实验室投资。作者手稿；PMC 2007年4月1日提供。
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NIHMSID公司：美国国立卫生研究院15606
转基因心脏靶向人类突变聚合酶γ降低线粒体DNA、氧化应激、心肌病和死亡*
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布莱恩·戴伊
2科罗拉多州丹佛国家犹太医学中心医学部；
Sherine S.L.Chan女士
4国立卫生研究院分子遗传学实验室，北卡罗来纳州三角研究所。
罗伯特·朗
三佐治亚州亚特兰大埃默里大学医学院放射科；
威廉·科普兰
4国立卫生研究院分子遗传学实验室，北卡罗来纳州三角研究所。
1病理科和
三乔治亚州亚特兰大埃默里大学医学院放射科；
2科罗拉多州丹佛国家犹太医学中心医学部；
4国立卫生研究院分子遗传学实验室，北卡罗来纳州三角研究所。
通信地址：William Lewis，医学博士，埃默里大学医学院病理学系，地址：7117 Woodruff Memorial Building，101 Woodrugh Circle，Atlanta，GA 30322，电子邮件：ude.yrome@siwelw，电话：404 712 9005，传真：404 71 2 9007 摘要
POLG公司是编码DNA聚合酶γ（Polγ）催化亚单位的人类基因，Polγ是人类mtDNA的复制酶。A类POLG公司Y955C点突变导致人类慢性进行性外眼肌麻痹（CPEO），这是一种伴有眼肌无力和线粒体DNA缺陷的线粒体疾病。Y955C型POLG公司转基因（TG）靶向小鼠心脏。在四个甘油三酯（+/-）品系和野生型（WT）窝友（−/-）中测定存活率。左心室（LV）表现（超声心动图和MRI）、心率（心电图）、线粒体DNA丰度（实时PCR）、线粒体dna氧化（8-OHdG）、组织病理学和电子显微镜（EM）确定了表型。
心脏靶向Y955CPOLG公司在患有心肌病、线粒体氧化应激和过早死亡的心脏中产生了CPEO的分子特征。左室腔大小和重量增加、心动过缓、线粒体DNA减少、8-OHdG增加、心脏组织病理学和线粒体EM缺陷支持并定义了表型。
这项研究强调了人类突变体的致病作用POLG公司及其在线粒体DNA缺失、线粒体氧化应激和心肌病中的基因产物，因为它与CPEO的遗传缺陷有关。转基因模型在病理生理学上将人类突变Polγ、线粒体DNA缺失和线粒体氧化应激与线粒体DNA复制装置和心肌病联系起来。
简介
Polγ是负责线粒体DNA复制的蛋白质和酶组合的一部分(1,2). 它由一个负责聚合酶和核酸外切酶活性的催化亚单位和一个增强结合性和加工性的小辅助亚单位组成(三). 核酸外切酶活性允许对生长的DNA链进行校对，并增加线粒体DNA的忠实复制(4). 其他研究人员采用了mtDNA复制缺陷的转基因小鼠（TG）模型，该模型表达了外核裂解校对缺陷的Polγ，并导致mtDNA突变增加(5)和心肌病（CM）(6,7)，但氧化应激在这些研究中不起作用(8,9). 那些实验构建、工程化的Polγ突变缺乏人类疾病中基于病理生理学的对应物。相反，这里的研究使用了心脏靶向人类突变体产生的TGPOLG公司编码Y955C Polγ。这种突变导致慢性进行性外眼肌麻痹（CPEO），这是一种真正的人类线粒体疾病，很少引起心肌病（CM）(10). 这一临床事实使我们能够再次使用心脏靶向Y955C TG对靶点进行结构和功能评估，而不会混淆其他组织的影响。TGs出现CM、mtDNA耗竭和氧化应激。
CPEO是一种遗传性疾病（常染色体显性或隐性），以线粒体DNA缺失和线粒体DNA突变积累为特征。该病以成人发病、双侧上睑下垂、进行性眼球外肌无力、上睑下坠、眼睑麻痹、红色纤维参差不齐的骨骼肌病、消瘦、运动不耐受和呼吸链酶活性降低为特征(11). 常染色体显性CPEO家系成员肌肉活检中出现大规模线粒体DNA缺失(12). 这表明线粒体DNA不稳定可能是由一个特定的常染色体基因引起的。位置克隆将四个基因与包括位于4q34-35位点的腺嘌呤核苷酸转运体（ANT1）在内的观察结果联系起来(13)，线粒体解旋酶（Twinkle）位于10q24位点(14)胸苷磷酸化酶（与隐性线粒体神经胃肠道脑肌病相关；[MNGIE]，CPEO的一种形式）(15)位于22q13.32-qter位点，编码Polγ催化亚基的基因，POLG公司，位于位点15q25(16). 最近报道的一例常染色体显性CPEO患者Polγ辅助亚基基因突变(17). 重要的是，候选基因编码复制mtDNA的产物(2)或参与线粒体DNA复制的核苷酸前体代谢(18).
Y955C是POLG公司基因(16,19). 它与CPEO和帕金森综合征有关(20)最近被描述为导致卵巢早衰(21). Tyr955与聚合酶域内活性位点的传入dNTP相互作用以保持DNA合成的高保真度(22). 重组Y955C-Polγ表现出<1%的野生型活性，加工能力严重下降。这种具有最小催化活性的mtDNA合成停滞可能解释了Y955C杂合子的深刻临床变化(23)，但尚未在小鼠转基因模型中进行病理生理学定义。在缺乏核酸外消解校对的情况下，用Y955替代半胱氨酸也会使核苷酸错误插入误差增加1-2个数量级(22). 值得注意的是，其他POLG公司点突变与CM相关(24)尽管不寻常。
我们公布了CPEO中突变Y955C-Polγ蛋白的生化数据(2,22,23,25)然而，Y955CPOLG公司转基因小鼠模型中的突变尚未被研究。利用转基因靶向Y955C探讨人Y955C-Polγ对小鼠心脏的影响POLG公司由α-肌球蛋白重链启动子（α-MyHC）驱动。这种转基因方法是罗宾斯开创的(26)，并在过去被我们成功改编和使用(22,27–29)在这里的研究中。心脏靶向Y955CPOLG公司在TG心脏中获得了丰富但酶缺陷的Polγ多肽的表达。这导致线粒体DNA复制效率低下、线粒体氧化应激以及CM的结构和功能特征。TG实验表明，线粒体DNA复制效率低下和线粒体氧化应激善意的导致CM和线粒体DNA缺失的原因是Polγ突变。
材料和方法
α-MyHC/Y955C转基因小鼠（TG）的制备
α-肌球蛋白重链启动子的建立方法和途径(30)以类似于以前使用的方式应用于Y955C PolγTG(27,29,31,32).
基因分型
对于TG系α-MyHC/Y955C，使用Southern blotting和实时PCR检测创始者及其后代中是否存在突变转基因，正如最近所述(27,29,32).
TG基因拷贝分析
建立了四个转基因株系，用于突变体的靶向过表达POLG公司为了确定每个人的相对拷贝数，人类Y955C水平POLG公司使用实时PCR和Light Cycler TaqMan Master试剂盒对尾部DNA提取物进行半定量分析。使用人类特异性引物扩增靶基因POLG公司（正向：5′-CCTCGCCTGGTATTCCT-3′，反向：5′-TGGTCCAGAGTAAC GCTCTTC-3′，以及Universal Probe Library探针#71；罗氏诊断公司，印第安纳州印第安纳波利斯）和“内务管理”基因，间隙（正向：5′-GATGCTACAAGCAGCCTTT-3′，反向：5′-GCAGAAGCAAGGCAAA-3′，以及Universal Probe Library探针#4；Roche Diagnostics Corp.）。使用LightCycler 480（Roche Diagnostics Corp.）对每行至少7只小鼠的单个组织进行DNA扩增。相对拷贝数剂量标准化为间隙（单拷贝基因）。
SDS-PAGE考马斯蓝染色和Western印迹
为了定量线粒体裂解物中的蛋白质丰度，在标准4–12%Bis-Tris凝胶中的SDS-PAGE上解析蛋白质，然后进行考马斯蓝染色。为了定量Polγ，制备了一种类似的凝胶（线粒体裂解物的5倍超载），并将其转移到Imobilon-P中，以使用所述的抗人Polγ抗体（DPg）进行Western Blotting(33).
Y955C-PolγTG系的死亡率
根据标准方法生成并计算所有TG系和WT窝友的Kaplan-Meier存活曲线（合并；N=16）。
实时PCR定量Y955C-PolγTGs心脏组织线粒体DNA（mtDNA）和核DNA（nDNA）
所采用的方法是基于对其他人使用的方法的修改(34,35)最近我们详细介绍了(32). 简言之，用实时PCR技术定量线粒体和核DNA的引物和探针的DNA序列与其他引物和探头的DNA序列不同25小鼠线粒体DNA聚合酶γ（ASPG）的辅助亚单位和小鼠线粒体细胞色素氧化酶亚单位1（COX）分别是小鼠细胞核和线粒体DNA的单独量化对象。用线粒体正向引物（5′-TCGTTGATTCTCAACAATCA-3′）和反向引物（5'-GCCTCCAATTATTGGTACTATATAGA-3′）扩增COXI基因的靶片段。杂交探针为该基因的3′-荧光素（5′-AACGAGGTCACTTTAGGAGACCF3′）和5′-LC红640 3′-磷酸封闭（5′L-AATTTACATTATCGTAACTGCCCP3′）。用核正向引物（5′-GGAGGAGGCACTTTCTCAGC-3′）和反向引物（5'-GAAGCCTCCCTGAACAC-3′）扩增核ASPG基因。使用3′-荧光标记的寡核苷酸（5′-GCGCTTTTGGCTTGGGTGTAG-F3′）和5′-LC-Red 640 3′-磷酸阻断的寡核苷酸（5′L-GTTACGAAAGAACCTAGCCTCACA GTGGT-P3′）作为核基因的杂交探针。在LightCycler 480（Roche）中进行扩增，包括变性步骤（8分钟），50个扩增周期（95°C 8秒，55°C 10秒，然后进行单次荧光采集，72°C 10秒钟），熔化曲线（95°C持续30秒，升温速度为4.8°C/秒，45°C持续61秒，升温速率为2.5°C/秒钟，95°C保持0秒）和冷却循环（40°C）。除非另有说明，否则温度变化率为2.5°C/sec。
采用标准DNA曲线量化LC产物。线粒体和核靶序列均按照制造商的方案进行PCR扩增并克隆到pCR2.1-TOPO载体（Invitrogen）中。按照制造商的方案，用Hind III限制性核酸酶（Roche）消化每个质粒，使其线性化。然后使用相应的原始引物对每个片段插入物进行PCR扩增，并在2%琼脂糖凝胶上用完，以确保插入物的质量和大小。
8-羟基-2-脱氧鸟苷（8-OHdG）作为线粒体氧化应激标记物的线粒体DNA分析
如前所述，使用核酸酶P1和碱性磷酸酶将TG（C系）和WT心肌的线粒体DNA水解为核苷(36). 分离心脏mtDNA样本（mtDNA提取器CT试剂盒，Wako Chemicals USA，Inc.，弗吉尼亚州里士满），并分析8-OHdG的丰度（作为mtDNA氧化应激的标志物(37,38))相对于2-脱氧鸟苷的丰度（2dG；x10−5)通过HPLC结合库仑电化学和分光光度检测（CoulArray型号5600；ESA公司，马萨诸塞州Chelmford）。根据每天用新制备的标准品生成的多点标准曲线计算核苷浓度，该标准品的浓度包括在样品中观察到的浓度。8-OHdG水平表示为平均摩尔比和平均标准误差（SEM）至10−52dG（N=6）。
Y955C-PolγTGs和WT的超声心动图
如前所述，对年龄和性别匹配的WT和TG进行超声心动图检查(39). 对于ECHO观测，Y955C PolγTG线B，N=8；重量，N=7；对于Y955C PolγTG线C，TG N=6；重量N=6。对于Y955C PolγTG线D，TG N=8；重量N=4。对于Y955C PolγTG线E，TG N=8，WT N=7。
Y955C-PolγTGs和WT同窝婴儿心脏的MRI
如最近所述，在16~20周时通过MRI对Y955C Polγ线D TG（n=3）和WT窝友（n=3）进行评估(32). MRI是在4.7T瓦里安/INOVA（200/33）光谱和成像系统（瓦里安，加利福尼亚州帕洛阿尔托）上完成的。
Y955C TG心脏的组织病理学特征
快速取出Y955C（C系，每组3个；60天大）的心脏和同等数量的WT同窝婴儿，在环境温度下浸泡在10%中性缓冲福尔马林中24小时，并小心地进行双瓣手术，以显示心室的视图，并记录心脏肥大或细胞学变化，如肥大。样品经过处理、切片（6μm），分别用苏木精和伊红或Masson三色染色，并在尼康800 Ultraphot显微镜（尼康，梅尔维尔，纽约）上进行显微镜检查。所有图像均以电子方式保存，以便将TG和WT心脏的组织病理学变化进行比较。
Y955C心肌线粒体超微结构病理学评价POLG公司TGs公司
使用EM评估TG（C系）和WT小鼠心脏（N=12）的样品，以确定线粒体结构变化。切片（约1 mm立方体）快速固定在稀释的Karnovsky固色剂中，并像过去一样进行EM处理(39). 用玻璃刀切割嵌入部分（0.5μ），并用甲苯胺蓝染色以定位。用金刚石刀切割超薄（900Å）切片，用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色，并在Philips Morgagni电子显微镜上观察（荷兰阿姆斯特丹Philips）。两名研究人员对每张EM图像进行独立审查，以确定是否存在线粒体增殖或结构异常的线粒体（如线粒体内板层体、嵴重叠）(40). 结构受损的线粒体在操作上被定义为嵴损失或溶解≥25%，并具有上述特征。
统计分析
对于mtDNA定量，数据表示为mtDNA测量平均值与nDNA平均值之比除以1000，所得值表示为平均值±标准误差。值为第页<0.05（由学生的非配对T检验确定）被认为具有统计学意义。通过方差分析比较各组的超声心动图测定结果(39).
结果
心脏线粒体提取物中Polγ的多肽印迹
从Y955C TG和WT小鼠心脏分离的线粒体检测人Y955C-Polγ多肽的相对丰度。用DPg多克隆抗体检测含有等量心肌线粒体蛋白的蛋白质印迹()与小鼠Polγ交叉反应（数据未显示）。来自TG和WT心脏的线粒体提取物的蛋白质印迹分析显示，Y955C TG心脏样本（泳道2、4和6）显示出Polγ带（140kDa）的信号密度增加。TG心脏样本的条带与真正的Polγ对照组（第1道，). 相反，在WT心脏线粒体提取物中未发现Polγ，表明天然小鼠Polγ多肽低于检测阈值。表明装载了等量的蛋白质。
Y955C TG Polγ蛋白表达和基因拷贝剂量：在4–12%聚丙烯酰胺凝胶上分离纯化的TG和对照心脏线粒体裂解物中的蛋白，然后转移到Immobilon-P进行Western blot分析或考马斯蓝染色。A） 心脏线粒体提取物的Western blot分析。通道1、纯化的重组人Polγ作为对照，通道2、通道4和通道6分别来自33、25和10周龄小鼠Y955C TG心脏的线粒体裂解物。第3、5和7道分别是33、25和10周龄小鼠对照TG阴性心脏的线粒体裂解物。箭头表示polγ。B） 考马斯蓝染色凝胶证明心脏线粒体蛋白的等效部分通过Western blot分析。通道1-7与面板A中的相同，不同之处在于，在凝胶中装载并分离了5倍于蛋白质量的蛋白质，以通过考马斯蓝染色进行检测。C.从产生的4个品系的心脏组织中测定突变体Y955C-Polγ的相对基因拷贝数。箭头表示polγ。C） 从产生的4个品系的心脏组织中测定了人类突变体Y955C-Polγ的相对基因拷贝数。的级别POLG公司使用实时PCR和Light Cycler TaqMan Master试剂盒对小鼠尾部DNA提取物进行半定量分析，并将其归一化为WT的GAPDH。
转基因心脏靶向Y955C-Polγ小鼠
创建了四个可行的Y955C-PolγTG系。它们被操作性标记为Y955C-PolγTG品系B、C、D和E。为每个生成的TG Y955C品系测定相对基因拷贝数(). 一般来说，转基因显示了TG的强大表达。在实验使用之前，动物繁殖了6代。TG或同窝婴儿中未发现明显的外部表型。在所有品系中均未发现TG的行为、生长、成熟、繁殖或孟德尔分布发生变化。
Y955C-PolγTG系的死亡率
Kaplan-Meier生存曲线是根据600天以上的产后存活率（以天为单位）生成的，并根据标准方法计算所有TG品系及其WT同窝（WT组合）。结果表明，不同TG系的存活率不同(). D线（90d）的中位生存率最低，C线（210d）和E线（>420d）居中，B线最长（>600d），其生存率与WT中发现的最相似。为了帮助确定D线TG中导致寿命缩短的事件，TG在21天终止。胸部的半切面显示巨大的心脏肿大伴巨大的双侧心房扩大，与充血性心力衰竭一致().
Y955C TG的Kaplan-Meier生存曲线和组织病理学评估：A）不同TG系的生存率存在差异。D线的中位生存期为90天，C线为210天，E线为>420天，B线为>600天，与WT.B最相似。组织病理学（Masson’s三色染色）与D线的死亡相关：对D线21天大的TG进行尸检。胸部半切显示巨大心房增大（A），提示心力衰竭（箭头）以及压迫肺部（L）。
mtDNA拷贝号
线粒体DNA耗竭是线粒体DNA功能障碍和CPEO的标志之一。小鼠线粒体DNA聚合酶γ（ASPG）的副亚基和小鼠COX 1的线粒体17kDa亚基分别是小鼠核DNA和线粒体DNA的单独量化对象(). 在年轻和年长的队列中，Y955C TG小鼠与它们各自的WT队列相比，mtDNA丰度持续降低（mtDNA/nDNC比率）。这表明Y955C转基因表达导致心脏线粒体DNA大量耗竭，可能是CM、CHF和死亡率增加的原因。
采用实时PCR技术分析WT和Y955C TG小鼠线粒体提取物中实时PCR mtDNA/nDNA比值和2dG和8-OHdG的稳态丰度：A）WT和TG队列的心脏样本（N≥8）。Y955C-PolγTG（C系）发现mtDNA/nDNA比率降低（*p<0.01）。B） 根据标准方法分离线粒体并提取线粒体DNA。核苷酸丰度表示为8-OHdG与2dG x10的平均摩尔比和平均值（SEM）的标准误差−5Y955C心脏中8-OHdG的稳态丰度是WT的3倍（p<0.05），（N=6）。
Y955C TG心脏线粒体中的8-OHdG
通过将Y955C心脏样本的线粒体从心脏组织中分离出来（去除核DNA），然后分析8-OHdG与2dG x 10的丰度，以评估其氧化应激−5Y955C心脏线粒体线粒体中的8-OHdG水平比WT对照心脏高出3倍（p<0.05；)与我们对其他小鼠线粒体氧化应激模型的研究一致(42).
Y955C-PolγTGs和WT对照的超声心动图数据
Y955C PolγTG表现出CM的ECHO表型。在3个品系上进行60天TG的ECHO检测，发现LV质量增加（与各WT相比增加>60%；归一化，mg/g体重）（数据未显示）。Y955C线B为1.66±0.1，而0.92±0.07，线C为1.82，线D为1.66？.2。与WT窝友相比，LV质量增加了70%至111%（p<0.01）。120天时，TG线C和D的LV质量分别保持在1.31±0.07和1.38±0.1。这些构成了120天时LV质量的相对加倍().
Y955C-PolγTG的ECHO图像定量分析：以盲法计算LV质量，打破代码，并将120天Y955C PolγTG线的数据制成表格。将数据标准化为体重（mg/g），并绘制为平均值±SEM。120天时，C线和D线存活。他们的心脏重量比WT增加了>100%（*p<0.01）。
同窝出生的Y955C PolγTGs和WT心脏的MRI
与我们最近所做的一样，在16周时通过MRI对Y955C Polγ线D TG（n=3）和WT同窝婴儿（n=30）进行了评估(32).这是16周大时性别匹配的TG和WT室友的典型4腔视图。与WT室友心脏的类似MRI图像相比，Y955C TG心脏的图像显示心脏肥大、双心室扩张和心房扩大。这证实了超声心动图检查结果并证实了CM。
TG和WT心脏的MRI：使用上述方法对小鼠心脏进行MRI成像。9个月大时TG Y955C（左）和WT室友（右）的四腔扩大。TG显示心脏四腔扩大，同时右心室（开放箭头）和左心室（填充箭头）扩大。
Y955C TG心脏和WT的显微照片
为了在微观水平上确定TG的心脏结构变化，对TG和WT的同窝伙伴进行了全幅显微照片和高倍光显微照片(). 在TGs中观察到心脏肥大，LV和RV腔尺寸增加，TGs的游离壁和间隔增厚。这些发现证实了上述ECHO和MRI研究的观察结果，表明CM。组织病理学检查显示心肌细胞溶解和心肌细胞肥大，具有与线粒体一致的多个细胞质颗粒形态。总之，这些非特异性组织病理学特征支持CM诊断。
Y955C-PolγTGs心脏和线粒体的组织病理学（A、B）和EM（C）图像：使用表达Y955C TG或WT对照的性别匹配的同窝婴儿。TG在心脏过度表达导致心肌病伴双心室肥厚和心脏肥大。箭头指向粒度增加的裂解变化。（Y955C:A，原始放大倍数为1X，B，原始放大倍率为600 X）。组织病理学结果（苏木精和伊红染色）由EM（C，EM原始放大倍数：26000）观察到的线粒体损伤和增大支持。标记为1μ）。
甘油三酯心脏线粒体的超微结构特征
Y955C-PolγTG心脏的电镜照片增强了组织病理学数据，并与mtDNA的变化相关。与年龄和性别匹配的WT对照组相比，Y955C-PolγTG心脏中常见线粒体嵴溶解、肿胀和基质密度明显缺陷().
讨论
Polγ负责线粒体DNA的复制(2). 中的突变POLG公司，催化亚单位基因导致CPEO、阿尔珀综合征、共济失调神经病变、帕金森综合征(2,43)和其他遗传条件(24).
使用靶向心脏转基因小鼠确定心脏功能障碍和CM的特征(26)、和应用于探讨艾滋病患者CM的特征(44)其中核苷逆转录酶抑制剂（NRTIs）导致心脏线粒体功能障碍(45). 转基因靶向携带Y955C致病性突变的人Polγ导致线粒体DNA耗竭、氧化应激、病理性心脏肥大、心肌线粒体超微结构损伤、伴有LV功能障碍的CM、心动过缓和过早死亡。这些发现在线粒体DNA复制缺陷和心脏功能障碍之间形成了致病联系，线粒体DNA和突变的人类Polγ在小鼠心脏中表达。
这里的TG实验与Y955C Polγ酶（来自已知的致病性突变）的转基因靶向心脏表达有关POLG公司)线粒体DNA耗竭、氧化应激和功能障碍（以CM的形式）。在靶向TG中，Y955C-Polγ与突变体相比降低了天然Polγ的相对可用性，从而在酶：模板界面水平上影响mtDNA复制是合理的。在该模型中，Y955C突变多肽足够丰富，通过压倒天然Polγ并成为系统中的主导酶而破坏线粒体DNA的稳态，但酶活性显著降低。亚细胞结果是通过增加8-OHdG的丰度来记录线粒体氧化应激。
线粒体DNA复制机制的稳态受到调节(18). 在目前的模型中，这种突变的Polγ的表达导致基因断裂，导致器官功能障碍和过早死亡(). 基于突变Y955C-Polγ的大规模作用，“显性阴性”表型是细胞器功能障碍和最终心脏功能障碍的第一步。还可以推断，至少在小鼠mtDNA复制机制的水平上，人类Y955C突变Polγ可以有效替代天然小鼠Polγ或干扰小鼠mtDNA的复制子。此处的转基因替代允许突变的人类Polγ直接参与mtDNA复制，并导致缺失。这里的数据并不能直接解释CPEO中线粒体DNA缺陷的器官特异性。然而，它们可以应用并加强华莱士的“OXPHOS范式”，在该范式中，需要大量氧化磷酸化能量的器官可能是氧化磷酸化受限的遗传线粒体疾病的主要靶点(46).
Y955C-Polγ在小鼠模型中作用的示意性总结。Polγ突变体Y955C的心脏靶向性过表达导致线粒体DNA生物发生改变，导致心脏功能障碍，最终导致过早死亡。证明存在天然Polγ和过度表达Y955C突变体。
目前的工作扩展了以前的研究，这些研究集中在线粒体核苷酸库水平上破坏线粒体DNA的生物发生。在这些研究中，TGs被NRTIs处理，NRTIs与天然核苷酸竞争线粒体内磷酸化和转运(31,32,39,47,48). 数据表明NRTIs可能会干扰核苷酸向线粒体的转运。
遗传性“mtDNA缺失综合征”(49,50)为生成这些实验模型时使用的推理以及从中获得的数据提供支持。在这些疾病中，线粒体和细胞质核苷酸库受到激酶、转运蛋白和参与核苷酸库动态平衡的酶的突变的干扰。这种突变导致线粒体DNA缺失。艾滋病NRTIs治疗的“获得性线粒体DNA缺失”(31,32)提供了耗尽线粒体DNA的药理学模型体内NRTI化学结构、剂量和治疗持续时间均影响mtDNA耗竭程度和组织靶点(31,32).
这种TG模型加强了线粒体DNA复制缺陷与心脏功能障碍，尤其是CM之间的致病联系(51). 虽然这里没有证明（由于TG表型的严重性），但可以想象，如果进行转基因检测，Polγ（已经描述或尚未发现）的细微遗传突变可能会提供进一步的机制见解。目前有超过70种疾病突变和少数单核苷酸多态性在POLG公司基因(http://dir-apps.niehs.nih.gov/polg索引). 这种Polγ突变可能只表现出轻微的酶功能障碍，在自然、未受干扰的条件下没有表型。然而，如果NRTIs的挑战耗尽线粒体DNA，则在选定组织中可能发生线粒体功能障碍表型(32)并导致氧化应激(36)已添加。如果这些事件（聚合酶突变和NRTIs的核苷酸池紊乱）发生一致，可能会产生显著的副作用。华莱士及其同事阐明，遗传易感性和环境效应的结合是线粒体遗传病和相关系统阈值效应的基石(46,52).
总之，本研究利用在小鼠心脏中表达人Y955C-Polγ的TGs来定义mtDNA复制缺陷体内在复制线粒体DNA的酶机制水平。靶向心脏Y955C-Polγ转基因表达足以产生mtDNA缺失的分子表型、靶向突变酶丰度增加的生化表型、8-OHdG增加、TGs心肌细胞的组织病理学和线粒体超微结构改变以及心脏肥大的器官功能障碍，ECHO和MRI显示心室容积增加、心脏重量增加。这些相互关联的发现强调线粒体DNA复制与功能障碍有关。有理由认为，当遗传mtDNA复制缺陷出现阈值时，尤其是由于Polγ功能无效，就会导致心脏功能障碍和CM的病理特征。缺陷mtDNA复制在各种CMs中的作用值得在未来进行更深入的研究。
致谢
这项工作得到了DHHS、NIH、NHLBI R01 HL059798的支持，部分得到了HL072707对WL的支持，以及NIH对WCC的内部研究基金的支持。
工具书类
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