肝细胞生长因子/散射因子（HGF/SF）最初通过其对Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞的运动活性进行鉴定1以及其对肝细胞的有丝分裂活性。2,三HGF/SF是啮齿动物或人类肝细胞原代培养的一种强有力的促有丝分裂和运动因子。此外，HGF/SF已被证明对多种细胞系统具有形态发生特性。4
HGF/SF是一种重要的多功能细胞因子，参与肝脏损伤后的发育和修复。在小鼠中，HGF/SF基因或其酪氨酸激酶受体基因的纯合缺失(c-met公司)与胚胎致死有关。5,6在HGF/SF基因敲除的情况下，死亡主要是因为胎盘发育异常。对这些动物的肝脏进行的检查显示，它们体重严重不足，实质细胞大量丢失。6通过在e9.5天一次性注射HGF/SF，HGF/SF-基因敲除的胚胎可以从死亡状态中挽救出来，但对被挽救动物的组织学检查表明，器官发生，特别是肝脏的器官发生受到严重损害。7
HGF/SF由间充质细胞合成为723-（缺失型）或728-（全长）氨基酸单链多肽。8,9从N端到C端，HGF/SF包含一个发夹环，其后是4个kringle结构域和一个伪氨基酸蛋白酶结构域。HGF/SF作为一种非活性的单链蛋白分泌，在Arg-Val-Val-Val（aa494-495）位点通过裂解被蛋白水解激活。已鉴定出两种能够将非活性单链HGF/SF（scHGF/SF）裂解为活性2-链HGF/SF（tcHGF/S）的酶：尿激酶纤溶酶原激活剂（uPA）10,11和HGF活化剂（HGFa）。12HGF/SF重链包含发夹环和四个kringle域。其表观分子量为65 kd。HGF/SF轻链具有伪氨基酸蛋白酶结构域。其表观分子量为30至34 kd。HGF/SF受体（c-Met）13,14能够以相似的亲和力结合非活性scHGF/SF和活性tcHGF/SF，但只有tcHGF/SF激活c-Met酪氨酸激酶结构域。15,16间充质细胞负责生成HGF/SF，17,18而包括肝脏在内的各种器官和组织的上皮细胞正常表达c-Met。19因此，HGF/SF被认为是肝脏和其他器官间质-上皮相互作用的重要介质。
由于四氯化碳等化学物质、三分之二的肝脏手术切除、部分肝切除术（PHX）或拮抗性Fas抗体导致肝脏损伤后，血液中HGF/SF的水平急剧升高。20–23PHX前给大鼠注射HGF/SF中和抗体可消除血清中HGF/SF正常升高，肝细胞增殖受到严重抑制。24在PHX模型中，相关HGF/SF激活剂似乎是uPA。25在PHX后5分钟内检测到uPA活性，并且向再生肝蛋白的匀浆中添加uPA中和抗体将消除与匀浆相关的正常观察到的HGF/SF激活。26此外，uPA似乎是Fas介导的肝损伤模型中的相关激活物。当在缺乏uPA的动物中诱导Fas介导的肝损伤时，肝再生严重受损。23这进一步表明了uPA在再生肝脏HGF/SF激活中的重要性。
肝脏是静脉注射后清除放射性标记HGF/SF的主要器官。27,28清除动力学是双相的，代表细胞表面HGF/SF的两个已知结合位点：c-Met和硫酸肝素蛋白聚糖。29由于HGF/SF与间质细胞外基质具有中等亲和力，因此肝脏具有在其细胞外基质中隔离大量HGF/SF的能力。通过向肝脏灌注高盐溶液，可以从肝脏生物基质中洗脱大量HGF/SF的事实证实了这一点。30
在PHX后的肝再生过程中，HGF/SF效应非常重要。24早期对肝再生过程中c-Met磷酸化状态的研究表明，c-Met受体的酪氨酸磷酸化在PHX后1小时内达到峰值。31鉴于HGF/SF基因表达直到PHX后3至6小时才上调，32PHX后前3小时内使用的HGF/SF必须主要来自体内预先存在的储存物。第一波肝细胞DNA合成在PHX后24小时达到峰值，发生在门脉周围区域。33这与之前报道的肝内HGF/SF分布相关。免疫组织化学研究以及放射性标记的HGF/SF实验表明，正常肝脏的门脉周围区域是HGF/SF浓度最高的区域。34
目前对PHX后肝再生过程中肝脏或血液中存在何种形式的HGF/SF知之甚少。我们目前的研究使用免疫印迹法检测肝组织和血液中PHX后的scHGF/SF（非活性）和tcHGF/SF（活性）。此外，我们研究了在部分肝切除术前注射到肝脏中的预先存在的放射性标记的HGF/SF的命运，以确定储存在肝脏中的HGF/SF是否确实在肝再生早期被消耗。
材料和方法
材料
除非另有说明，否则所有化学品均来自西格玛化学公司（密苏里州圣路易斯）。
动物
所有实验均在体重140至150 g的雄性Fisher 344只大鼠上进行（马萨诸塞州威明顿市Charles River Laboratories）。允许动物获得食物和水随意直到它们被用于实验程序。匹兹堡大学动物使用和护理机构委员会批准了所有住房安排和实验程序。除非另有说明，否则使用美托芬（伊利诺伊州蒙德林市皮特曼-穆尔）麻醉动物进行手术。
部分肝切除术和采血
按照希金斯和安德森最初的描述，对大鼠进行了三分之二的部分肝切除。35对于对照组，进行时间匹配的假手术。Sham手术包括剖腹手术和胸骨剑突切除术。在规定的时间点，用戊巴比妥（伊利诺伊州芝加哥阿伯特）对动物进行麻醉，并切除剩余的肺叶。所有肝脏样本立即在液氮中冷冻并储存在−80°C。使用含有50μL 15%EDTA的注射器通过下腔静脉收集用于血浆制备的血液，然后将血液转移到紫色顶部的真空管中（新泽西州富兰克林湖市贝克顿-迪金森）。Vacutainer管在4°C下以3000 rpm旋转5分钟。去除血浆，并将AEBSF（一种丝氨酸蛋白酶抑制剂）添加到0.05 mg/mL的最终浓度。血浆冷冻直至使用。
肠系膜静脉注射
大鼠在美托芬麻醉下进行手术。通过中线剖腹探查腹膜腔。在通过肠的腹腔外重新定位显示肠系膜下静脉后，通过带有30号针头的1mL注射器将200μL标记的scHGF/SF（日本大阪丰男的礼物）注入肠系膜下静脉。注射后，取下针头后，用无菌棉签手动按压注射部位，以将出血风险降至最低。然后将这些动物饲养24小时，直到进行PHX或假手术。这些动物被允许喝水并吃标准的老鼠饮食随意.
组织均质化
用于肝脏样品均质的缓冲液由20 mmol/L Tris组成，pH值为8。缓冲液中包括1%十二烷基硫酸钠、5mmol/L EDTA、3mmol/L EGTA、1mmol/L DTT、E-64（0.01 mg/mL）、胃蛋白酶抑制素A（0.01 mg/mL）、亮氨酸肽（0.01 mg/mL）、抑肽酶（0.02 mg/mL）和AEBSF（0.05 mg/mL）。匀浆中使用的缓冲液与组织的比率始终为0.2 mg肝组织与2 mL匀浆缓冲液。使用Polytron均质机（纽约州韦斯特伯里Brinkman）在冰上以10000 rpm的速度均质组织1至1.5分钟。然后在贝克曼J-90离心机（加利福尼亚州帕洛阿尔托）中以5000 rpm、4°C的转速旋转样品15分钟。立即等分上清液，并将其储存在−80°C下。
血浆液相色谱法和萃取
用含有AEBSF（0.2 mg/mL）的Tris缓冲盐水将固定体积（13 mL）的大鼠血浆（按说明制备）稀释2倍。然后将稀释后的血浆加载到含有0.5 mL肝素-琼脂糖的10-mL一次性柱上（Bio-Rad，Hercules，CA）。在将样品加载到柱上之前，用20 mL Tris缓冲盐水和1 mg/mL无蛋白酶白蛋白（德国曼海姆Boehringer Mannheim）对肝素-琼脂糖柱进行平衡。加载样品后，用3 mL Tris缓冲盐水（0.1 mg/mL AEBSF）清洗柱。用1.0 mL 1.2 mol/L NaCl溶液（0.1 mg/mL AEBSF）在1.5 mL试管中从柱中洗脱结合蛋白（Sardstedt，Newton，NC）。通过添加0.5 mL Tris缓冲盐水饱和苯酚从溶液中提取蛋白质。样品在台式离心机中旋转20秒并高速旋转1分钟。丢弃含有水部分的上相，并向剩余的酚层中添加1 mL乙醚（Mallinckrodt，Chesterfield，MO）。再次将样品涡旋20秒，并高速离心1分钟。上乙醚相被丢弃。重复添加和移除乙醚。36然后将样品冻干。
凝胶电泳
匀浆中的蛋白质浓度通过双钦酸技术测量。37将等量（300μg蛋白质）的匀浆提至均匀体积。向匀浆中添加由62 mmol/L Tris、2%十二烷基硫酸钠、10%甘油和0.14mmol/L溴酚蓝组成的相应体积的负载缓冲液。将来自血浆样品的柱状纯化蛋白重新悬浮在15μL Milli-Q水（Millipore，Bedford，MA）和15μL DTT负载缓冲液中。将样品加热至90°C 10分钟，并通过连续Tris-tricine凝胶电泳进行分析。38
免疫印迹法
在250 mA下将凝胶过夜转移到Immobilon-P膜（Millipore）中，转移缓冲液由50 mmol/L Tris-HCl、95 mmol/L-甘氨酸和0.005%十二烷基硫酸钠组成。转移后，将膜在含有5%脱脂奶粉的吸液缓冲液（吸液）中浸泡2小时。在pH值为7.5的条件下，印迹含有20 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、0.1%吐温20。用于检测HGF/SF重链和单链的一级抗体来自日本东京免疫学研究所。单克隆抗体以1:500的浓度在5%的印迹纸中使用。在一级抗体中在室温下培养2小时后，在1%的吸墨纸中清洗膜3次，共30分钟。然后将膜置于1%的印迹中，该印迹含有辣根过氧化物酶偶联的第二抗体（Chemicon，Temecula，CA），稀释度为1:50000。在室温下培养1小时后，用吸墨纸将膜清洗5次，共50分钟。然后将膜在增强化学发光试剂（皮尔斯、罗克福德、伊利诺伊州）中浸泡3分钟，并暴露于胶片（柯达、罗切斯特、纽约州）中进行显影。
HGF/SF碘离子
碘珠（皮尔斯，罗克福德，伊利诺伊州）是按照制造商的指示制备的。将2至5μg的HGF/SF放入装有100 mmol/L磷酸钠反应缓冲液（pH 6.8）和0.5 mCi碘化钠（Amersham，Arlington Heights，IL）的管中，最终体积为100μL。反应进行8分钟，并通过从碘珠中去除反应溶液而停止。通过添加酪氨酸至最终浓度5 mmol/L来去除多余的无活性碘。然后将反应混合物加载到5-mL G-25脱盐柱（Pierce，Rockford，IL）上，该脱盐柱之前在含有1 mg/mL无蛋白酶白蛋白和pH7.4的Tris缓冲盐水中平衡。如果标记的HGF/SF用于向啮齿动物注射，则使用的缓冲液是含有大鼠白蛋白（加州圣地亚哥Calbiochem）的磷酸盐缓冲盐水，1 mg/mL，pH 7.4。通过凝胶色谱法评估碘化HGF/SF，以确保HGF/SF保持完整。比活度通常为17000至25000 cpm/ng。
结果
PHX后再生肝脏中HGF/SF的存在形式
为了检测再生大鼠肝脏中HGF/SF的形式，从3组动物（3个单独的实验）中获取肝脏。每组包括接受PHX或假手术的动物。在每一组中，动物祭祀的时间点从手术后的0到72小时不等。样品通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行分析，其中一组的结果如所示.表示三组实验的平均结果。将scHGF/SF（非活性）和hcHGF/SF（活性）的积分光密度从至少3个单独的Western blot归一化到每个blot的零时间点。在正常肝脏中，存在两种形式的HGF/SF(，通道0），但大多数HGF/SF似乎处于非活性单链形式()和hcHGF/SF()保持相对稳定。在PHX后的第一个小时内，scHGF/SF水平相对于零时间点下降了55%(，车道0–60；)而假手术减少不超过10%(，0–60车道；). PHX后3至6小时，scHGF/SF水平开始增加，并在48小时内持续增加(，3–48车道）。PHX后72小时，PHX组动物的scHGF/SF水平与假手术组动物的水平相似。
全肝匀浆中内源性HGF/SF的Western blot。（A） 动物接受PHX或假手术。按照材料和方法中的描述，在指定的时间从相应的动物身上获取组织并进行均质化。用10%Tris-tricine PAGE分析不同时间点的300微克总肝匀浆。纯化的大鼠tcHGF/SF被用作hcHGF/SF的标准。如下图所示，肌动蛋白的Western印迹证实了载荷相等。在对三个单独的Western blot实验进行密度分析后，将给定时间点对应于scHGF/SF或hcHGF/SF的条带的积分光密度（IOD）归一化为来自同一blot的零时间点。数值表示为标准化平均值（IOD）±SEM。对假手术组和PHX组的scHGF/SF（B）或hcHGF/SF（C）进行了比较。
hcHGF/SF的出现表明蛋白水解活化的scHGF/SF。hcHGF/SF的水平相对于假手术动物有所下降，在60分钟时达到最低点(). 从60分钟开始，hcHGF/SF水平相对于假手术动物显著增加，并在PHX后72小时内保持升高().
PHX后预载放射性HGF/SF的去向
以前的研究表明，肝脏从血液中提取HGF/SF非常有效。我们利用这一特性来探索PHX后内源性HGF/SF的消耗。27,34经肠系膜下静脉将碘化scHGF/SF注入肝脏。这确保了肝脏而不是身体的其他部位将获得最大数量的标记HGF/SF。注射的scHGF/SF总量（800 ng）足以标记肝脏，但不被视为药物水平。39由于碘化蛋白伴随着少量游离碘（在I-125 HGF/SF给药后），在进行PHX之前，这些动物在正常的饲养条件下饲养24小时。这允许注射的scHGF/SF与门脉周围细胞外基质的平衡结合以及任何残余游离碘的排泄。使用I-125标记的人scHGF/SF、人tcHGF/SF或大鼠tcHGF/SF的初始实验均显示出类似的利用动力学（数据未显示）。这些实验中使用的标记人scHGF/SF的PAGE分析的代表性放射自显影图如所示超过85%的标记HGF/SF为非活性单链形式。在注射碘化HGF/SP后的20小时内，在PHX后0至3小时内采集肝脏，并通过测量碘相关放射性测定每个时间点肝组织中标记HGF/SF的量(). 使用一批标记的HGF/SF总是可以获得一组完整的时间点。由于使用了不同批次的标记人scHGF/SF，并且数据集是在不同的日期获得的，因此对于给定的数据集，所有数据集都被归一化为零时间点。绘制的值是给定时间点的标准化结果的平均值，误差条代表SEM(). PHX后，PHX组肝脏中HGF/SF相关放射性的数量下降速度快于相应的假动物().
PHX后预加载HGF/SF的命运。（A） 用10%Tris-tricine PAGE分析标记的HGF/SF样品（3 ng），用于标记大鼠肝脏。代表HGF/SF的条带被标记为scHGF/SF或hcHGF/SF。125在PHX前24小时将I-HGF/SF注入肠系膜静脉。在PHX或假手术后的指定时间，采集肝脏，并测定其比活性（cpm/μg）。针对每个实验集，将特定活动数据标准化为零时间点。（B） 数据代表3组实验动物肝脏的平均比活性±SEM
PHX后血液中HGF/SF的形态
先前的实验表明，PHX后血液中的HGF/SF增加。然而，导致PHX后这种升高的血液中HGF/SF的形式尚未明确确定。为了解决这个问题，对动物（每个时间点2只）进行PHX治疗。在指定的时间抽取血液，并按照材料和方法中的说明制备血浆。在0至3小时的每个时间点，将相同体积的血浆（13 mL）加载到肝素琼脂糖柱上。按照材料和方法所述洗脱、提取结合蛋白，然后冷冻干燥。样品通过10%Tris-tricine PAGE分离，并转移到聚二氟乙烯膜上。通过Western blotting观察膜。在任何时间点均未检测到scHGF/SF。PHX后2小时，hcHGF/SF可见，其水平在3小时内增加(). 使用由20ng纯化的大鼠tcHGF/SF组成的对照泳道来最终显示血浆样品中hcHGF/SF的正确位置。
PHX后血液中内源性HGF/SF的形式。按照材料和方法中的描述，在PHX和血浆制备完成后的指定时间从两只动物身上采集血液。将每个时间点总计13mL的血浆装载到肝素琼脂糖柱上。用1.2 mol/L NaCl洗脱结合蛋白，并按照材料和方法中的描述提取。然后在10%三嗪丙烯酰胺凝胶上对样品进行拆分，并将其吸光至聚二氟乙烯膜上。参考通道由纯化的大鼠tcHGF/SF组成，并标记hcHGF/SF。
讨论
本研究的目的是描述PHX后肝再生过程中HGF/SF的形式。我们的数据为肝脏再生与scHGF/SF生物转化为其活性形式tcHGF/SF之间的关系提供了新的信息。研究结果显示了两个不同的阶段，其特征是HGF/SF相关的变化。第一阶段（0到3小时）是消耗阶段。其特征是总肝匀浆中scHGF/SF和活性tcHGF/SF均下降。尽管人们预计scHGF/SF的减少将伴随着活性tcHGF/SF的相应增加，但在我们的实验中似乎并非如此。这可能反映了这样一个事实，即活性tcHGF/SF与其受体c-Met结合，随后被内化和破坏。这可以防止它在肝脏中积聚。一些研究支持这一结论。我们的实验室表明，PHX后，c-Met的酪氨酸磷酸化在PHX后5分钟即出现增加，在PHX之后60分钟达到峰值。31 体外检测c-Met代谢命运的实验表明，在与tcHGF/SF结合时，c-Met迅速内化并被泛素蛋白酶体降解途径破坏。40其他在体外研究放射性标记的tcHGF/SF的代谢命运的工作显示出类似的结果。tcHGF/SF迅速内化和降解。41
第二阶段是生产阶段（3至72小时）。其特点是scHGF/SF和活性tcHGF/SF水平增加。以前的研究，包括该实验室的工作，表明HGF/SF信使RNA（mRNA）的增加在PHX后3小时才可检测到，并在PHX之后12小时达到峰值。32,42这与我们在Western blot实验中观察到的结果密切相关。3小时后，scHGF/SF和tcHGF/SF的浓度相对于总肝匀浆中60分钟的时间点增加()与HGF/SF mRNA增加的动力学平行，32并支持HGF/SF正在进行新合成的概念。
由于HGF/SF转录物在PHX后的3小时时间点之前不可采收增加，因此在HGF/SF-相关变化的初始消费阶段，HGF/SF的来源必须来自先前存在的储存或来自先前存在HGF/SFmRNA库的HGF/SF.合成增加。由于两个原因，先前存在的RNA库不太可能产生HGF/SF。首先，正常肝脏的Northern blot分析表明，HGF/SF mRNA的数量几乎无法检测到。其次，相对于零时间点，scHGF/SF的量在前3小时内下降()这意味着现有的HGF/SF转录物没有新的合成。前面描述的HGF/SF mRNA的增加可以预测scHGF/SF水平在3小时后开始升高。在我们的Western blots中，这确实是scHGF/SF水平开始增加的时候。
在采用（hcHGF/SF）/（scHGF/SF）的比值（活化率）作为HGF/S因环境过程而活化的指标。该实验室的早期工作表明，在PHX后5分钟内可以检测到uPA活性（一种已知的HGF/SF激活剂）的增加。26虽然PHX后1分钟激活率出现短暂增加()，总的来说，在PHX后的前60分钟内，scHGF/SF和hcHGF/SF的量相对于零时间点平行下降(). 人们预计，scHGF/SF的下降将伴随着tcHGF/SF的相应增加。有几个原因可以解释为什么没有发生这种情况。首先，scHGF/SF可能确实被激活，但被释放到血液中，因此肝组织中hcHGF/SF的含量下降。其次，活性tcHGF/SF可能与HGF/SF受体c-met结合，从而受到细胞内降解。在3小时时间点之后，PHX和假手术动物之间的激活率出现显著差异。
内源性HGF/SF激活指数。比较PHX和半手术动物的hcHGF/SF与scHGF/SF的比值。激活指数是根据.
肝脏在清除血液中的HGF/SF方面非常有效。34为了确保放射性标记的HGF/SF能够平等地进入所有肺叶，通过供应门静脉的肠系膜静脉注射标记的HGF/SF。这使得标记的HGF/SF在血液进入肝脏之前的血管流动期间与血液达到平衡。PHX后第一小时内，肝脏中I-125 scHGF/SF的消失率是假手术动物的两倍以上。这表明PHX后最初一小时内消耗的HGF/SF部分来自肝脏蓄水池。在第一个小时后，PHX动物中HGF/SF的消失速度减慢，但仍比假手术动物中观察到的速度快一些。
活性tcHGF/SF在两个不同阶段的功能可能不同。早期的实验已经明确表明，经历PHX的大鼠血浆刺激肝细胞中的DNA合成。43,44最近的研究表明，PHX后6和12小时与正常大鼠血液的总血液交换显著抑制了早期肝再生。45尽管PHX后血浆中有多种因素升高（HGF/SF、去甲肾上腺素、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α等），但正常动物和PHX动物之间血液中的关键差异之一可能是PHX后血中HGF/SB的显著增加。该实验室先前的研究表明，c-Met酪氨酸磷酸化在PHX后60分钟达到峰值。31因此，从先前存在的储存物中动员的HGF/SF和/或血液中上升的HGF/SF必须对再生肝脏产生生物效应。在本研究中，我们表明，在消耗阶段（第一阶段），血浆中循环HGF/SF的唯一可检测形式是活性tcHGF/SF。未检测到非活性scHGF/SF。这一发现增强了PHX后循环活性tcHGF/SF对最终靶组织产生生物效应的可能性，最终靶组织已做好反应准备。46这与文献中先前的发现一致，在文献中39或大型47用胶原酶“启动”肝脏后，进入外周循环的活性tcHGF/SF数量能够刺激正常动物肝细胞中可测量数量的DNA合成。需要确定新合成的scHGF/SF和tcHGF/SF在第二阶段的作用。tcHGF/SF的长时间出现可能表明活性HGF/SF的加工过程发生了某种变化。升高的scHGF/SF和tcHGF/SF对于维持肝细胞在整个再生过程中的增殖和/或为其他对HGF/SP反应的肝细胞类型（内皮细胞、胆道上皮细胞等）提供有丝分裂、运动或形态发生刺激可能很重要。
