美国国家科学院院刊。2007年3月20日；104(12): 4949–4954.
Hutchinson-Gilford早衰综合征中过度表达的层粘连蛋白A蛋白亚型干扰早衰症和正常细胞的有丝分裂
,* ,* ,* ,†和*†
堪曹
*马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家人类基因组研究所基因组技术分所，邮编：20892；和
布莱恩·卡佩尔
*马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家人类基因组研究所基因组技术分所，邮编：20892；和
迈克尔·R·鄂尔多斯
*马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家人类基因组研究所基因组技术分所，邮编：20892；和
卡里马·贾巴利
†纽约哥伦比亚大学外科医生学院皮肤科，纽约10032
弗朗西斯·柯林斯
*马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家人类基因组研究所基因组技术分所，邮编：20892；和
*马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家人类基因组研究所基因组技术分所，邮编：20892；和
†纽约哥伦比亚大学外科医生学院皮肤科，纽约10032
Francis S.Collins撰稿，2006年12月29日
.作者贡献：K.C.和F.S.C.设计的研究；K.C.和B.C.C.进行了研究；K.C.和K.D.提供了新的试剂/分析工具；K.C.、M.R.E.和F.S.C.分析数据；K.C.和F.S.C.撰写了这篇论文。
- 补充资料
支持性数字
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摘要
Hutchinson–Gilford早衰综合征（HGPS）是一种罕见的遗传病，其特征是显著的过早衰老。经典HGPS是由从头开始基因第11外显子点突变（残基1824，C→T）LMNA公司该基因激活了一个隐秘的剪接供体，并导致一个名为“progerin/LAΔ50”的突变层粘连蛋白a（LA）蛋白，该蛋白缺乏正常的切割位点，无法去除C末端法尼基。在间期，不可逆的法尼基化前体蛋白/LAΔ50锚定在核膜上，引起典型的核泡。然而，有丝分裂期间前体蛋白/LAΔ50的定位和行为完全未知。在这里，我们报告了在有丝分裂期间，progrein/LAΔ50错误定位于不溶性细胞质聚集体和膜，导致异常染色体分离和双核化。这些表型在很大程度上被法尼酰转移酶抑制剂或法尼酰化无能突变的孕激素/LAΔ50挽救。此外，我们还证明，正常成纤维细胞中存在少量的前体蛋白/LAΔ50，并且这些表达前体蛋白/LAΔ50的正常细胞中有很大一部分是双核的，这意味着前体蛋白/LAΔ5 0在正常衰老过程中会导致类似的有丝分裂缺陷。我们的发现提供了HGPS有丝分裂异常的证据，并可能揭示衰老的一般现象。
关键词：衰老，椎板病，进展
这个LMNA公司该基因编码A型层粘连蛋白，包括层粘连A（LA）、层粘连C、层粘着C2和层粘连Δ10。LA是核膜的主要组成部分，核膜是位于核膜（NE）下方的动态网络，提供必要的机械支撑。此外，LA与染色质直接或间接相关，并被认为在染色质组织、转录、DNA复制和凋亡中发挥重要作用(1,2). 在NE外围，LA前体经历了一个独特的翻译后成熟过程，其中其羧基末端的CAAX基序在AAX序列的蛋白水解去除和羧甲基化之前发生法尼基化。然后，前胺A的最后15个氨基酸被一种称为Zmpste24/FACE1的内蛋白酶分解，释放出未烯化的成熟LA(三).
至少有12种疾病与LMNA公司基因（统称为“层粘连病”）(1,4). 其中，Hutchinson–Gilford早衰综合征（HGPS）是最具破坏性的疾病之一，以类似性早衰的模式影响多个组织。患有HGPS的儿童出生时通常表现正常，但一年内开始出现加速衰老的影响，包括脱发、皮下脂肪减少、心血管疾病和骨骼异常。平均来说，13岁时死于心脏病发作或中风(5,6). 大多数HGPS病例与从头开始1824位C→T的核苷酸替换。这种突变不会引起氨基酸改变（G608G），但会部分激活一个隐秘的剪接供体位点，并导致前层蛋白a mRNA内150 bp的框内缺失(7,8). 截短的前层蛋白A mRNA随后被翻译成一种最近命名为progrein/LAΔ50的蛋白质(7). 由于内部50-aa缺失，progerin/LAΔ50中缺少Zmpste24/FACE1裂解位点，因此progerin/LAΔ50保留了C末端法尼基化(9,10).
在细胞水平上，HGPS与间期细胞核的显著变化有关，包括NE起泡、核板增厚、外周异染色质丢失和核孔聚集(11). HGPS成纤维细胞中也有转录调控异常的报道(12,13). 间期核结构的这些改变与HGPS细胞中前体蛋白/LAΔ50蛋白的逐渐积累有关(11). 用法尼基转移酶抑制剂（FTI）处理HGPS成纤维细胞可使前体蛋白/LAΔ50部分重新定位，远离NE，并减少间期核形态异常(9,14). 最近的一项研究(15)已确定正常个体的细胞中也存在少量progrein/LAΔ50，这表明在正常衰老过程中可能也存在类似的机制。
迄今为止，对HGPS生物学的研究主要集中在研究间期核异常。据我们所知，无论是有丝分裂过程中孕激素/LAΔ50的定位，还是孕激素/LAΔ50积累可能引起的有丝分裂缺陷，以前都没有得到解决。在本研究中，我们检测了前体蛋白/LAΔ50在转染HeLa细胞和来自HGPS患者的成纤维细胞中的有丝分裂定位。我们的结果表明，在有丝分裂过程中，progrein/LAΔ50错误定位于不溶性的细胞质聚集体和细胞膜，导致染色体错误分离和双核化。此外，我们发现这些表型主要是通过FTI或法尼基化不敏感突变前体蛋白/LAΔ50挽救的。此外，我们证明在正常成纤维细胞中存在少量的孕激素/LAΔ50，并且这些表达孕激素/LAΔ50的正常细胞中有很大比例是双核的，这表明孕激素/LAΔ50在正常衰老过程中会导致类似的有丝分裂缺陷。
结果和讨论
为了在有丝分裂中定位前体蛋白/LAΔ50，我们首先检测了GFP标记的前体蛋白/LAΔ50在N末端的有丝分裂定位。用GFP-progrein/LAΔ50或对照GFP-LA转染HeLa细胞，48小时后观察。与中期GFP-LA的均匀扩散信号相反，GFP-progrein/LAΔ50组装成不溶性细胞质聚集体，并与膜状网络结构相关(一). 共焦显微镜观察表明，这些细胞质聚集体分布在有丝分裂的细胞质中（数据未显示）。免疫荧光研究表明，GFP-progrein/LAΔ50与emerin共定位，emerin是有丝分裂过程中建立的膜泡标记物(16,17) (b)证实了有丝分裂中前体蛋白与细胞膜的联系。有趣的是，在表达GFP-前体蛋白/LAΔ50的有丝分裂细胞中，膜网络似乎更加完整（聚合），表明前体蛋白/LAΔ50在有丝分裂期间干扰正常的膜形态发生。重要的是，DAPI染色显示，与表达GFP-LA的对照细胞相比，GFP-前体蛋白/LAΔ50的表达导致后期滞后染色体显著增加( c（c）和d日)，表明孕激素/LAΔ50的异常定位导致有丝分裂过程中的染色体分离缺陷。值得注意的是，类似的后期染色体分离缺陷在秀丽隐杆线虫当RNAi下调lamin的表达时(18). 此外，FACS分析显示，与表达对照GFP-LA的HeLa细胞相比，表达GFP-前体蛋白/LAΔ50的HeLa细胞的G2-M指数增加[支持信息（SI）图6]表明GFP-progren/LAΔ50表达细胞的有丝分裂进程延迟。与FACS分析一致，定量分析显示GFP-progrein/LAΔ50转染细胞在有丝分裂后期（从后期到末期）的细胞时间明显长于对照GFP-LA-转染细胞（分别为6%和2%），而GFP-progrein/LAΔ50-或GFP-LA-转染细胞在早期有丝分裂（从中期到中期）中所花费的时间是相当的(e（电子）). 这种延迟表明表达GFP-progrein/LAΔ50的细胞在有丝分裂后期很难解决两个子细胞之间的滞后染色体。
GFP-前体蛋白/LAΔ50转染细胞中的有丝分裂缺陷（在所有图中，前体蛋白/LAΔ50被称为前体蛋白）。(一)GFP-LA和GFP-前体转染有丝分裂细胞的活细胞图像。(b)使用抗emerin抗体对GFP-LA或GFP-前体转染的有丝分裂细胞进行免疫荧光。(c（c）)DAPI染色显示GFP前体转染的后期细胞中存在滞后染色体（红色箭头）。(d日)GFP-LA或GFP-前体转染细胞中异常染色体分离的量化。(e（电子）)GFP-LA或GFP-前体转染细胞在有丝分裂早期（从中期到中期）或晚期（从后期到末期）的定量。转染GFP前体蛋白后，细胞有丝分裂后期显著增加。（比例尺：20μm）
由于有丝分裂期间前体蛋白/LAΔ50的异常定位可能会影响其迁移率，因此我们接下来使用光漂白过程中的荧光损失（FLIP）和光漂白后的荧光恢复（FRAP）来测量GFP-前体蛋白/LAΔ50在有丝分裂过程中的动态行为。实验在转染GFP-LA或GFP-progrein/LAΔ50后48小时在HeLa细胞中进行。在FLIP中，我们发现在有丝分裂早期，对照组GFP-LA转染细胞的GFP总荧光强度下降明显快于GFP-progrein/LAΔ50转染细胞( 一和b). 以前的研究表明，在有丝分裂期间，LA通常处于游离未聚合状态(19)，但FLIP数据表明GFP-progrein/LAΔ50处于不扩散状态，与微观观察一致( 一和b)有丝分裂期间，前体蛋白/LAΔ50的显著部分是膜相关的或聚集的。使用FRAP，我们发现在对照组GFP-LA表达的有丝分裂细胞中(t吨1/2)LA恢复时间为1.5–2.5 s( c（c）和d日)，与之前的报告类似(20). 然而t吨1/2对于膜相关GFP-前体蛋白/LA，Δ50的回收率增加到5–7s（称为前体蛋白-Mc（c）)，20%保持不动。此外，不溶性细胞质聚集体中的GFP progerin/LAΔ50的恢复速度要慢得多(t吨1/2>有丝分裂HeLa细胞中膜相关GFP-前体蛋白/LAΔ50（称为前体蛋白-Ac（c）)，固定分数增加到≈50%。因此，前体蛋白/LAΔ50与细胞膜结合，在有丝分裂中形成不溶性聚集物。前体蛋白/LAΔ50的异常定位影响其流动性，并导致随后的染色体分离缺陷和有丝分裂延迟。
有丝分裂期间GFP-progrein/LAΔ50的异常动态行为。(一和b)FLIP分析。(一)指定区域FLIP期间GFP-LA或GFP-progrein/LAΔ50转染有丝分裂细胞的选定图像（黄色方框）。(b)GFP-LA-或GFP-孕激素/LAΔ50转染的有丝分裂细胞中总FLIP（白色圆圈区域）的动力学。(c（c）和d日)FRAP分析。(c（c）)在细胞质中指定区域的FRAP期间，GFP-progrein/LAΔ50-或GFP-LA-转染有丝分裂细胞的选定图像（如白色箭头所示）。孕激素-M，膜相关孕激素/LAΔ50；前体蛋白-A，聚集前体蛋白/LAΔ50（亮点）。(d日)转染有丝分裂细胞中GFP-LA或GFP-progrein/LAΔ50 FRAP动力学。中的值b和d日表示来自至少六个不同单元格的平均值。照片以60倍放大率拍摄。
先前的研究表明，法尼基化C末端的保留导致前体蛋白/LAΔ50在间期永久锚定在NE中，导致HGPS的特征性核起泡(9,11). 我们在此假设，在有丝分裂期间，C末端法尼化促进了前体蛋白/LAΔ50与细胞质膜小泡的异常结合，因此阻断前体蛋白/LAΔ50的法尼化将恢复有丝分裂过程中的正常定位和运动。为了验证这一想法，我们首先使用了GFP-progrein/LAΔ50-SSIM，因为C末端CSIM基序的半胱氨酸残基突变为丝氨酸，所以不能进行法尼基化。将该构建物转染到HeLa细胞中，并在48小时后成像。作为对照，我们也转染重量GFP-LA、GFP-progrein/LAΔ50或GFP-LA-SSIM进入HeLa细胞。正如预测的那样，GFP-progrein/LAΔ50-SSIM没有聚集，而是分散分布在细胞质中(一)，信号与GFP-LA或GFP-LA-SSIM无法区分(一和数据未显示）。此外，在表达GFP-progerin/LAΔ50-SSIM的有丝分裂细胞中未观察到progerin/LAΔ50诱导的膜聚合(一). FRAP和FLIP分析进一步证实，在有丝分裂期间，progrein/LAΔ50-SSIM处于未聚合自由状态，其迁移率与GFP-LA非常相似(b).
法尼化C末端的保留导致GFP-progrein/LAΔ50在有丝分裂过程中的异常定位和动态行为。(一)GFP-progren-和GFP-progran-SSIM转染有丝分裂细胞的活细胞图像。每种类型都显示了两个示例。(b)整体FLIP动力学(左侧)和FRAP(赖特)在GFP-LA-、GFP-progren-和GFP-progran-SSIM转染的有丝分裂细胞中。(c（c）)模拟（DMSO）或FTI（2.0μM lonafarnib）处理48小时后，GFP-LA-或GFP-progerin转染的有丝分裂细胞的活细胞图像(d日)有丝分裂细胞总FLIP的动力学c（c）中的值b和d日表示来自至少五个不同单元格的平均值。（比例尺：20μm）
接下来，我们探讨了临床候选FTI（lonafarnib）治疗GFP-progrein/LAΔ50转染HeLa细胞的效果/{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“SCH66336”，“term_id”：“1052737610”，“term_text”：“SHH66335”}}SCH66336型). 每天用两次2.0μM FTI处理细胞（一次在转染时，另一次在24小时后），并在转染48小时后进行分析。我们发现，FTI处理导致膜上的前体蛋白/LAΔ50显著溶解，导致有丝分裂细胞质中GFP-前体蛋白/LAΔ50的信号基本均匀且弥散，尽管仍有一些聚集物存在(c（c）). 定量分析显示，约20%的FTI处理的GFP-progrein/LAΔ50转染有丝分裂细胞没有显示细胞质聚集，而DMSO处理的细胞中只有<3%（数据未显示）。与这一发现一致，对这些细胞的FLIP分析表明，FTI治疗显著恢复了GFP-progrein/LAΔ50的流动性(d日). 因此，前体蛋白/LAΔ50在有丝分裂期间的异常定位和运动明显归因于其C末端法尼基化的保留。
为了进一步研究孕激素/LAΔ50引起的有丝分裂表型，我们检测了患有经典HGPS的个体的原代真皮成纤维细胞。对三名HGPS患者和一名未受影响的父母的培养成纤维细胞进行了测试。因为所有HGPS原代细胞都显示出类似的结果，所以这里我们只显示了两个细胞系的结果：HGADFN167（HGPS）和HGADFN268（正常）。为了检测有丝分裂中的前体蛋白/LAΔ50，我们首先用一种新开发的抗前体蛋白/LAΔ50特异性抗体进行双重免疫荧光染色(21)（抗前体蛋白）和有丝分裂HGPS成纤维细胞中的抗α-微管蛋白抗体。在对照成纤维细胞系中，我们用抗LA/层粘连蛋白C抗体MAB3211和相同的抗α-微管蛋白抗体进行免疫染色。在大多数有丝分裂的HGPS成纤维细胞中，我们观察到在中期，progren/LAΔ50定位为遍布细胞质的许多点状小点(一)而对照组正常成纤维细胞中LA/层粘连蛋白C的染色呈弥漫性和均匀性(一)与之前的报告一致(20). 在少数情况下（<5%），抗前体蛋白抗体标记HGPS有丝分裂细胞中的大膜样聚集物(b)类似于GFP-progrein/LAΔ50转染HeLa细胞中观察到的结果(一和一). 根据抗前体蛋白荧光标记的强度，我们推测这些HGPS有丝分裂细胞积累了更多的前体蛋白/LAΔ50。接下来，比较progrein/LAΔ50与重量同时，我们对HGPS进行共染色，并用抗LA/层粘连蛋白C抗体MAB3211和抗前体蛋白控制正常成纤维细胞，并在有丝分裂期间跟踪前体蛋白/LAΔ50和LA/层黏连蛋白C。MAB3211识别的表位也存在于前体蛋白/LAΔ50中，因此MAB3211-在HGPS细胞中同时标记了LA/层粘连蛋白C和前体蛋白/层粘着蛋白Δ50，但定量上，我们预计该单克隆抗体的大部分信号来自LA和层粘连分子C，因为前体蛋白/LAΔ5是在较低水平合成的(7,11,22). 我们发现，从有丝分裂开始到中期，HGPS细胞中MAB3211的信号与抗前体蛋白的信号广泛重叠（数据未显示）。然而，有趣的是，免疫荧光分析显示，与有丝分裂后期相比，NE的前体蛋白/LAΔ50的募集延迟重量有丝分裂期相似的正常细胞中的LA/层粘连蛋白C(c（c）). 具体来说，当后期B正常细胞中分离的染色体周围聚集了>90%的LA时，约40%的前体蛋白/LAΔ50留在细胞质中（根据抗前体蛋白染色的荧光强度判断）(c（c）). 末期，当几乎100%的LA定位于正常对照细胞中新重组的细胞核时，约10%的前体蛋白/LAΔ50仍留在HGPS成纤维细胞的细胞质中。这些观察结果表明，与NE相比，膜泡相关的前体蛋白/LAΔ50重组速度较慢重量LA在有丝分裂晚期。
HGPS成纤维细胞有丝分裂缺陷。(一)来自正常父亲（HGADFN168）和患有经典HGPS（HGADFN167）的儿童（分别具有抗LA/层粘连蛋白C或抗孕激素）的原代真皮成纤维细胞的免疫荧光（红色）。同样的细胞也用抗α-微管蛋白（绿色）和DNA DAPI（蓝色）进行了复染。(b)一个例子显示，抗前体蛋白抗体有时标记HGPS有丝分裂细胞中的大膜样聚集物。(c（c）)用抗前体蛋白（绿色）和抗LA/层粘连蛋白C（红色）抗体对一名正常父亲（HGADFN168）和一名典型HGPS儿童（HGADVN167）的有丝分裂成纤维细胞进行双重免疫检测，显示在有丝分裂后期，前体蛋白/LAΔ50重组到NE的时间延迟。(d日)HGPS和正常成纤维细胞中异常染色体分离的代表性图像和定量。箭头指向滞后染色体。(e（电子）)HGPS成纤维细胞双核化的图像和量化。箭头指向双核细胞。（比例尺：20μm）
由于转染的GFP-前体蛋白/LAΔ50在有丝分裂HeLa细胞中诱导染色体错误分离，我们询问HGPS成纤维细胞中的内源性前体蛋白/LAΔ50是否可以以类似的方式破坏染色体分离。事实上，DAPI染色显示HGPS后期细胞中滞后染色体的百分比增加(d日; ≈HGPS成纤维细胞为30%，而正常成纤维细胞小于5%）。此外，定量显示，与对照成纤维细胞的＜0.5%相比，HGPS成纤维细胞中的双核细胞增加到2–5%(e（电子）). 与我们在这里的观察一致，之前的一份报告(12)显示HGPS成纤维细胞中多倍体（8N）细胞增多。我们认为，HGPS中观察到的双核化是由于在胞质分裂期间未能解决滞后染色体引起的。我们还发现，双核HGPS细胞的百分比随着传代数的增加而增加，这可能是由于在较老的HGPS细胞中积累了更多的前体蛋白/LAΔ50所致。
最近的一项研究(15)提供了正常细胞中存在极少量前体蛋白/LAΔ50转录本的证据，这意味着即使存在正常序列，外显子11中的隐秘剪接位点也可以使用。我们使用抗前体蛋白/LAΔ50抗体进行免疫荧光，直接观察正常人成纤维细胞中的前体蛋白/LAΔ50。在我们的初步研究中，共测试了四个未受影响的成纤维细胞系。因为它们的行为都相似，所以这里只显示了一个正常成纤维细胞系的图像。而如前所述，在绝大多数正常细胞中，抗前体蛋白/LAΔ50抗体几乎没有信号(21)，它明亮地标记了一个非常小的正常细胞核亚群（示例如所示一和SI图7). 与免疫荧光研究一致，用该抗体进行的Western blotting分析在正常细胞的全细胞裂解物中检测到一条微弱但明确的带（数据未显示）。基于这些观察结果，我们得出结论，正常成纤维细胞中存在少量前体蛋白/LAΔ50，但分布不均匀。
前体蛋白/LAΔ50在正常人成纤维细胞中的表达。(一)使用抗LA/层粘连蛋白C（红色）和抗前体蛋白（绿色）对来自未受影响个体的成纤维细胞（HGADFN168）进行免疫荧光检测。DNA用DAPI复染成蓝色。箭头表示表达前体蛋白/LAΔ50的正常细胞。（比例尺：20μm）(b)不同传代时两个独立正常成纤维细胞系中progrein/LAΔ50阳性正常细胞的定量（第12、19和26代的HGADFN168；第10、24和30代的HGADFN090）。
接下来，我们确定了这些表达前体蛋白/LAΔ50的正常细胞的异常情况。由于原代成纤维细胞中有丝分裂细胞的比例很小，我们没有检测到任何正常有丝分裂的细胞表达progrein/LAΔ50。在正常间期细胞中，抗前体蛋白抗体主要标记两种类型的细胞核：双核或巨核（定义为直径至少是平均细胞直径长度的两倍的细胞核）(一). 此外，该抗体在少数凋亡细胞的高浓缩细胞核周围产生了一些弥散染色(一). 有趣的是，在双核孕激素/LAΔ50阳性的正常细胞中，经常检测到两个子核之间未解决的染色体桥（如图一; 更多示例见SI图7)，表明有丝分裂前期曾发生异常染色体分离。此外，正如之前的一项研究所表明的那样(23)表达前体蛋白/LAΔ50的细胞中的巨核，根据其DAPI总染色强度，可能是多倍体，这也意味着有丝分裂异常。这些结果表明，progrein/LAΔ50可能通过诱导与HGPS细胞相似的有丝分裂缺陷而促进正常衰老过程。重要的是，对两个独立的正常成纤维细胞系进行定量分析表明，progren/LAΔ50阳性正常细胞（包括双核细胞和巨细胞）的百分比随着传代数的增加而增加(b)，进一步支持progren/LAΔ50诱导的有丝分裂异常与正常衰老之间的相关性。正常成纤维细胞中progren/LAΔ50表达的双峰分布很奇怪，这表明在晚期通过细胞中存在某种不可逆开关，激活外显子11中的隐匿剪接位点，并引发一系列导致有丝分裂缺陷和最终衰老的事件。
总之，我们的研究表明，在有丝分裂期间，前体蛋白/LAΔ50的异常膜结合和动态行为导致HGPS和正常细胞染色体异常分离。这些观察结果进一步揭示了前体蛋白/LAΔ50在正常衰老过程中的作用，表明HGPS有丝分裂缺陷的分子机制可能也在较高传代的正常细胞中以低水平发挥作用。结合以往研究的结果，这些数据增加了人们对长期以来的假设的信心，即对早衰遗传形式的研究可以为正常的衰老过程提供重要的线索。
材料和方法
细胞培养。
在37°C下，在补充有10%FBS的DMEM（Invitrogen/GIBCO，Carlsbad，CA）中培养HeLa细胞。原代人皮肤成纤维细胞在补充有15%FBS（Invitrogen）和2 mM的MEM（Invit罗gen/GIBCO）中培养我-谷氨酰胺。我们研究中使用的原代成纤维细胞系为：AG01972（HGPS）、AG06299（正常）、AG03258（正常）和AG03257（正常），从Coriell cell Repositories（Camden，NJ）订购；以及来自Progeria Research Foundation（马萨诸塞州皮博迪）的HGADFN167（HGPS）、HGADFN2003（HGPS）、HGADFN168（正常）和HGADFN 090（正常）。为了一致性，除非另有说明，本文中的所有结果均对应于来自HGADFN167（HGPS）和HGADFN268（正常）的成纤维细胞。
质粒和细胞转染。
参考文献中描述了pEGFP-myc-LA结构（此处称为GFP-LA）、LAΔ150结构（此处简称为GFP-progerin/LAΔ50）、GFP-progrein/LA△50-SSIM和GFP-LA-SSIM。9在双室载玻片中，HeLa细胞以≈50000个细胞/室的速度进行培养（纽约州罗切斯特Nunc）。24小时后，使用FuGENE 6（印第安纳波利斯州罗氏市）将这些细胞瞬时转染0.5μg每种构建物。48小时后，在显微镜下直接观察这些细胞，或固定用于进一步的免疫荧光研究。
GFP定位和免疫荧光研究。
在室温下用4%甲醛/PBS固定HeLa细胞和培养箱载玻片（Nunc）上生长的原代成纤维细胞20分钟，然后用0.5%Triton X-100/PBS或甲醇/丙酮（1:1）在−20°C下处理5分钟，如前所述(21). 用PBS冲洗固定细胞，并用10%马血清和4%牛血清在PBS中封闭30分钟。然后用在封闭溶液中稀释的初级抗体培养细胞1小时。这些抗体包括K.Djabali（哥伦比亚大学）善意提供的抗前体蛋白/LAΔ50的兔抗体、兔抗emerin（马萨诸塞州剑桥Abcam）、鼠抗LA/层粘连蛋白C（加利福尼亚州特梅库拉Chemicon）和鼠抗α-微管蛋白（Abcam。次要抗体是Alexa 488或594结合的驴抗兔或驴抗鼠IgG抗体（加利福尼亚州卡尔斯巴德市分子探针）。所有样品也用DAPI（加利福尼亚州伯林盖姆向量实验室）进行复染。用LSM510共焦显微镜（蔡司，桑伍德，纽约）或Axioplan荧光显微镜（蔡斯）观察细胞。
FRAP和FLIP显微镜。
HeLa细胞在Lab-Tek盖玻璃底室（Nalge，Rochester，NY）上进行电镀和转染，并在转染48 h后进行分析。FRAP和FLIP实验在倒置共焦显微镜（LSM 510；蔡司）上使用488-nm激光进行。在FRAP实验中，细胞被扫描四次，然后在全激光功率下对一个小感兴趣区域（ROI）进行一次漂白200 ms。然后以0.4 s的间隔收集单截面图像，持续最长1 min。在FLIP实验中，选择区域（11×11像素）在全激光功率下，以0.4s的间隔重复漂白，每次漂白200ms。每次漂白后，测量漂白区域和整个细胞质的荧光强度损失。为了确定ROI的相对荧光强度，对每个时间点区域的荧光强度进行标准化，如所述(24).
致谢
我们感谢先灵葆雅公司提供药物lonafarnib/SCH66336，感谢Paul Leo博士支持FLIP和FRAP实验，感谢Stacie Anderson博士支持FACS分析，感谢Robert Goldman博士提供信息丰富的讨论，感谢Samir Kelada博士提供有用的意见。这项研究得到了美国国立卫生研究院国家人类基因组研究所的校内研究计划的支持。
缩写
| HGPS公司 | Hutchinson–Gilford早衰综合征 |
| 洛杉矶 | 层粘连蛋白A |
| FTI公司 | 法尼基转移酶抑制剂 |
| 氖 | 核外壳 |
| 翻转 | 光漂白中的荧光损失 |
| 联邦铁路管理局 | 光漂白后荧光恢复。 |
工具书类
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