胰腺β细胞翻译谱显示出不同的葡萄糖依赖性应激反应

细胞培养和治疗

MIN6细胞（由宫崎骏教授善意提供）用于第16代和第28代之间约80%的汇合处。MIN6细胞在Dulbecco改良的Eagle's培养基中生长，该培养基含有25 mM葡萄糖，并添加15%热灭活胎牛血清、100μg/ml链霉素、100单位/ml硫酸青霉素和75μMβ-巯基乙醇，与5%CO平衡_2,37°C时95%空气。治疗前，去除培养基，并在HEPES平衡的Kreb’s Ringer碳酸氢盐缓冲液（115 mM NaCl，5 mM KCl，10 mM NaHCO）中清洗细胞两次_三，2.5 mM氯化镁₂，2.5 mM氯化钙₂和20mM HEPES pH 7.4），含有0.5%BSA（KRB）。然后，将细胞在37°C的KRB中预培养1小时，KRB含有0.5 mM葡萄糖（除非图中另有说明），然后再在含有0.5或20 mM葡萄糖的KRB中培养1小时（除非图图例中另有规定）。在最后10分钟的处理期间，将环己酰亚胺以100μg/ml的浓度添加到细胞中，以防止核糖体流失。

胰岛素ELISA

根据制造商的说明，使用胰岛素小鼠ELISA试剂盒（德国DRG仪器有限公司）进行胰岛素分泌分析。

多聚体分析

处理后，细胞在多聚体缓冲液中溶解（20 mM HEPES pH 7.6，15 mM MgCl₂，300mM KCl、1mg/ml肝素、0.1mg/ml环己酰亚胺、1mM二硫苏糖醇、1μl/ml RNAguard、1mM苯甲脒HCl、0.1mM苯甲磺酰氟、1μg/ml亮蛋白肽和1μg/ml蛋白肽抑制素）补充1%triton。细胞裂解物在13000下离心10分钟克在4°C下去除细胞核和细胞碎片。然后将上清液分层到20–50%蔗糖梯度上（在多聚体缓冲液中制备），并在Sorvall TH64.1转子中以39000 r.p.m.的转速在4°C下离心2 h。使用Teledyne ISCO，NE，USA梯度分馏器对梯度进行分馏，该分馏仪在254 nm处连续测量吸光度。对于北部地块分析，通过添加三体积的8 M胍基HCl和四体积的乙醇，在−80°C的温度下从每个组分中沉淀RNA过夜。通过离心法造粒RNA，在75%乙醇中洗涤，干燥并在H中重新悬浮₂O.对于微阵列分析，将含有多聚体（三个以上核糖体）的组分合并。将三体积的8 M盐酸胍和0.1 M醋酸钠添加到1体积的混合RNA中。添加等量的乙醇，并在−80°C下沉淀RNA过夜。在12000℃下通过离心法造粒RNA克15分钟，用75%乙醇洗涤并干燥。然后将RNA颗粒重新悬浮在H中₂添加O和等量的5 M氯化锂。RNA在−80°C下沉淀过夜，然后在12 000℃下离心造粒克然后将RNA颗粒在75%乙醇中洗涤15分钟，在真空下干燥，并在适量水中重新悬浮。

微阵列分析

在本研究中，使用Affymetrix小鼠微阵列小鼠表达（MOE）430A。这些阵列包含约14000个基因的22626个探针组。莱斯特大学的微阵列设施和剑桥大学的MRC基因服务机构进行了从多体RNA合成片段cRNA和将cRNA杂交到阵列的研究。为了制备标记靶点以与阵列杂交，使用含有T7聚合酶启动子的寡核苷酸-dT引物逆转录多体RNA。然后用T7聚合酶产生双链cDNA。然后转录双链cDNA在体外合并生物素化CTP和UTP。然后将生物素标记的cRNA片段化并与阵列杂交。对阵列进行清洗，用链霉亲和素-藻红蛋白结合物染色，最后进行扫描。为了确定基因表达的变化，将来自基线阵列（0.5 mM葡萄糖）的信号与对照阵列（20 mM血糖）的信号进行比较。使用MicroArray Suite 5（MAS5，Affymetrix）根据以下标准对数据进行分析：（1）排除基线（0.5 mM葡萄糖）和实验（20 mM糖）阵列中无呼叫的探针组；（2） 排除基线和实验阵列之间无变化调用的探针组，（3）在两个单独的实验中，低和高葡萄糖浓度之间的多体mRNA水平变化阈值为1.5倍或2倍。然后使用Excel进行额外分析。

Northern印迹

RNA样品在65°C的RNA样品缓冲液（Sigma）中加热10分钟。RNA样品在冰上冷却，并在1%琼脂糖-甲醛凝胶上运行。通过毛细管作用将RNA转移到Hybond-N膜（Amersham Biosciences）上并固定。[α-³²P] 使用Prime-a-Gene标记系统（Promega）生成-dCTP放射性标记cDNA探针。非公司[α-³²P] 通过Probequant G50柱（Amersham Biosciences）旋转去除-dCTP。将膜在65°C的Church Gilbert溶液（0.5 M NaHPO）中预杂交1 h₄pH 7.2，1 mM EDTA，7%SDS），添加变性鲑鱼精子DNA（60μg/ml），然后添加变性放射性标记探针并杂交过夜。然后在室温下，在2×SSC、0.1%SDS中洗涤膜两次，持续15分钟，在60°C下，在0.2×SSC、0.1%SDS中洗涤膜一次，持续15分钟。通过放射自显影术观察杂交cDNA探针。

候选抗氧化应激和整合应激反应mRNA的多聚体分析

微阵列分析显示，在高糖浓度下，许多mRNA与多聚体的关联增加，多聚体编码与抗氧化途径有关的蛋白质(表2). 为了证实这些变化，在低或高葡萄糖浓度下培养的MIN6细胞中，通过蔗糖沉降梯度离心法测定Trx2、TrxIP和GPx4 mRNA的沉降谱，然后进行northern-blot分析(图2a） ●●●●。多糖体图谱显示，当葡萄糖浓度从0.5增加到20 mM时，60S/80S峰显著降低，多糖体数量相应增加(图3ai）。这表明葡萄糖刺激核糖体向mRNA的运动，因此表明葡萄糖刺激全球启动速度的增加，结果与先前报道的结果相似(戈麦斯等。2004). 在低葡萄糖浓度下，对整个梯度的特异性mRNA进行北区区分析表明，大多数编码GPx4、Trx2和TrxIP的mRNA与单体、二体或三体相关，只有一小部分与较大的多体相关(图3aii）。然而，当葡萄糖浓度增加时，这些mRNA被募集到较重的多聚体上，这表明它们的翻译速率增加。这些结果表明，在高糖下核糖体被招募到TrxIP、Trx2和GPx4 mRNA上，因此证实了微阵列分析的结果。为了确定与多聚体相关的mRNA的增加是否是由于总mRNA水平的变化所致，对在0.5或20 mM葡萄糖下培养1 h的MIN6细胞分离的总mRNA进行了northern-blot分析(图3b） ●●●●。Northern-blot分析显示，葡萄糖刺激TrxIP mRNA增加2.8倍，表明在高葡萄糖浓度下短期培养导致TrxIP RNA的稳定性和/或转录增加(图3b） ●●●●。此前有报道称，在高糖培养24小时后，TrxIP在人和小鼠胰岛中转录上调(沙莱夫等。2002,明尼苏达州等。2005b条). 因此，在高糖浓度下，该蛋白的表达受其转录速率的显著增加和其mRNA向多聚体的补充的调节。相比之下，GPx4的水平没有改变，Trx2 mRNAs的水平仅在高葡萄糖浓度下略有增加(图3b） ●●●●。因此，这些蛋白质表达的增加可能主要通过蛋白质合成速率的增加来介导。

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图3

与氧化应激相关的mRNA的多聚体分析。将MIN6细胞在含有0.5 mM葡萄糖的KRB中预培养1小时，然后在含有0.5或20 mM葡萄糖之KRB内再培养1小时。（a） 用20–50%蔗糖梯度溶解细胞并进行多糖体分析。梯度从顶部（分数1）分馏到底部（分数20）。（a.）。我)在254nm处连续测量梯度的吸光度，以给出多聚体轮廓。（a）。ii（ii）)从每个组分中分离出RNA，并在1%琼脂糖-甲醛凝胶上运行。将RNA转移到尼龙膜上并探测所示的mRNA。给出的结果代表了三个单独的实验。（b） 裂解细胞并分离总RNA。然后将RNA在1%琼脂糖甲醛凝胶上运行，转移到尼龙膜上并探测特定的mRNA，如图所示。用ImageJ对northern印迹中观察到的低血糖和高糖浓度之间的折叠变化进行量化。该图中给出的结果代表了三个单独的实验。

相比之下，微阵列分析显示，在高糖浓度下，与整合应激反应相关的多体mRNA的表达较低（参见表2). 为了证实这些变化，通过蔗糖沉降梯度离心法和northern-blot分析，在低或高糖培养的MIN6细胞中测定CHOP10、ATF4和c-Jun mRNA的沉降谱(图3a） ●●●●。矛盾的是，在低葡萄糖浓度下，CHOP10、ATF4和c-Jun mRNA均与重多糖体共沉积，这表明这些mRNA可能在低葡萄糖下积极参与蛋白质合成(图3aii）。随着葡萄糖浓度的增加，CHOP10和ATF4 mRNA从多糖体转移到单糖体，这表明它们的表达减少(图3aii）。因此，在低葡萄糖浓度下，CHOP10和ATF4的表达可能通过增加其翻译速率而上调。相反，c-Jun mRNA仍与多聚体相关，但c-Jun的mRNA水平显著下降。为了确定这些蛋白的表达是否也通过mRNA丰度的变化进行调节，从低或高葡萄糖浓度培养的MIN6细胞中分离出总RNA，并通过northern-blot分析测定ATF4、CHOP10和c-Jun的mRNA水平。Northern blots显示，低血糖时CHOP10 mRNA水平是高糖时的1.7倍，表明葡萄糖通过转录和翻译机制强烈调节该蛋白的表达。ATF4 mRNA水平在低血糖时仅略有增加。因此，低血糖时ATF4表达的增加可能主要通过蛋白质合成速率的增加介导。相反，在低血糖和高糖之间，c-Jun mRNA水平显著降低（减少8.9倍），因此该蛋白的表达可能主要通过mRNA丰度的变化由葡萄糖调节。

葡萄糖调节抗氧化应激和综合应激反应蛋白的蛋白质水平

为了确定通过微阵列分析确定的mRNA与多聚体的相关性变化是否与蛋白质表达的变化相关，将MIN6细胞在0.5或20 mM葡萄糖下培养4小时，并通过western blotting测定一些候选蛋白质的表达水平(图4). 在整个实验期间，低浓度葡萄糖下ATF4的蛋白表达水平远高于高浓度葡萄糖。在高糖浓度下孵育4小时后，c-Jun蛋白水平显著降低，而在低糖浓度下，c-Jun蛋白水平维持了4小时。这些结果提供了证据表明，在低葡萄糖浓度下，c-Jun和ATF4蛋白的合成速率高于在高葡萄糖浓度下。这些结果与我们的微阵列数据一致，表明ATF4和c-Jun mRNA在低葡萄糖浓度下被招募到多聚体上。相反，TrxIP蛋白水平在低血糖时（1-2小时内）迅速下降，但在高糖浓度下保持不变。这些结果也与我们的微阵列结果一致，表明TRxIP在高糖浓度下被招募到多聚体上。在高糖浓度下1-2小时后，GPx4蛋白水平也增加，这与我们的微阵列数据再次一致。

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图4

葡萄糖调节蛋白表达。MIN6细胞在KRB中以0.5或20 mM葡萄糖孵育，孵育时间为指定时间。细胞裂解物样品在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上运行，然后使用ATF4、c-Jun、TrxIP和GPx4抗血清进行免疫印迹。

ICG得到了生物技术和生物科学研究委员会案例学生的支持。E G得到了Wellcome Trust的支持。C M由MRC学生奖学金资助。作者声明，不存在会影响这项科学工作公正性的利益冲突。