的小鼠中的表达比野生型同窝小鼠强得多。–1581-bp上游区域星星在培养的心肌细胞中也介导对内皮素-1（ET）和苯肾上腺素（PE）的诱导表达（图​（图3B）；三B） ；M1或M2的突变降低了-1581和-164-bp启动子对PE的反应，而M1和M2的双重突变则消除了这两个启动子对PE的反应（图​（图3C）。三C） ●●●●。–1581-bp的激活星星ET或PE的启动子与B型钠尿肽（BNP）启动子的启动子相当（数据未显示）。我们得出结论，M1和M2区域介导心脏特异性和应激诱导的星星转录。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为JCI0731240.f3.jpg
近端启动子区介导星星基因。

(A类)LacZ染色和活性(n个=4）野生型或Cn-Tg小鼠中携带构建物1的成年Tg小鼠心脏。原始放大倍数，×2。(B类)转染–1581STARS-Luc或对照pGL3的心肌细胞经100 nM ET、100μM PE或1 nM白血病抑制因子（LIF）处理24小时后的荧光素酶活性。(C类)转染-1581或-164的心肌细胞的荧光素酶活性星星-在M1或M2区域有或无突变的luc，用100μM PE治疗24小时*P（P）与无突变的报告者相比，<0.05。

MEF2C控制STARS表达。

在微阵列研究中，比较野生型和非野生型心脏的基因表达谱Mef2c公司-E8.5的胚胎无效，我们发现星星转录水平在Mef2c公司突变体（数据未显示）。实时PCR证实了这些发现（图​（图4A）。4A） ●●●●。虽然M1和M2区域不包含MEF2或其他已知肌源转录因子结合的典型保守序列，但M1区域包含一个类似MEF2结合共识位点[CTA（T/a）AAATAG/a]的序列（TTAAAAACAG）（图​（图4B）。4B） ●●●●。在凝胶迁移率变化分析中，M1序列结合的MEF2C在体外转化（图​（图4C），4C） 和针对MEF2 Myc-epitope标签的抗体引起了超位移（图​（图4C）。4C） ●●●●。移位的带被未标记的M1序列或MEF2一致序列从结蛋白基因，但不是由不相关的NFAT结合共识序列。用标记探针观察到类似的位移带模式结蛋白MEF2-绑定站点（图​（图4C）。4C） ●●●●。MEF2C未能绑定突变的M1序列或M2序列（数据未显示）。与这些结果一致，MEF2C显著增加了COS-1细胞和心肌细胞中与最小TATA盒融合的3个串联M1位点（3×M1-luc）相关的荧光素酶报告子的表达，而具有3个串联M2位点（3xM2-luc​（图4，4、D和E）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为JCI0731240.f4.jpg
对星星MEF2启动子。

(A类)星星野生型mRNA表达，Mef2c公司+/–、和Mef2c公司–/–E8.5的胚胎(n个= 3). (B类)小鼠和人类M1区序列与MEF2共识结合位点对齐。序列与图中的序列位于相反的链上​图2F。2F、(C类)用放射性标记的体外翻译myc标记MEF2C进行凝胶迁移率测定星星M1 DNA序列或结蛋白MEF2-结合位点作为探针。未标记的M1、结蛋白MEF2或不相关的NFAT共识站点被用作竞争对手（+表示100倍超额；++表示500倍超额）。抗myc抗体（myc-Ab）用于使MEF2复合物超移位。(D类和E类)COS-1细胞中的荧光素酶活性(D类)和心肌细胞(E类)与多聚M1区（3×M1-luc）、多聚M2区（2×M2-luc。

MEF2C的表达使COS-1细胞中–1581STARS-Luc和–164STARS-Loc的活性分别增加了40倍和14倍（图​（图5A）。5A） ●●●●。M1序列的突变显著降低了两个启动子对MEF2C的反应性，表明MEF2C激活了星星启动子通过M1区域。有趣的是，M2区的突变（MEF2C不能与之直接结合）也显著降低了启动子的MEF2C反应性，M1和M2区突变进一步降低了MEF2C诱导的表达（图​（图5A）。5A） ●●●●。这些结果表明M1和M2区域协同介导MEF2C激活星星转录。MEF2C显著增加了心脏（数据未显示）和非心脏（COS-1和NIH 3T3）细胞中与荧光素酶报告子融合的M1和M2的激活，M2区域的突变降低了MEF2C的活性，表明M2区域增强了MEF2的活性（图​（图5，5，B–D）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为JCI0731240.f5.jpg
M1和M2区域协同激活星星发起人。

(A类)COS-1细胞与-1581或-164STARS-luc共转染，M1或M2区域有或无突变，以及MEF2C表达载体。(B类)串联M1+M2（M1+M2-luc）或M1+突变M2（M1+mutM2-luc）融合到荧光素酶报告子的示意图。(C类和D类)COS-1或NIH 3T3细胞的荧光素酶活性分别与M1+M2-luc或M1+mutM2-luc和MEF2C表达载体共转染。

STARS通过SRF诱导ANP基因表达。

由于STARS在心肌肥厚和心肌病期间表达增加，与SRF靶基因的诱导一致，我们检测了STARS是否可能激活ANP公司启动子，包含2个SRF-结合位点(12,35). 在非心脏细胞中，STARS和SRF共激活因子MRTF-A的共同表达显著激活了ANP公司启动子（图​（图6，6、A和B）。如前所述(32,33)，STARS未能增强心肌蛋白介导的ANP公司（图​（图6，6（A和B），这是由于心肌蛋白的结构性定位于细胞核，使其对STARS的核移位具有抵抗力。STARS和MRTF-A在新生儿心肌细胞中的过度表达也会协同增加ANP公司启动子活性（图​（图6C）。6C） ●●●●。中2个CArG盒的突变ANP公司启动子完全消除了STARS和MRTF-A的作用（图​（图6，6、A、B和D）。STARS和MRTF-A还协同激活了由串联CArG盒（4×SRE-荧光素酶）控制的报告基因（图​（图6E），6E） 和4×CArG-荧光素酶仅由STARS激活被心肌蛋白的显性阴性突变体完全抑制，该突变体可以抑制心肌蛋白和MRTFs的活性（图​（图6F），6F） 表明STARS对SRF活性的影响是由心肌细胞内源性MRTFs介导的。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为JCI0731240.f6.jpg
STARS通过激活SRF诱导ANP表达。

(A类和B类)NIH 3T3中的荧光素酶活性(A类)和COS-1(B类)用ANP-luc或在ANP-luc中突变的2个CArG盒（CArGmut-luc）和编码STARS、MRTF-A和肌球蛋白的表达载体共转染的细胞。(C类–F类)ANP-luc与STARS和MRTF-A表达载体共转染心肌细胞的荧光素酶活性(C类); ANP-luc或CArGmut-luc和STARS表达载体数量增加(D类); 连接荧光素酶基因（4×CArG-luc）和STARS、MRTF-A或心肌蛋白表达载体的多重聚合CArG盒(E类); 4×CArG-luc和STARS和/或心肌蛋白（DN-myocardin）表达载体的显性阴性突变(F类); 或ANP mRNA在感染表达STARS的重组腺病毒（Ad-STARS）或对照lacZ（Ad-lacZ）的心肌细胞中的表达(克)感染后48小时。条形图显示平均值±SEM(H（H）)在感染后48小时，使用抗FLAG抗体（绿色）和抗α-肌动蛋白单克隆抗体（红色）对感染表达FLAG-标记MRTF-A（Ad-FLAG-MRTF-A）的重组腺病毒（含或不含表达STARS的腺病毒（Ad-STARS））的心肌细胞进行免疫染色。原始放大倍数，×400。(我)MRTF-A在腺病毒表达STARS（Ad-STARS）或β-半乳糖苷酶（Ad-LacZ）感染的心肌细胞中的亚细胞定位。C、 细胞质；C> N，细胞质体大于核MRTF-A的细胞；N、 核；N≥C，MRTF-A核质分布大于细胞质分布的细胞。

检查STARS对内源性ANP公司表达，我们用表达STARS的重组腺病毒感染新生儿心肌细胞并进行分析ANP公司mRNA。STARS的异位表达显著增加内源性ANP公司实时RT-PCR检测到的表达（图​（图6G）。6G） ●●●●。为了证实STARS可以诱导心肌细胞中MRTF-A的核移位，我们用表达MRTF-A的重组腺病毒感染心肌细胞，无论有无表达STARS的重组腺毒。在没有血清的情况下，MRTF-A位于细胞质和细胞核中，根据单个细胞的不同而有一定的变异性，心肌细胞中STARS的过度表达增强了MRTF-A在细胞核中的积累（图​（图6，6、H和I）。

STARS增强心脏应激反应。

为了研究STARS在体内表达增加的后果，我们使用α-MHC启动子产生了Tg小鼠，以驱动STARS的心脏表达。我们获得了2个表现出相似表型的独立Tg系，我们在这里描述了其中1个系。从α-MHC-STARS–Tg小鼠的心脏分离出的STARS mRNA在心脏中的表达比非Tg小鼠增加了约20倍（图​（图7A）。7A） ●●●●。α-MHC-STARS–Tg小鼠和野生型同窝小鼠的心脏重量/体重比和总体重没有显著差异（图​（图7B）。7B） ●●●●。α-MHC-STARS–Tg小鼠的心脏也没有出现组织学异常（数据未显示）。然而，已知是SRF直接靶点的几个胎儿心脏基因在α-MHC-STARS–Tg小鼠中上调（图​（图7C）。7C） ●●●●。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为JCI0731240.f7.jpg
提高STARS-Tg小鼠对肥厚刺激的敏感性。

(A类)α-MHC-STARS–Tg小鼠组织中STARS蛋白表达的Western blot。左面板显示了转染或不转染STARS表达载体的293T细胞的抗体控制。Lu，肺；李，肝脏；Ki，肾脏。(B类)α-MHC-STARS–Tg小鼠和对照野生型同窝小鼠的心脏重量/体重（HW/BW）比值为8(n个=12）和20(n个=4）周龄。(C类)使用从8周龄的α–MHC-STARS–Tg小鼠和对照野生型同窝仔中提取的总RNA，通过RT-PCR测定心脏基因表达(n个=6个）*P（P）<0.05，与对照野生型窝友相比。(D类)10周龄的α-MHC-STARS–Tg小鼠和野生型窝友（有或无TAB）的心脏和HW/BW比率。n个=8（Tg）和n个=6（重量）。原始放大倍数，×2。(E类)α-MHC-STARS-Tg小鼠和有或无TAB的野生型同窝小鼠心脏中BNP mRNA的表达(n个= 3). (F类)TAB后α-MHC-STARS–Tg和WT小鼠的Kaplan-Meier生存曲线。排除TAB后24小时内死亡的小鼠。(克)α-MHC-STARS–Tg小鼠、Cn-Tg小鼠和α-MHC-STARS–Tg小鼠的心脏（H&E染色）和HW/BW比值；Cn-Tg小鼠和WT小鼠(n个=每组6人）。原始放大倍数，×2。(H（H）)α-MHC-STARS-Tg小鼠、Cn-Tg小鼠和α-MHC-STARS-Tg小鼠的Kaplan-Meier生存曲线；Cn-Tg小鼠*P（P）< 0.05.

为了确定在肥厚心脏中增加STARS的表达是有益还是有害，我们通过TAB使α-MHC-STARS–Tg小鼠承受压力过载，并观察到过度的肥厚反应（图​（图7D）。7D） 。此外，在接受TAB治疗的α-MHC-STARS–Tg小鼠中，BNP表达增强（图​（图7E），7E） 超声心动图显示，与接受TAB的野生型小鼠相比，心脏收缩功能明显下降，这是由射血分数从82.1%±3.9%下降到44.9%±6.2%所确定的（表​（表11和补充方法；本文的在线补充材料；doi:10.1172/JCI31240DS1）。左室舒张直径的测量结果显示，左室舒张内径从3.5±0.32 mm增加到4.6±0.17 mm，表明接受TAB治疗的α-MHC-STARS–Tg小鼠与接受TAB的非Tg小鼠相比，左室显著扩张（表​（表11和补充方法）。TAB后，α-MHC-STARS–Tg小鼠的死亡率也比非Tg小鼠高（图​（图7F）。7F） ●●●●。

表1

α-MHC-STARS（Tg）小鼠的超声心动图分析

保存图片、插图等的外部文件。对象名为JCI0731240.t1.jpg

我们还将α-MHC-STARS–Tg小鼠与Cn-Tg小鼠杂交。在Cn-Tg背景下，α-MHC-STARS–Tg小鼠的心脏重量/体重比与Cn-Tg小鼠相比略有下降（图​（图7G）。7G） ●●●●。与Cn-Tg小鼠的心脏相比，双Tg小鼠心脏的心室壁更薄，心室扩张更大（图​（图7G）。7G） ●●●●。Cn-Tg超声心动图；与Cn-Tg小鼠相比，8周龄的α-MHC-STARS–Tg小鼠的心室壁厚度减少，舒张和收缩室直径增加，收缩功能下降，表现出明显的心室壁肥厚，收缩功能保持（表​（表22和补充方法）。此外，Cn-Tg；与Cn-Tg小鼠相比，α-MHC-STARS–Tg小鼠的存活率降低（图​（图7H）。7H） ●●●●。我们的结论是，STARS的表达增加了心脏对压力信号的敏感性。

表2

Cn-Tg和α-MHC-STARS的超声心动图分析；Cn-Tg小鼠

保存图片、插图等的外部文件。对象名为JCI0731240.t2.jpg

讨论

本研究结果表明星星编码横纹肌限制性细胞骨架蛋白，是MEF2的应激诱导靶基因。心肌细胞中STARS的表达增加激活了SRF依赖性胎儿心脏基因的表达，并导致肥厚条件下心脏功能的加速恶化。这些发现表明，STARS调节心脏应激反应，并耦合MEF2和SRF信号。

STARS通过耗尽G-actin库来刺激SRF活性，至少在一定程度上是这样的，从而释放MRTF转移到细胞核，与SRF结合并刺激SRF靶基因(33). 除了调节应激反应基因外，如ANP公司，SRF调节肉质的表达肌动蛋白基因，有助于进一步组装肌节，这是心肌肥大的标志。因此，MEF2上调STARS对应激信号的响应可能会促进肌动蛋白聚合，从而进一步刺激SRF活性和肌动蛋白表达。图中显示了一个模型，用于解释收缩器和肥大基因程序之间的信号前馈机制​图8。8.

保存图片、插图等的外部文件。对象名为JCI0731240.f8.jpg
STARS作为MEF2和SRF之间的细胞骨架中介体的作用模型。

MEF2调节星星表达和STARS通过隔离肌动蛋白单体刺激SRF活性，从而释放MRTF转移到细胞核并促进依赖SRF的基因表达。STARS表达的持续增加导致心脏基因程序的改变，这可能有助于向心脏功能障碍过渡。

MEF2对STARS表达的调节。

基础和诱导表达星星由MEF2结合位点介导，至少部分介导星星发起人。为了支持这一发现星星在中减少Mef2c公司-无胚胎。除了重要的MEF2位点（M1）外星星启动子，第二个位点（M2）与M1位点合作，但不直接结合MEF2，这表明M2结合因子与MEF2合作激活星星转录。这一前提似乎与M1区域的突变并不能完全消除星星MEF2表达。然而，应该注意的是，近端TATA盒也类似于MEF2共有序列，以前的研究表明MEF2可以通过TATA序列激活转录(36,37). 因此，在没有M1的情况下，MEF2可以绑定到这个TATA盒状元素并激活星星与与M2区结合的因子协同转录。MEF2也可能通过M1和TATA盒激活星星基因。

STARS增强心肌细胞中SRF的活性。

STARS促进MRTF-A的核转位，并与MRTF-A协同刺激SRF介导的转录(33). 阻断心肌蛋白和MRTFs活性的显性负性心肌蛋白突变体阻碍了心肌细胞SRF的STARS激活，表明肥厚心脏中STARS表达增加有助于SRF的激活。事实上，在没有心肌肥大的情况下，心脏特异性STARS过度表达增加了SRF依赖性胎儿心脏基因的表达（图​（图7C）。7C） ●●●●。以前，我们发现心肌细胞中表达的心肌蛋白参与心肌肥大过程中胎儿基因程序的激活(38). 鉴于心肌蛋白和MRTF可以形成异二聚体复合物来激活SRF(21)我们推测STARS/MRTF通路和其他激活心肌蛋白的通路可能在心脏重塑过程中协同增强SRF活性。

STARS使心脏对压力敏感。

我们的结果表明，α-MHC-STARS–Tg小鼠心脏中STARS的高表达导致对心脏应激的敏感性增加。在肥厚刺激下，STARS的表达增加最初可能是对肌动蛋白含量增加的一种补偿反应，以维持细胞骨架的完整性，并在后负荷增加的情况下维持收缩功能，但STARS的过度表达会导致心脏适应不良。在这方面，心脏特异性SRF过度表达会导致严重的扩张型心肌病，并伴有胎儿基因程序的激活(16)支持我们的发现，持续激活SRF对心脏功能有害。相反，胚胎心脏中SRF的心脏特异性缺失会导致心脏缺陷(14,15). 成人心脏SRF的缺失也会导致扩张型心肌病表型(39)表明SRF对心脏的正常发育和出生后心脏正常功能的维持是必要的。因此，SRF功能的丧失和获得都对心脏结构和功能有害。

总之，本研究结果表明STARS是MEF2的应激诱导靶点和SRF的激活剂。STARS的持续过度表达促进了肥厚心脏的功能恶化，这意味着STARS参与了从心肌肥厚到心力衰竭的转变。进一步研究STARS的作用将有助于深入了解MEF2和SRF在发育和疾病期间调节心脏功能的机制，以及将肌节与心脏基因组耦合的信号网络。

方法

质粒构建物。

小鼠5'上游区域不同部分的DNA片段星星使用小鼠基因组作为模板，通过PCR分离相对于ATG密码子的基因（-1581至+53bp、-1043至+53bp和-164至+53bp），并连接lacZ基因或荧光素酶报告基因pGL3（Promega）的上游。补充方法中描述了引物序列和质粒构建设计。

基于PCR-的M1和M2序列突变星星启动子是按照标准程序使用补充方法中描述的引物进行的。–452-bp人类ANP公司启动子-荧光素酶报告基因先前已报道(40). 基于PCR的2个CArG序列的突变ANP公司启动子是使用补充方法中描述的引物进行的。以前曾报道过基于pcDNA3的小鼠STARS和MRTF-A表达载体(32,33).

细胞培养、荧光素酶分析、腺病毒感染和免疫细胞化学。

原代新生大鼠心室肌细胞如前所述进行分离和生长(34). 电镀后24小时，除非另有说明，否则使用GeneJammer（Stratagene）将200 ng报告质粒和200 ng表达载体转染心肌细胞12小时。转染后，从生长培养基中去除血清。剥夺血清6小时后，添加ET-1（100 nM）、PE（100μM）或载体，并将细胞再维持48小时。

用编码小鼠STARS的cDNA构建重组腺病毒；或MRTF-A被克隆到pAC-CMV载体中，并使用FuGENE 6（Roche Diagnostics）将所得构建物与pJM17共转染到HE 293细胞中。通过再次感染HEK 293细胞扩增腺病毒的克隆群体，并使用琼脂覆盖法对病毒制剂进行滴度测定。

6孔培养皿中盖玻片上生长的心肌细胞在接种重组腺病毒后36小时感染，感染倍数为5，感染时间为6小时，随后在含血清培养基中维持36小时。将培养基更换为无血清培养基后，将细胞进一步培养12小时，然后用4%甲醛固定在PBS中。如前所述进行免疫细胞化学(32,33)，详细方案见补充方法。使用荧光素酶分析系统（Promega）和FluoReporter进行荧光素素酶分析lacZ公司/半乳糖苷酶定量试剂盒（Invitrogen）符合制造商的说明。

EMSA。

EMSA的执行如前所述(24)使用双链寡核苷酸和补充方法中所述的方法修改。

Tg小鼠、TAB、超声心动图和组织学分析。

携带多种DNA片段的Tg小鼠星星基因调控区融合到最小热休克蛋白68基本启动子和lacZ公司报告基因是使用标准程序生成的(41,42). 如前所述，对6至8周龄雄性小鼠进行TAB(43). 如前所述进行组织学分析(6). 如前所述，使用Hewlett-Packard Sonos 5500超声系统进行超声心动图检查(6). 本研究中使用的所有动物方案均由德克萨斯大学西南研究所动物护理和使用委员会批准。补充方法中提供了更多程序细节。

实时RT-PCR。

使用TRI从培养的新生儿心室肌细胞或小鼠心脏中分离出总RNA佐尔，遵循制造商的协议。使用TaqMan一步法RT-PCR主混合试剂和引物（Applied Biosystems）对20–100 ng总RNA进行实时一步RT-PCR。引物和探针的序列见补充方法。

人类DNA样本。

从吉列德采集确诊为特发性心肌病（3名男性，平均年龄57岁）或无病心脏（2名男性，1名女性，平均年龄45岁）的不明原因患者的心脏LV组织样本。这项研究涉及使用现有的病理标本，记录信息的方式使得受试者无法直接识别或通过与受试者相关的标识符识别。本研究符合德克萨斯大学西南医学中心机构审查委员会根据卫生与公共服务部规定的豁免审查要求。

统计。

数据以平均值±SEM表示。未配对双尾学生的t吨两组间的比较采用检验，组间比较采用方差分析和事后Fisher检验。P（P）小于0.05的值被认为是显著的。

补充材料

补充数据：
单击此处查看。（81K，pdf格式）

致谢

我们感谢Yongli Kong对TAB的帮助；Robert Gerard提供STARS重组腺病毒；Esther Creemers、Tomasa Barrientos、Jeffrey Spencer和Akiko Arai提供科学建议和质粒构建；卢光荣技术援助；Angela Diehl负责图形；詹妮弗·布朗（Jennifer Brown）担任编辑助理。这项工作得到了美国国立卫生研究院、唐纳德·W·雷诺兹心血管临床研究中心、美国心脏协会和罗伯特·A·韦尔奇基金会对E.N.奥尔森的资助。G.C.Teg Pipes得到了NIH博士后奖学金的支持。K.Kuwahara得到了Uehara纪念基金会的研究奖学金的支持。

脚注

使用的非标准缩写：心钠素；BNP、B型利钠肽；内皮素-1；MEF2，心肌细胞增强因子-2；α-MHC，α-肌球蛋白重链；心肌相关转录因子；NFAT，活化T细胞的核因子；PE，苯肾上腺素；SRF，血清反应因子；横纹肌Rho信号激活子STARS；TAB，胸主动脉环扎。

利益冲突：提交人声明不存在利益冲突。

本文引文： 临床杂志。投资。 117:1324–1334 (2007). doi:10.1172/JCI31240

工具书类

1.Chien K.R.，Olson E.N.心脏发育和疾病中的汇合途径和原则：CSH下的CV。单元格。2002;110:153–162.[公共医学][谷歌学者]
2弗雷·N、奥尔森·E·N。心脏肥大：好的、坏的和丑陋的。每年。生理学评论。2003;65:45–79.[公共医学][谷歌学者]
三。塞德曼J.G.，塞德曼C.心肌病的遗传基础：从突变鉴定到机械范式。单元格。2001;104:557–567.[公共医学][谷歌学者]
4Granzier H.，Wu Y.，Siegfried L.，LeWinter M.Titin：生理功能和在心肌病和衰竭中的作用。心脏衰竭。版次。2005;10:211–223.[公共医学][谷歌学者]
5Knoll R.等人。心脏机械拉伸传感器涉及人类扩张型心肌病子集中缺陷的Z盘复合体。单元格。2002;111:943–955.[公共医学][谷歌学者]
6Frey N.等。缺乏钙调素-1的小鼠对钙调神经磷酸酶信号敏感，并表现出对病理性生物力学应激的加速型心肌病。国家医学院。2004;10:1336–1343.[公共医学][谷歌学者]
7Purcell N.H.等。细胞外信号调节激酶2与心肌细胞中的LIM-only蛋白FHL2相互作用并受其负调控。摩尔细胞。生物。2004;24:1081–1095. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
8Philippar U.等。SRF靶基因Fhl2拮抗SRF的RhoA/MAL依赖性激活。摩尔细胞。2004;16:867–880.[公共医学][谷歌学者]
9Lange S.等。titin的激酶结构域控制肌肉基因表达和蛋白质周转。科学。2005;308:1599–1603.[公共医学][谷歌学者]
10Pipes G.C.、Creemers E.E.、Olson E.N.转录辅激活物的心肌蛋白家族：细胞生长、迁移和肌生成的多功能调节器。基因发育。2006;20:1545–1556.[公共医学][谷歌学者]
11Miano J.M.血清反应因子：在不同的基因表达程序之间切换。分子细胞杂志。心脏病。2003;35:577–593.[公共医学][谷歌学者]
12Sprenkle A.B.、Murray S.F.和Glembotski C.C.多顺式元件参与基础和α肾上腺素能激动剂诱导的心钠素转录。血清应答元件和SP-1样元件的作用。循环。物件。1995;77:1060–1069.[公共医学][谷歌学者]
13.Nelson T.J.、Balza R.，Jr.、Xiao Q.、Misra R.P.SRF依赖性基因在分离心肌细胞中的表达：与心肌肥厚相关的基因的调控。分子细胞杂志。心脏病。2005;39:479–489.[公共医学][谷歌学者]
14Parlakian A.等人。发育中心脏中血清反应因子的靶向失活会导致心肌缺陷和胚胎死亡。摩尔细胞。生物。2004;24:5281–5289. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
15Miano J.M.等。限制血清反应因子对心血管系统的失活。程序。国家。阿卡德。科学。美国。2004;101:17132–17137. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
16张欣，等。血清反应因子心肌特异性过度表达转基因小鼠的心肌病。美国生理学杂志。心脏循环。生理学。2001;280：H1782–H1792。[公共医学][谷歌学者]
17Chang J.等。抑制性心脏转录因子，SRF-N，在人类心力衰竭中由caspase 3裂解产生，并通过心室卸载减弱。循环。2003;108:407–413.[公共医学][谷歌学者]
18Wang D.等。心肌蛋白（血清反应因子的转录辅因子）激活心脏基因表达。单元格。2001;105:851–862.[公共医学][谷歌学者]
19Wang D.Z.等。心肌相关转录因子家族对血清反应因子活性的增强作用。程序。国家。阿卡德。科学。美国。2002;99:14855–14860. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
20Cen B.等。巨核细胞白血病1是血清反应因子（SRF）的一种有效转录辅激活剂，是SRF靶基因的血清诱导所必需的。摩尔细胞。生物。2003;23:6597–6608. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
21Wang Z.，Wang D.Z.，Pipes G.C.，Olson E.N.Myocardin是平滑肌基因表达的主调节器。程序。国家。阿卡德。科学。美国。2003;100:7129–7134. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
22Li S.、Wang D.Z.、Wang Z.、Richardson J.A.、Olson E.N.。血管平滑肌发育需要血清反应因子辅激活物心肌蛋白。程序。国家。阿卡德。科学。美国。2003;100:9366–9370. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
23Miralles F.、Posern G.、Zaromytidou A.I.、Treisman R.肌动蛋白动力学通过调节其辅活化子MAL来控制SRF活性。单元格。2003;113:329–342.[公共医学][谷歌学者]
24Gossett L.A.、Kelvin D.J.、Sternberg E.A.、Olson E.N.一种新的肌细胞特异性增强因子，可识别与多个肌肉特异性基因相关的保守元素。摩尔细胞。生物。1989;9:5022–5033. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
25Black B.L.，Olson E.N.。肌细胞增强因子-2（MEF2）蛋白对肌肉发育的转录控制。每年。Rev.细胞发育生物学。1998;14:167–196.[公共医学][谷歌学者]
26McKinsey T.A.、Zhang C.L.、Olson E.N.MEF2：细胞分裂、分化和死亡的钙依赖性调节器。生物化学趋势。科学。2002;27:40–47.[公共医学][谷歌学者]
27Lin Q.，Schwarz J.，Bucana C.，Olson E.N.通过转录因子MEF2C控制小鼠心脏形态发生和肌肉发生。科学。1997;276:1404–1407. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
28Naya F.J.等。缺乏MEF2A转录因子的小鼠的线粒体缺陷和心脏猝死。国家医学院。2002;8:1303–1309.[公共医学][谷歌学者]
29Wu H.等。MEF2对骨骼肌纤维类型控制中的多种钙调节信号作出反应。EMBO J。2000;19:1963–1973. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
30Passer R.等。体内CaM激酶信号传导诱导心肌肥厚并激活MEF2转录因子。临床杂志。投资。2000;105:1395–1406. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
31Xu J.，等。肌细胞增强因子2A和2C在转基因小鼠中诱导扩张型心肌病。生物学杂志。化学。2006;281:9152–9162.[公共医学][谷歌学者]
32Arai A.、Spencer J.A.、Olson E.N.STARS，一种Rho信号和血清反应因子依赖性转录的横纹肌激活剂。生物学杂志。化学。2002;277:24453–24459.[公共医学][谷歌学者]
33.Kuwahara K.，Barrientos T.，Pipes G.C.，Li S.，Olson E.N.将肌动蛋白动力学与血清反应因子联系起来的肌肉特异性信号机制。摩尔细胞。生物。2005;25:3173–3181. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
34Molkentin J.D.等人。心肌肥大的钙调神经磷酸酶依赖性转录途径。单元格。1998;93:215–228. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
35Morin S.、Paradis P.、Aries A.、Nemer M.G蛋白偶联受体核信号传递所需的血清反应因子-GATA三元复合物。摩尔细胞。生物。2001;21:1036–1044. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
36Grayson J.，Williams R.S.，Yu Y.T.，Bassel-Duby R.异源上游激活元件与肌肉特异性启动子中特定TATA序列之间的协同作用。摩尔细胞。生物。1995;15:1870–1878. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
37.Leibham E.等人。TFIID和MEF2与TATA元件的结合激活爪蟾MyoDa启动子的转录。摩尔细胞。生物。1994;14:686–699. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
38邢伟，等。肌卡蛋白诱导心肌细胞肥大。循环。物件。2006;98:1089–1097.[公共医学][谷歌学者]
39.Parlakian A.等人。通过破坏成人心脏中的SRF基因暂时控制扩张型心肌病的发病。循环。2005;112:2930–2939.[公共医学][谷歌学者]
40Kuwahara K.等。神经限制性沉默元件-神经限制性消音因子系统调节心室肌细胞中基础和内皮素1诱导的心钠素基因表达。摩尔细胞。生物。2001;21:2085–2097. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
41Nakagawa O.等。缺乏由MEF2转录调节的新型肌肉特异性蛋白激酶的小鼠中核肌病。基因发育。2005;19:2066–2077. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
42Cheng T.C.、Hanley T.A.、Mudd J.、Merlie J.P.、Olson E.N.使用与肌生成素控制区相关的转基因绘制胚胎发生期间肌生成素转录图。《细胞生物学杂志》。1992;119:1649–1656. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
43Hill J.A.等人。心脏肥大不是对短期压力过载的必要补偿反应。循环。2000;101:2863–2869.[公共医学][谷歌学者]
文章来自临床研究杂志由以下人员提供美国临床研究学会