流感病毒是一种可怕的病原体，仅在美国每年就造成数千人死亡。此外，该病毒引起的广泛发病具有巨大的社会和经济影响。因此，持续的疫苗干预势在必行。通过预测特定年份内哪些甲型和乙型流感病毒株将传播，然后设计疫苗以诱导对这些毒株的保护，我们能够采取合理的方法来防御这种病毒。
灭活（致死）流感病毒制剂是目前美国唯一获得许可的流感疫苗。这些多亚单位疫苗旨在诱导针对当前甲型和乙型流感病毒株的体液免疫。另一种有希望的疫苗接种方法是使用冷适应的减毒活流感病毒（参考文献。1). 这些冷适应病毒在低温下多次传代获得，生长局限于上呼吸道。据报道，冷适应病毒不仅能诱导对同型流感病毒的体液反应，还能诱导交叉反应性细胞介导的细胞毒性(2，三). 活病毒疫苗的其他优点包括易于鼻内给药、诱导粘膜免疫和成本效益。
我们提出了通过改变病毒干扰素拮抗剂来设计活病毒疫苗的另一种合理方法。我们之前已经证明，甲型流感病毒NS1蛋白具有干扰素拮抗活性，允许流感病毒在干扰素活性系统中复制(4). 在本研究中，我们确定了几种编码改变的NS1蛋白的甲型和乙型流感病毒的疫苗潜力。这些病毒在免疫成熟的鸡胚和BALB/c小鼠中表现出显著的生长衰减。此外，我们证明，用NS1变异的流感病毒对小鼠进行免疫，可以对野生型流感病毒的复制和/或致病性提供保护性免疫。本文提出的模型可能适用于使用特定干扰素拮抗剂合理生产流感和其他病毒疫苗。
材料和方法
病毒。
核糖核蛋白转染产生NS1–99病毒(5)使用针对delNS1病毒描述的25A-1辅助性流感病毒(4). NS1-99病毒包含一个154-nt插入，位于NS1-99毒株NS基因的324-478位核苷酸之间。这种插入产生了一个框架移位，并导致产生含有野生型NS1的前99个氨基酸的NS1蛋白，以及三个额外的C末端氨基酸（HisAspSer）。该插入在通过定点突变修复pUC19-T3/NS构建物的过程中作为PCR伪影出现，包含7个22-nt重复序列（5′-CATGACTTGAGGAAATGTCA-3′）。流感B/山形/1/73克隆201（B/201）和流感B/山形AWBY-234（B/234）已在前面描述过(6——9).
甲型流感病毒在6至14日龄的胚胎化鸡蛋（SPAFAS，Preston，CT）中在37°C下生长48小时。乙型流感病毒在35°C的胚胎化鸡蛋中生长72小时。将100个噬斑形成单位（pfu）的病毒注射到每个鸡蛋的尿囊腔中。将A型或B型流感病毒感染鸡蛋的尿囊液在PBS中连续稀释，并在96个平板中检测鸡红细胞（0.5%；马里兰州切斯特敦Truslow Farms）的血凝（HA）。在37°C（甲型流感病毒）或35°C（乙型流感病毒）下，在2μg/ml胰蛋白酶（Difco）存在下，对Madin–Darby犬肾细胞（MDCK）细胞进行甲型流感或乙型流感病毒库存的菌斑分析。值得注意的是，与野生型PR8病毒相比，delNS1病毒的MDCK斑块大小显著减小。这可能反映了MDCK细胞对这两种病毒复制的允许性的主要差异(4).
感染细胞中NS1-99的免疫沉淀。
将含有70%融合MDCK细胞的培养皿（3.5 cm）感染野生型PR8病毒、重组NS1–99病毒[感染多重性（MOI）=10]，或在室温下模拟感染PBS 1h。然后在1 ml标记培养基中培养细胞（MEM–cys/met+250μCi35S-cys/met）在37°C下8小时，并在200μl RIPA缓冲液中的冰上溶解。通过在12000×克使用抗甲型流感病毒NS1蛋白的多克隆抗体（2μl）在4°C下沉淀细胞上清液2小时(8). 将50微升蛋白A Sepharose珠添加到混合物中，并在4°C孵育1 h后造粒抗体复合物。用RIPA缓冲液（0.15 mM NaCl/0.05 mM Tris-HCl，pH 7.2/1%Triton X-100/1%脱氧胆酸钠/0.1%SDS）将珠洗两次，并将一半样品加载到17.5%SDS/PAGE凝胶上。通过放射自显影术观察分离的条带。
Western Blot分析。
在指定的时间点，30个5毫米的融合Vero细胞培养皿被模拟感染或以2个MOI感染NS1-99、delNS1或PR8病毒。细胞提取物在RIPA缓冲液中制备，10%加载在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上。用兔抗病毒核蛋白多克隆或兔抗核输出蛋白多克隆（NEP）对分离的蛋白质进行Western分析(10).
小鼠免疫和挑战。
BALB/c小鼠是流感病毒感染的既定模型(11——14). 用乙醚对4周龄雌性BALB/c小鼠（Taconic Farms）进行镇静处理，并用指定数量的甲型或乙型流感病毒（50μl体积）进行鼻内感染。感染后1–2分钟内乙醚恢复。对于病毒肺滴度，在第3天或第6天处死小鼠。将肺部均质并重新悬浮在无菌PBS（每1ml PBS 100 mg肺组织）中，并在2μg/ml胰蛋白酶存在下在MDCK细胞上进行滴度。
免疫四周后，用野生型PR8病毒（105或5×106pfu）或野生型B/山形病毒（3×5pfu），如表所示和.
表1
NS1减毒流感病毒免疫小鼠和野生型流感A/PR8病毒攻击小鼠的存活率
| 组 | | | 幸存者
|
|---|
免疫接种
| 免疫接种后 | 挑战后*
|
|---|
| 病毒 | 剂量，pfu | 1 × 105功率因数校正单元 | 5 × 106功率因数校正单元 |
|---|
| 一个 | A/delNS1 | 1.0 × 106 | 9/9 | 5/5 | 4/4 |
| B类 | | 3.3 × 104 | 第5页，共5页 | 0/5 | ND（无损检测） |
| C类 | A/NS1-99型 | 1.0 × 106 | 8/10 | 5/5 | 第3页，共3页 |
| 天 | | 3.3 × 104 | 9/10 | 3/5 | 4/4 |
| E类 | A/PR8型 | 2.0 × 10三 | 1/5 | ND（无损检测） | 1/1 |
| 如果 | 美国公共广播电视公司 | 0 | 6/6 | 0/6 | ND（无损检测） |
表2
NS1减毒流感B病毒免疫小鼠和野生型流感B/山形病毒攻击小鼠的肺滴度
| 病毒 | 剂量，pfu | 激发前肺部滴度，pfu/ml
| 激发后肺部滴度* |
|---|
| 第3天 | 第6天 |
|---|
| B/234号 | 3 × 105 | 40, <10, <10 | <10, <10, <10 | <10, <10, <10, <10, <10, <10 |
| B/201号 | 3×105 | 60, 30, <10 | <10, <10, <10 | <10, <10, <10, <10, <10, <10 |
| B/山药 | 3 × 105 | 3.0 × 104, 2.0 × 104, 1.0 × 104 | <10, <10, <10 | <10, <10, <10, <10, <10, <10 |
| 美国公共广播电视公司 | 0 | ND（无损检测） | ND（无损检测） | 2.5 × 104, 1.7 × 104 |
所有程序均符合美国国立卫生研究院实验室动物护理和使用指南。
ELISA法。
为了定量免疫小鼠中存在的病毒特异性抗体的数量，对稀释（1:1000）血清对纯化病毒抗原的反应性进行了ELISA分析。免疫后4周和野生型病毒攻击前从小鼠中抽取血液。血液在4°C下孵育2小时，并在200×克取上清液（血清）10分钟，并在−20°C下保存。使用50微升蔗糖梯度纯化流感病毒A/PR8或B/山形病毒（25 mg/ml）覆盖96个ELISA培养皿（Immulon4、Dynex、Chantilly、VA）。PBS清洗后，用PBS 1%BSA封闭涂层孔，并用稀释（1:1000）血清培养。在室温下与血清孵育1小时后，用PBS冲洗孔，并用二级抗小鼠IgG过氧化物酶（Boehringer Mannheim）孵育。用比色底物（2,2′-叠氮二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐]，Boehringer-Mannheim）将冲洗好的微孔培养20′，并用ELISA读卡器（OD595，Bio-Tek Instruments，Burlington，VT）读取。
酶联免疫斑点（ELISPOT）检测。
ELISPOT试验用于检测抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞，如前所述(15，16). 该试验测量了暴露于MHCⅠ类NP肽的细胞中产生IFN-γ的脾细胞的数量。将90个6孔硝化纤维板（Milititer HA，Millipore）在75μl PBS中涂上7μg/ml抗小鼠IFN-γ单克隆抗体（编号R4-6A2，PharMinen），并在室温下培养过夜。用培养基清洗微孔六次，并在37°C下用补充有10%FCS的DMEM培养1h。将来自免疫小鼠的脾细胞池以系列稀释液添加到抗体涂层孔中。P815细胞（一种只表达MHC I类分子的肥大细胞瘤细胞系）被用作抗原呈递细胞。P815电池（1×105细胞/ml）用1×10脉冲−6M合成NP肽TYQRTRALV在37°C下放置1小时。用培养基反复洗涤后，用50μg/ml丝裂霉素C（Sigma）处理细胞1小时。将NP-肽处理的P815细胞添加到每个孔中。作为对照，使用未经处理的P815细胞。将平板在37°C和5%CO下培养24小时2然后用PBS+0.05%Tween-20（PBS/T）充分洗涤。将微孔与2μg/ml生物素化抗小鼠IFN-γ单克隆抗体（XGM1.2，PharMinen）在PBS/T中的溶液在室温下孵育1h。用PBS/T清洗平板，并在室温下用过氧化物酶标记的链霉亲和素（1:1000；Kirkegaard&Perry Laboratories）培养1小时。用PBS/T和PBS清洗微孔，并添加1μg/ml底物（3,3′-二氨基联苯胺四氢氯化物二水合物，存于50 mM Tris●HCl中，pH 7.5，含0.015%过氧化氢）。借助显微镜对每个孔中的斑点进行计数。
结果
NS1变异的甲型流感病毒在胚胎蛋中的生长。
如前所述，DelNS1和NS1-99病毒是通过使用温度敏感辅助病毒25A-1，通过核糖核蛋白转染改变的病毒性流感NS基因而产生的（图。一个) (4). DelNS1病毒缺乏NS1基因，NS1-99病毒编码一个突变的NS1蛋白，该蛋白仅包含野生型NS1的N末端99个氨基酸，产生约11.2 kDa的NS1蛋白质（图B类). 相比之下，野生型病毒编码230个氨基酸的NS1蛋白。我们感染了Vero细胞，这是一种已知缺乏I型干扰素基因座的细胞系(17，18)，带有NS1–99、delNS1或PR8病毒，MOI为2。尽管NS基因发生了改变，但所有三种甲型流感病毒都表达了相当水平的病毒NEP（NS2），即病毒NS基因编码的第二种蛋白质（图。 一个和C类).
野生A/PR8型流感病毒和含有病毒NS1 ORF改变的衍生病毒。(一个)野生型流感A PR8病毒和转染NS1–99和delNS1病毒的NS基因和基因转录物的示意图。病毒NS基因用浅灰色方框表示，核苷酸长度用基因片段下方的数字表示。病毒基因上方的星号表示PR8和NS1-99 NS1 ORF的终止密码子。NS1–99基因中的154-nt插入显示为一个深灰色方框，delNS1 NS基因片段的471-nt缺失由病毒基因下方列出的删除核苷酸的垂直线表示。病毒NS1 ORF由白色方框表示，每个方框内显示氨基酸长度。还显示了病毒NEP mRNA，白色方框表示病毒NS1和NEP ORF之间共享的框内mRNA序列，斑点方框表示病毒NEP RNA转录物的独特ORF。先前已经描述过流感A/PR8和A/delNS1病毒NS基因(4，35)和与A/NS1–99 NS基因一起显示以进行比较。(B类)NS1–99感染细胞中NS1蛋白的免疫沉淀。MDCK细胞感染PR8或NS1-99病毒，如材料和方法.35使用针对NS1蛋白的兔多克隆抗血清从感染细胞提取物中免疫沉淀S-met-cys标记的NS1蛋白，并在17.5%SDS凝胶上分离。通过放射自显影术观察蛋白质。(C类)NEP表达的Western blot分析。在MOI为2的指定时间点用NS1-99、delNS1或PR8病毒感染Vero细胞。用病毒NEP抗体检测细胞提取物(上部)或NP(下部)如中所述材料和方法.
其他研究表明，培养的鸡胚细胞和完整的胚胎蛋的IFN诱导率都随着年龄的增长而增加(19——21). 具体而言，Morahan和Grossberg在年龄相关的干扰素诱导和较老的完整鸡胚对流感病毒感染的抗性之间建立了密切的相关性(21). 我们希望确定在不同年龄的鸡蛋中编码野生型或改变的NS1蛋白的甲型和乙型流感病毒的生长特性，以检查NS1蛋白改变与其作为干扰素拮抗剂的功能之间的关系。我们的预测是，这种病毒编码的干扰素拮抗剂的改变会损害病毒在较老卵子中生长的能力，但仍会使较年轻卵子生长。
将同等剂量的A/PR8、NS1-99或delNS1流感病毒注射到6至14天龄鸡胚的尿囊腔中。将感染的卵子在37°C下孵育48小时。采集尿囊液并检测HA活性，如材料和方法如图所示。一个野生型流感A/PR8病毒无论年龄大小都能在胚胎卵子中生长到高HA滴度，而缺乏病毒NS1基因的等基因病毒（delNS1病毒）在6天以上的卵子中的生长能力受到影响。NS1-99病毒表现出中等生长特征，在6天和8天大的鸡蛋中生长到高HA滴度，在10天和12天大的鸡蛋中生长到中等HA滴度。NS1–99病毒无法在14天龄的鸡蛋中生长，并且持续生长至略低于野生型亲本病毒的滴度（图一个). 感染了delNS1或PR8病毒的鸡蛋的尿囊液中的病毒滴度也通过菌斑试验测定（图。B类). delNS1病毒的产量随着感染卵子的年龄而下降，与HA滴度的下降相对应，6日龄和7日龄卵子的产量最高为1×107pfu/ml尿囊液。PR8病毒持续增长至滴度大于1×108pfu/ml，与蛋龄无关。
野生型PR8、NS1-99和delNS1病毒在胚胎卵中的生长特性。(一个)将100 pfu病毒注射到不同年龄的胚胎蛋的尿囊腔中，并在37°C下孵育48小时。收集尿囊液并通过HA分析滴定，如材料和方法在第8、10、12或14天未检测到delNS1病毒的HA滴度。NS1-99感染在第14天没有产生可检测的HA滴度。图表表示每种病毒的两到六个卵子的平均HA倒数稀释度。(B类)胚胎蛋被PR8或delNS1病毒感染，如一个，尿囊液在MDCK细胞上滴定，如材料和方法.
用NS1-99和delNS1病毒为小鼠接种疫苗。
此前已经证明，A/delNS1型流感病毒在野生型小鼠中无致病性。当小鼠经鼻接种5×104delNS1病毒的pfu均存活，体重未出现任何下降(4). 我们通过使用NS1-99病毒扩展了我们的致病性研究，并检查了delNS1和/或NS1-99是否诱导了保护性免疫反应。如表所示，用德尔NS1（A-B组）或NS1-99（c-D组）病毒的各种稀释液接种4 k龄雌性BALB/c小鼠，并监测4周。感染2×10的小鼠三pfu（2个LD50)对照组包括野生型PR8流感病毒或模拟感染PBS。所有接种了delNS1病毒的小鼠均存活，即使在最高接种量（1×106pfu）。接种最高剂量NS1-99病毒的10只小鼠中有8只存活下来（C组），接种较低剂量（3.3×10）的小鼠存活下来4pfu，D组）的存活率为90%。相反，给药2×10后，五只小鼠中只有一只存活三野生型PR8的pfu（E组）。为了测定感染小鼠肺部的病毒复制水平，三组小鼠（每组6只）也感染了1×104PR8、NS1-99或delNS1病毒的pfu，并在第3天或第6天被杀死。NS1-99和delNS1病毒感染小鼠在第3天或第6天均未表现出可检测到的肺滴度（<10 pfu/ml），而野生型PR8病毒感染小鼠的平均肺滴度为2×106pfu/ml和3×104第3天和第6天的pfu/ml。接种1×10的六只小鼠中的一只4pfu PR8病毒在第6天肺部滴定前死亡。
免疫4周后，用1×10攻击存活小鼠5pfu（100 LD50)或5×106pfu（5000 LD50)野生型PR8病毒。如表所示，用1×10免疫小鼠6delNS1（A组）或NS1-99（C组）的pfu在100甚至5000 LD的致命攻击下得到完全保护50A/PR8流感病毒。将NS1-99病毒的免疫剂量降至3.3×104pfu组（D组）保护率为78%，9只小鼠中有7只在激发后2周存活。将delNS1病毒的免疫剂量降低到3.3×104pfu（B组）导致失去对致命（100或5000 LD）的保护50)PR8病毒挑战。所有模拟免疫的小鼠均未受到野生型攻击的保护，而PR8病毒感染后存活的一只小鼠在再次接触该病毒时受到保护。
接种NS1-99和delNS1病毒的小鼠的免疫反应。
在用野生型流感A/PR8病毒攻击之前，从delNS1和NS1-99免疫小鼠（表中A组至D组各5只小鼠）中采集血清样本)以及模拟免疫小鼠（F组），并通过ELISA分析对纯化的流感A/PR8病毒的反应性。如图所示。，接种1×106delNS1病毒（A组；小鼠A1-A5）或NS1-99病毒（C组；小鼠C1-C5）的pfu提供了可测量的抗野生型病毒抗体滴度。delNS1病毒（B组；小鼠B1-B5）或NS1-99病毒（D组；小鼠D1-D5）免疫剂量的降低导致PR8-反应性免疫血清的相应减少。正如预期的那样，接种PBS的小鼠（F组）的血清与纯化的A/PR8流感病毒没有反应。
从delNS1病毒或NS1-99病毒免疫小鼠的血清中获得的甲型流感特异性抗体滴度。如表所示，对样本组A–D或模拟免疫小鼠（F组）的血清样本进行测试在用初级病毒免疫4周后和用野生型PR8病毒攻击前，从小鼠身上采集样本。测试样品对蔗糖纯化流感A/PR8的反应性。外径405显示了1:1000稀释血清的读数。
我们还检测了delNS1或NS1-99病毒免疫小鼠中NP肽特异性T细胞的产生。三组BALB/c小鼠经鼻接种1×10三delNS1、NS1-99或PR8病毒的pfu。在第10天，收集脾细胞并用酶联免疫斑点分析其对流感病毒NP肽的反应性，如前所述(15，16). 如图所示。，用delNS1或NS1-99病毒免疫的小鼠刺激了NP-肽特异性脾细胞的产生，其水平与暴露于野生型流感A/PR8病毒的小鼠相当。正如预期的那样，小鼠经鼻接种PBS并没有诱导产生对流感A NP肽反应的脾细胞。这些结果表明病毒复制至少流产，因为灭活病毒免疫已被证明不会诱导可检测的细胞毒性T淋巴细胞反应(22).
用delNS1病毒或NS1-99病毒免疫小鼠的NP-肽特异性脾细胞。1×10免疫小鼠脾细胞三免疫后10天采集所示病毒的pfu，并检测流感NP肽特异性脾细胞，如材料和方法在两种不同的细胞稀释液中计数与分泌IFN-γ的细胞毒性T淋巴细胞相对应的斑点，并计算每个病毒组的平均值。结果表明，两种不同脾细胞稀释液的平均斑点数外推到1×106细胞。除PR8免疫小鼠外，每组从三只小鼠中采集脾细胞。感染1×10的三只小鼠中的一只三PR8病毒的pfu在免疫后存活，并在第10天杀死用于脾细胞分析。
NS1减毒流感B病毒在胚胎蛋中的生长。
B/201型流感病毒和B/AWBY/234（B/234）型流感病毒是B/Yamagata/1/73型流感病毒的实验室变种，与野生型B/Yamagada型流感的NS1 ORF相比，它们的NS1 OR F发生了变化(6，7). 如图所示。，B/201或B/234的NS基因中的核苷酸缺失产生了导致缩短的NS1蛋白产生的帧移位。流感病毒B/201和B/234的NS1蛋白分别含有110和89个氨基酸，对应于B/山形病毒NS1蛋白的N末端。
野生型B/山形/1/73流感病毒和含有病毒NS1 ORF变异的衍生病毒。流感B/Yamagata NS基因和mRNA转录物的示意图如图所示。病毒NS基因片段由浅灰色方框表示，病毒NS1 ORF由白色方框表示。B/201 NS基因中的13-nt缺失用竖线表示。由B/201 NS1 ORF中的移码产生的17种氨基酸由阴影条表示(8). B/234 NS基因片段中310号核苷酸的缺失导致编码一个亮氨酸的移码，然后是一个终止密码子，用竖线表示。B/234病毒NS1蛋白在氨基酸位置66处也包含glu→val变化（未显示）。B/Yamagata、B/201和B/234 NS基因已经在前面进行了描述(6，8)此处显示的和一起用于NS1 ORF的比较。根据文献预测，显示了B/AWBY NS基因的长度(6).
我们假设B型流感病毒的NS1具有干扰素拮抗活性体内试验。因此，我们研究了编码缩短NS1蛋白的流感B/山形病毒衍生物与野生型流感B/山形病毒相比，在较老的免疫成熟胚胎卵子中是否显示生长减弱。尽管B/201和B/234病毒的滴度低于B/山形病毒（图。). 然而，尽管B/山形病毒在8天龄的卵子中生长良好，但其他两种病毒在该年龄段的胚胎中的生长明显减少。
野生型B/山形病毒、B/201和B/234病毒在胚胎卵中的生长特性。将100 pfu的B型流感病毒注射到胚胎卵子的尿囊腔中，并在35°C下孵育72 h。然后采集尿囊液并进行HA分析。图表表示每种病毒的两到六个卵子的平均HA倒数稀释度。星号表明，对两个鸡蛋进行了测试，得出了相同的HA滴度。流感B/234病毒在8日龄和10日龄鸡蛋中没有HA滴度。
用B/201和B/234病毒为小鼠接种疫苗。
我们还比较了乙型流感病毒在BALB/c小鼠中的毒力。由于B型/山形流感病毒不适合小鼠，也不会导致小鼠疾病或死亡，因此我们检测了病毒肺滴度，作为不同病毒在小鼠宿主内复制能力的指标。我们发现，与野生型B/山形病毒相比，感染后3天，B/201和B/234病毒的病毒滴度下降了两个对数以上（表). 感染后6天，所有感染组的小鼠都清除了病毒，肺滴度低于斑块试验的检测限。在另一个实验中，我们测试了之前对小鼠的免疫是否能够防止野生型B/山形病毒的感染。用B/201或B/234病毒免疫的小鼠确实受到了保护，如第3天这些小鼠肺部的野生型病毒缺乏复制所示。
接种B/201和B/234病毒小鼠的抗体反应。
免疫四周后和野生型病毒攻击前，从感染B/山形病毒、B/201或B/234病毒的小鼠血清中提取血清，并分析针对纯化B/山形病毒的抗体。感染B/Yamagata、B/201或B/234病毒导致显著诱导B/Yamagada病毒特异性血清IgG（图。). 此外，尽管感染这些B型流感病毒的小鼠组之间的病毒肺滴度存在显著差异，但B/山形特异性抗体滴度似乎产生的水平大致相同。
B型流感病毒特异性抗体滴度，取自接种B/Yamagata、B/201或B/234病毒的小鼠血清。检测3×10免疫小鼠的血清样本5指示病毒的pfu或来自模拟免疫小鼠的pfu。在免疫后4周和用野生型B/山形病毒攻击前从小鼠身上采集血清样本。测试样品对蔗糖带B/山形病毒的反应性。显示了1:1000稀释血清的OD405读数。
讨论
成功的活病毒候选疫苗必须满足以下标准：在合适的制备介质中生长到高滴度，在宿主中衰减，以及免疫原性。在本研究中，我们使用流感病毒作为模型系统，探索病毒干扰素拮抗剂的改变，作为创造满足这些要求的疫苗株的手段。
甲型流感病毒胚胎卵的生长。
我们的结果表明，A型流感病毒NS1 ORF的改变会影响这些病毒在胚胎卵中的生长特性。流感A/delNS1是一种完全缺乏抗干扰素NS1蛋白的重组病毒。这种病毒在7天以上的胚胎卵中生长不良（图。 一个和B类). 我们推测，老年卵子生长的减少是因为宿主先天免疫系统的成熟，以及病毒无法抵消老年胚胎卵子中增加的IFN反应(21). 流感A/NS1-99病毒编码一个截短的NS1蛋白，该蛋白含有野生型蛋白的99个N末端氨基酸。与delNS1和野生型PR8病毒相比，NS1-99在鸡蛋中表现出中间生长特征（图。一个)这表明NS1-99病毒编码的缩短的NS1蛋白保留了部分功能。我们尚未确定NS1蛋白对抗细胞IFN反应的确切机制。甲型流感病毒的NS1蛋白具有多种活性（参考文献。23)包括抑制干扰素诱导的蛋白激酶PKR(24，25). 流感病毒A NS1蛋白也被证明与包括双链RNA在内的几种RNA物种结合(25——27)是干扰素反应的有效激活剂(28). 一种或多种NS1活性的减少或丧失可能有助于病毒的衰减。尽管NS1减毒的甲型流感病毒在较老的鸡蛋中的生长减少，但较年轻的鸡蛋已被证明是这些病毒准备性生长到足以进行疫苗接种研究的滴度的合适培养基。
流感A delNS1和NS1-99病毒在小鼠中的衰减。
潜在活疫苗的另一个重要特征是宿主体内的衰减。当给小鼠注射时，delNS1和NS1-99病毒在BALB/c小鼠中的毒力远低于野生型流感A/PR8病毒（表). 鼻腔接种1×106delNS1的pfu不会导致受感染小鼠的疾病（数据未显示）或死亡。此外，LD50NS1-99病毒的感染率显著高于LD50PR8病毒（即1×10三pfu），因为80%的小鼠感染了1×106NS1-99病毒的pfu存活。
就像免疫成熟的胚胎卵子一样，野生型小鼠代表着干扰素的环境。如果不能完全对抗这种干扰素反应，delNS1和NS1-99病毒在小鼠宿主体内会被严重削弱。最近对副粘病毒的研究加强了病毒编码干扰素拮抗剂的改变与衰减相关的论点(29——31).
保护delNS1和NS1-99免疫小鼠。
我们还想评估编码改变的NS1蛋白的甲型流感病毒诱导保护性免疫反应的能力。我们发现，尽管delNS1和NS1-99病毒在小鼠宿主中被减弱，但它们仍然能够诱导免疫反应，能够在高致死剂量（5000 LD50)野生型A/PR8流感病毒。1×10免疫小鼠6delNS1或NS1-99病毒的pfu提供了可测量的抗体滴度，并100%防止致命攻击。正如预期的那样，减少delNS1或NS1-99病毒的免疫剂量会导致PR8-特异性血清IgG水平降低，并减少受野生型攻击保护的小鼠数量（a–D组，图。、和表). B组和D组的抗体水平与保护无关。然而，与同等剂量的delNS1病毒相比，接种这种剂量的NS1-99病毒似乎能产生更好的保护作用。我们计划研究其他NS1突变体是否具有更强的免疫原性，以及delNS1和NS1-99病毒诱导的保护是否可以通过增强方案得到改善。
delNS1和NS1-99病毒诱导流感NP肽特异性CD8+脾细胞的数量与野生型流感PR8病毒相当（图。)，表明免疫这些NS1改变的病毒会刺激免疫系统的这种细胞介导成分。尽管细胞介导的免疫可能不足以完全保护，但它已被证明对从受感染的宿主中清除流感病毒至关重要(32).
减弱的B型流感病毒。
流感A和B病毒NS1蛋白的序列同源性很低。然而，与A型流感病毒NS1蛋白一样，B型流感病毒NS1能够抑制干扰素诱导蛋白激酶（PKR）的激活，并与双链RNA结合在体外(33).
我们假设B型流感NS1蛋白作为干扰素拮抗剂发挥作用。我们在这里证明，含有改变的NS1蛋白（B/234和B/201病毒）的B型流感病毒的卵子中的生长与先前报道的IFN诱导性成反比（图。) (20，21). 在BALB/c小鼠中，B/234和B/201病毒也被减弱（表)与野生型B/山形病毒相比，感染后3天小鼠肺部pfu滴度显著降低。尽管已减弱，但B/234和B/201流感病毒在BALB/c小鼠中诱导了免疫反应，能够降低野生型B/山形病毒的感染性（图。和表).
我们推测，B/234和B/201病毒的生长减弱是由于这些病毒编码的改变的NS1蛋白作为干扰素拮抗剂的能力下降。然而，B型流感病毒NS1作为干扰素拮抗剂的能力有待进一步的功能分析。
疫苗方法。
为了对抗I型干扰素快速有效地诱导抗病毒状态，许多病毒编码干扰素拮抗剂（参考文献。34). 甲型流感病毒的NS1蛋白已被证明在该病毒复制周期的这一方面发挥着重要作用(4). 我们发现，含有NS1蛋白改变的A型和B型流感病毒被减弱，并对野生型病毒的攻击提供保护性免疫。我们建议，删除病毒编码的干扰素拮抗剂或诱变这些蛋白以降低活性可作为构建最佳减毒和免疫原性活病毒疫苗的一般策略。
