肝病学。作者手稿；PMC 2007年3月14日提供。
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尼姆斯：美国国立卫生研究院16116
大鼠肝再生调节生长过程中Wnt/β-连环蛋白途径的变化
,1 ,1 ,1 ,2和1
萨塔珊·蒙加
1宾夕法尼亚州匹兹堡医学院匹兹堡大学病理学系。
彼得·帕迪迪塔基斯
1宾夕法尼亚州匹兹堡医学院匹兹堡大学病理学系。
卡伦·穆尔
1宾夕法尼亚州匹兹堡医学院匹兹堡大学病理学系。
唐娜·比尔·斯托兹
2匹兹堡大学医学院细胞生物学和生理学，宾夕法尼亚州匹兹堡。
乔治·米哈洛普洛斯
1宾夕法尼亚州匹兹堡医学院匹兹堡大学病理学系。
1宾夕法尼亚州匹兹堡医学院匹兹堡大学病理学系。
2匹兹堡大学医学院细胞生物学和生理学，宾夕法尼亚州匹兹堡。
请将转载请求发送给：George K.Michalopoulos，医学博士，博士，匹兹堡大学病理学系教授兼主席，医学院，S410生物医学科学塔，200 Lothrop Street，Pittsburgh，PA 15261。电子邮件：ude.cmpu.xsm@kgsolopolahcim公司; 传真：412-648-9846。 摘要
wnt/β-catenin途径在胚胎发生和致癌过程中非常重要。β-连环蛋白与E-钙粘蛋白的相互作用已被证明在细胞间粘附中至关重要。我们使用蛋白质印迹分析、免疫沉淀研究和免疫荧光报告了70%肝部分切除后大鼠肝脏再生过程中wnt途径的新发现。我们发现wnt-1和β-catenin蛋白主要定位于肝细胞。部分肝切除术后，我们立即观察到β-catenin蛋白在最初5分钟内开始增加，并转移到细胞核。免疫沉淀研究表明，这种增加是β-连环蛋白降解减少（丝氨酸磷酸化β-连环素减少）的结果。我们观察到由腺瘤性息肉病大肠杆菌基因产物（APC）和丝氨酸磷酸化axin蛋白组成的β-catenin降解复合物在肝切除术后5分钟开始活化，导致其在这段时间后水平下降。通常，在肝再生过程中观察到的E-cadherin蛋白的数量变化与β-catenin的变化相反。此外，使用免疫沉淀法，我们观察到6小时后酪氨酸磷酸化β-连环蛋白水平升高。因此，在调控生长期间wnt途径的变化似乎紧密调节了细胞溶质β-catenin水平，可能有助于诱导细胞增殖和靶基因表达。此外，这些变化也可能是为了在肝脏再生过程中对结构重组的细胞-细胞粘附进行负面调节。
wnt信号通路及其组成成分已被证明在胚胎发生期间对指导细胞命运至关重要。1该途径还调节成人组织中的细胞增殖。2对该途径的适当调节对于细胞的正常生长和增殖至关重要。三,4该途径的异常与几种人类恶性肿瘤有关，包括但不限于结直肠癌、前列腺癌、肝细胞癌、肺癌、乳腺癌和黑色素瘤。5–14Wnt信号在细胞内主要由β-catenin水平调节，而β-catentin水平又通过泛素化在降解水平上调节。15它是该途径中的关键蛋白之一，其调控的解除与多种恶性肿瘤的分子发病机制有关。β-catenin基因的体细胞突变、其细胞重新分布和核聚积是通过组成性刺激细胞增殖而参与肿瘤发生和进展的少数事件。16,17
这种信号转导途径激活后，会出现不同的事件序列。分泌蛋白wnt与受体结合，通过低磷酸化使糖原合成酶激酶3β（GSK3β）失活18–20和通过未知机制激活蓬乱。2这导致β-catenin、腺瘤性息肉病大肠杆菌基因产物（APC）和axin的磷酸化降低。21,22Axin作为上述蛋白质组装的支架。23当该复合物经历低磷酸化时，β-连环蛋白不再结合并被释放。这种升高的β-连环蛋白单体形式与包括T细胞因子-4（TCF-4）、淋巴增强因子或穿山甲在内的蛋白质结合24–26转移到细胞核，在那里它们控制目标基因的转录，包括c-myc和cyclin-D1等。27,28在没有wnt信号的情况下，GSK3β、axin、APC和β-catenin在特定的丝氨酸和苏氨酸残基处被磷酸化。β-连环蛋白现在被呈现为β-转导的重复序列蛋白，用于泛素化和降解。2因此，APC和axin是降解β-catenin所需的两个重要调节蛋白。胞质内β-catenin水平的另一个调节机制是与细胞间粘附分子E-cadherin的胞内尾部相关。29,30此外，酪氨酸残基上β-连环蛋白的磷酸化已被证明对细胞间粘附具有负调节作用。31研究表明，这是一些肿瘤局部侵袭甚至转移的重要过渡事件。32,33
我们想研究正常大鼠肝脏及其调节生长过程中wnt的转导途径体内成年大鼠70%肝部分切除术后的肝再生包括启动剩余实质细胞的增殖，是研究信号分子和其他参与细胞增殖的因素的有用模型。34–36肝部分切除术后残留的肝脏在大约1周的时间内几乎完全恢复了失去的重量和功能。34,37–40细胞增殖在肝再生过程中很早就开始了，肝细胞在24小时达到峰值，随后是胆道上皮细胞在48小时，Kupffer细胞和星状细胞在72小时，正弦内皮细胞在96小时。37,41,42在肝脏再生的最初几分钟内，不需要新蛋白质合成的即时早期基因表达增加。在静止的肝脏中预先存在的2种主要转录因子复合物的激活已被证明是肝切除术后主要反应的一部分。核因子-κB、信号转导子和转录蛋白激活子-3的激活已被证明在肝再生过程中对一些即刻早期基因的诱导很重要。43,44这种诱导主要涉及Kupffer细胞和内皮细胞的信号传导，并依赖包括肿瘤坏死因子α和白细胞介素-6在内的细胞因子。45,46在肝脏再生过程中诱导细胞增殖的细胞因子非依赖性机制，包括再生肝脏的CCAAT增强子结合蛋白和磷酸酶-1，也已被定义。47
我们检测了再生肝脏中wnt信号通路成分的变化，并提供了证据，证明残肝中的成年肝细胞如何“激活”和“失活”该通路，以促进正常肝质量的恢复，同时保持生长在控制之下。我们发现这一途径在肝细胞中非常明显。我们推测，在早期再生过程中β-catenin稳态动力学的改变可能（至少部分）有助于激活该途径的一些已知靶基因，这些靶基因已被证明对肝脏再生至关重要。这些包括c-myc公司尿激酶受体（uPAR）和细胞周期蛋白D1。我们将此途径添加到肝再生的细胞因子非依赖性“启动机制”列表中。
材料和方法
动物与外科
根据匹兹堡大学医学院和国家卫生研究院动物使用和护理委员会的严格指导，雄性Fischer 344只大鼠被用于实验。如前所述，对三组动物进行70%的部分肝切除。48允许动物吃标准的鼠食和水随意，并在手术前维持12小时的明暗时间表。美托芬麻醉后，通过腹部中线切口进行70%的肝切除术（包括3个肝叶）。为了在1、5和15分钟的时间点采集残余肝脏，在取出所需的肝叶后，切口保持开放，并用用生理盐水浸透的无菌纱布覆盖伤口。在所有其他时间点，采用间断缝合法闭合伤口，直到在类似麻醉下收获剩余的肝叶。对于假手术，采用了类似的手术方法，但剑突是唯一切除的部分。收获肝脏后，立即在液氮中进行速冻。对于0时间点的肝脏，非操作动物的类似肺叶被切除并进行snap冷冻。所有冷冻组织在使用前均保存在−80°C的温度下。
β-连环蛋白RNA、cDNA探针的制备及Northern Blot分析
部分冷冻组织用于通过RNAzol B（德克萨斯州Friendswood的Tel Test）分离纯化的RNA。将20微克纯化RNA进行甲醛凝胶电泳，并转移到GeneScreen Plus膜（NEN生命科学，马萨诸塞州波士顿）中的10×柠檬酸钠溶液中。用正向引物（GCGCTCCCCTCAGATGGTC）和反向引物（ACGATGCCGGCTTGC）通过聚合酶链反应制备大鼠cDNA探针。扩增产物（0.5-kb）通过琼脂糖凝胶电泳进行分析，并使用TA克隆试剂盒（Invitrogen，Carlsbad，CA）切除并亚克隆条带。这个0.5 kb的插入物由大鼠β-catenin的独特cDNA序列（对应于核苷酸571–1079）组成，在生态R I消化。这是用来准备的32P（ICN，Costa Mesa，CA）标记cDNA探针（2×108cpm/μg）依据32P-dCTP和多质体DNA标记试剂盒（新泽西州皮斯卡塔韦市阿默沙姆）。在Expresshyb（Clontech，Palo Alto，CA）中预混合30分钟后，在含有变性探针的Expresshyb68°C下将膜杂交1小时。按照Expresshyb方案（Clontech）进行清洗，并在−80°C下将膜暴露于柯达X-omat胶片24小时。
全细胞裂解液的制备及不同细胞类型
通过将3组肝切除术和假手术中储存的0.4 g残余肝脏均匀化于约2.5 mL RIPA缓冲液（9.1 mmol/L二元酸磷酸钠、1.7 mmol/L-一元磷酸钠、150 mmol/L氯化钠、1%Nonide P-40、0.5%脱氧胆酸钠、0.1%十二烷基硫酸钠）中，制备整个裂解物【pH调节至7.4】）。除1 mmol/L乙二胺四乙酸、1 mmol/L原钒酸钠和0.2 mmol/L4–2-氨基乙基苯磺酰基氟化物（Sigma）外，还含有新鲜蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒（西格玛，密苏里州圣路易斯市）。70%肝部分切除和假手术后的残余肝脏在手术后的以下时间点采集：0、1、5、15、30、60分钟和3、6、12、18、24、48和72小时。以牛血清白蛋白为标准物，采用双氰尿酸蛋白质测定法测定裂解液中蛋白质的浓度。样品的浓度范围为25至40μg/μL。样品的等分样品在使用前保存在−80°C。
如前所述分离肝细胞和胆道上皮细胞，49在RIPA缓冲液中分离蛋白。如前所述，从成人肝脏中分离出内皮细胞和枯否细胞。50使用上述技术分离星形细胞。51,52上述每个细胞特异性蛋白裂解物的25微克用于Western blot。
凝胶电泳和Western印迹
所有实验均一式三份，结果中显示的数据代表了所有三组实验。根据目标蛋白的分子量，使用微型PROTEAN 3电泳模块组件（加州大力士Biorad），将细胞裂解液中200微克的蛋白质溶解在5%至15%的凝胶上。蛋白质在30 V和90 mA的转移缓冲液（25 mmol/L Tris[pH8.3]、192 mmol/L-甘氨酸、20%甲醇和0.025%十二烷基硫酸钠）中，使用微型转位电泳转移细胞（Biorad）在过夜电泳转移至固定化聚偏氟乙烯膜（Millipore，Bedford，mA）。用Tris缓冲盐水-Tween中的5%脱脂干速溶奶（5%牛奶印迹）封闭印迹1小时，并与5%牛奶印迹中的一级抗体在室温下孵育2小时或在4°C下孵育过夜。随后在1%牛奶印迹中洗涤2次，每次洗涤10分钟，并在室温下与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的第二抗体在1%牛奶印迹中孵育1小时。在Tris-buffered saltion–Tween中进行4次洗涤，每次洗涤10分钟后，将印迹置于新鲜的Super-Signal West Pico化学发光基底（皮尔斯，罗克福德，伊利诺伊州）上5分钟，并通过放射自显影术观察印迹。使用IgG洗脱缓冲液（Pierce）在室温下进行两次30分钟的洗涤，以剥离斑点以供再次使用。
使用NIH Image 1.58软件扫描放射自显影后，对斑点进行密度分析。从该分析中获得的积分光密度归一化为0时间点。使用KaleidaGraph软件（Synergy软件）以线性比例绘制肝切除后的时间曲线。这用于分析肝再生过程中wnt途径成分的变化。
主要抗体包括抗β-catenin（小鼠）、抗E-cadherin（兔子）、抗GSK3β（小鼠）和抗APC（兔子），使用时间为1:200（加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司）。抗-wnt-1和抗-TCF-4的剂量为4μg/mL（纽约州普莱西德湖Upstate Biotech）。以1:75000（加利福尼亚州特梅库拉Chemicon）的比例使用二级抗体，包括HRP结合的抗鼠和抗兔。
免疫沉淀
肝部分切除术后的时间点如下：0、1、5、30分钟和6、18和48小时。使用适当的对照IgG（正常山羊）和20μL蛋白A/G琼脂糖，在4°C（圣克鲁斯）下预分离400微克1毫升体积的裂解液（在蛋白酶和磷酸酶抑制剂存在下）30分钟至1小时。离心后获得的上清液（1000克)在4℃下与5μL（10μg）琼脂糖结合山羊抗β-连环蛋白抗体（Santa Cruz）孵育1小时或在4℃培养过夜。或者，上清液与7μL羊抗axin抗体（Santa Cruz）在4°C下通过端对端旋转培养1小时，然后再与20μL再悬浮蛋白A/G琼脂糖培养1小时或4°C培养过夜。通过离心法收集颗粒（1000克)用4°C的RIPA缓冲液清洗4次，每次5分钟。用十二烷基硫酸钠和新鲜β-巯基乙醇将微丸重新悬浮在等量的标准电泳负载缓冲液中，并煮沸5分钟。将20至30μL样品溶解在准备好的凝胶上，并按照前面所述进行转移。用于印迹的抗体包括1:500的抗磷酸丝氨酸（小鼠）（购自Sigma）和1:1000的抗磷酸酪氨酸（小鼠，购自肯塔基州列克星敦的Transduction Labs）。HRP结合的二级抗体已在本文的其他地方进行了描述。用IgG洗脱缓冲液（Pierce）在室温下用两次30分钟的洗涤液洗脱印迹，并用免疫沉淀用抗体重新进行磷酸化的化学计量分析。
对于化学计量分析，使用NIH Image 1.58软件扫描上述免疫印迹并进行密度测定。从该分析中获得的积分光密度归一化为0时间点。丝氨酸或酪氨酸磷酸化的化学计量学表示为从丝氨酸或酪氨酸和β-连环蛋白探针得到的积分光密度的比率，并使用KaleidaGraph软件（Synergy软件）进行图形绘制。
免疫荧光显微镜
对于正常定位研究，根据抗体在特定固定条件下的免疫反应性，以2种方式中的1种方式采集肝脏。对于β-catenin染色，肝部分切除术后不同时间点的肝脏立即在液氮中冷冻。为了进行E-钙粘蛋白定位，正常成年大鼠肝脏在用磷酸盐缓冲液（PBS）清除后灌流固定在2%多聚甲醛中。固定肝脏在4°C的PBS中的2.3 mol/L蔗糖中浸泡过夜，然后在液氮冷却的2-甲基戊烷中冷冻。肝脏在−80°C下保存，直至切片。在−18°C的温度下，在4μm处对肝脏进行切片，并将其粘贴到带电的Superfrost/Plus载玻片上（Fisher，Pittsburgh，PA）。组织在PBS中冲洗3次，在含有0.5%牛血清白蛋白、0.15%甘氨酸（PBG缓冲液）的PBS中清洗3次，并在室温下用20%非免疫山羊血清在PBG缓冲溶液中封闭30分钟。主要抗体包括抗β-catenin和抗E-cadherin（Santa Cruz）。分别以1:50和1:20的比例在PBG缓冲液中稀释，并在室温下将其加入切片中2小时。切片在PBG缓冲液中清洗5次，然后在室温下将荧光标记的二级抗体稀释在PBG缓冲器中1小时。本研究使用的二级抗体为山羊抗兔Cy3、山羊抗鼠Cy3（宾夕法尼亚州西格罗夫Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove）或Alexa 488（分子探针，尤金，or），稀释比例为1:3000（针对Cy3）或1:500（针对Alexa 498）。在PBG缓冲液中清洗组织3次，在PBS中清洗3次。在ddH中使用0.001%Hoechst染料（双苯甲酰亚胺）对细胞核进行复染2对于E-钙粘蛋白，O持续30秒。对于β-连环蛋白，在用山羊抗小鼠Alex 488染色后，Hoechstx染料用于正常肝脏，并用山羊抗小鼠Cy3染色Sytox Green核酸染色（分子探针）用于部分肝切除术。在PBS中以100nmol/L的浓度使用30秒。在PBS中清洗后，使用凝胶剂（23 g聚乙烯醇2000，50 mL甘油，0.1%叠氮化钠至100 mL PBS）盖住组织，并在尼康Eclipse荧光显微镜上观察。数字图像是在索尼CCD相机上使用Optimas图像采集软件和框架-纹理板获得的。拼贴是使用Adobe Photoshop 5.0软件准备的。
为了定量评估肝再生过程中β-catenin向肝细胞核的再分配，计算显示细胞核定位的肝细胞数量与相同区域中肝细胞总数的比率。仅对肝细胞形态清晰的细胞进行计数。细胞核显示出微弱的斑点，以及细胞核显示出剪切造成的损伤，均被排除在计数之外。这与HRP-结合抗体免疫组化所见的核染色很一致。每个部分共统计了3个字段。每个时间点使用了三个不同的部分。获得的平均值四舍五入为最接近的整数，代表再生过程中特定时间点显示β-连环蛋白核定位的细胞百分比。计算部分肝切除术后0、1、5、30分钟、6和48小时的切片。
结果
Wnt-1、β-连环蛋白和E-Cadherin在正常成年大鼠肝脏中的定位
为了开始研究肝再生中的这一途径，我们检查了wnt途径的一些成分在正常肝脏中的分布。从肝细胞和胆道上皮、星状细胞、内皮细胞和Kupffer细胞中分离的蛋白质通过Western blots进行检测，并用抗wnt-1和抗β-catenin抗体进行检测。肝细胞中可见Wnt-1蛋白(). 没有其他类型的细胞显示出任何可测量的wnt-1。β-连环蛋白主要见于肝细胞，部分见于Kupffer细胞().
Wnt-1、β-catenin和E-cadherin蛋白主要定位于成年大鼠肝脏的肝细胞中。（A） Western blot显示wnt-1存在于静息期成人肝脏的肝细胞中。（B） β-连环蛋白见于肝细胞和枯否细胞。（C） 免疫荧光染色显示β-catenin的定位(绿色)均匀分布在大鼠肝脏的膜和细胞质上（紧邻膜）。一些肝细胞显示细胞核定位(箭头).插入揭示了核定位，如黄色的按覆盖颜色(箭头)Cy3的(红色)β-catenin和Sytox-Green分别代表核。酒吧=10微米。（D） E-钙粘蛋白(红色)定位于膜(箭头)和正常大鼠肝脏中肝细胞的细胞质（紧邻膜）。酒吧=10微米。
我们还利用免疫荧光染色分析了肝细胞中β-连环蛋白和E-钙粘蛋白的定位。用丙酮和甲醇固定的四微米厚冷冻肝脏切片分别进行β-连环蛋白和E-cadherin免疫荧光染色。我们的研究结果表明，β-连环蛋白标记肝细胞膜和细胞质(). 少数肝细胞在肝细胞核中也表现出β-连环蛋白(，插图）。E-钙粘蛋白标记肝细胞膜(). 膜附近也有一些细胞质标记。因此，β-catenin和E-cadherin在肝细胞膜和紧邻膜的细胞质中共存。一些研究小组之前已经通过免疫沉淀研究和Western blots显示了β-catenin和E-cadherin细胞质结构域之间的联系。31–33
肝再生过程中β-连环蛋白初始增加后β-连环素降解增加
在部分肝切除术后1至5分钟观察到β-catenin蛋白增加(). 随后，整个肝脏裂解物中的含量降至正常水平以下。大约48小时后，β-catenin水平恢复到其生理状态。Sham对照组在肝再生过程中未显示β-catenin蛋白的任何定量变化(). 尽管在肝再生过程中，15分钟后β-catenin蛋白显著降低，但较长时间的印迹暴露显示β-catentin蛋白在整个肝再生过程存在（未显示）。其mRNA水平相对较低，与0时间点相当，直到6小时，此时mRNA表达增加。在部分肝切除术后48至72小时内保持这种增强(). 假对照组维持最低水平的β-连环蛋白在相应的时间段内表达(). 两个印迹均检测甘油醛-3-磷酸脱氢酶，以验证等负荷（未显示）。
70%肝部分切除术后肝再生过程中wnt信号通路成分的变化。（A） 部分肝切除术后1-5分钟β-catenin蛋白升高，15分钟后显著下降，直至48小时。假手术动物的胶片曝光时间没有明显变化。这个底部2个面板显示Northern blot分析。β增加-连环蛋白肝部分切除术后6小时至72小时可见表达。这个最低面板显示最小β-连环蛋白假手术中的表达。（B） 典型的蛋白质印迹显示wnt-1蛋白降低(上部频带在这个blot中，对应于45kd大小）在5分钟到12小时时，在18小时时恢复到正常水平。假手术动物没有变化。0时间点的最低APC蛋白水平在5分钟时开始增加，并在18小时前升高，然后在部分肝切除术后72小时逐渐降至几乎生理水平。假手术动物没有变化。GSK3β或TCF-4蛋白水平无明显变化。一种代表性的抗凝集素抗体探针Western blot证实了部分肝切除术和假样本后不同时间点的蛋白质负载量相等。
在肝再生过程中，整个肝裂解物中的Wnt-1蛋白在5到15分钟时降低，在大约18小时后恢复到正常生理水平(). 假对照组中wnt-1蛋白无定量变化(). 在整个肝脏裂解物中，在0时间点观察到非常少或没有APC蛋白。该蛋白质在5分钟时开始增加，并在15分钟至1小时时显著增加(). 在大约3到6小时时，其水平开始下降。第二个峰值出现在12到18小时，APC蛋白在24到72小时明显下降。尽管在30分钟到3小时内APC的蛋白水平有所下降，但在整个假肝中APC的最低蛋白水平基本保持不变(). 再生肝脏中GSK3β和TCF-4的蛋白水平没有明显变化(). 通过探测部分肝切除和假印迹的β-肌动蛋白，证实了蛋白质的负载量相等().
β-连环蛋白和Axin在特定丝氨酸残基上的磷酸化在再生早期降低，随后在后期显著增加
先前的研究表明，细胞质β-连环蛋白在其降解水平上受到调节。2wnt信号的减少导致丝氨酸残基上的β-catenin磷酸化，从而使其与APC和axin复合并通过泛素化降解。我们发现，在部分肝切除术后1到5分钟，β-catenin蛋白开始增加，随后该蛋白显著减少(). 在此期间，β-catenin的mRNA水平没有变化。为了确定β-连环蛋白减少的机制，我们研究了其在丝氨酸残基的磷酸化状态。用抗β-连环蛋白抗体免疫沉淀细胞裂解物，并用抗磷酸抗体印迹。具有代表性的免疫沉淀研究显示于在肝再生过程中，β-catenin蛋白的丝氨酸磷酸化在1分钟时降低，然后在5分钟后增加（上图）。假手术对照组在类似时间点β-catenin的丝氨酸磷酸化状态保持不变（下图）。为了对丝氨酸磷酸化进行化学计量分析，去除了β-catenin的印迹并重新验证（中间面板）。丝氨酸磷酸化β-连环蛋白减少了约0.25倍，这与在此期间总β-连环素蛋白升高相对应(). 随后，β-catenin的丝氨酸磷酸化增加了1.5倍，这与β-catentin蛋白水平开始下降的时间相一致。丝氨酸磷酸化的第二个峰值出现在6小时，与残余β-连环蛋白水平的进一步降低相匹配。因此，丝氨酸磷酸化的峰值对应于肝再生过程中β-连环蛋白的减少().
β-catenin和axin的丝氨酸磷酸化增加表明肝部分切除术5分钟后β-catentin降解途径激活。（A） 肝切除术后1分钟丝氨酸磷酸化明显减少，5分钟后丝氨酸磷酸化增加(胰头)与同一时间的假手术动物相比最下面的面板第（A）条。这个中间面板（A）的图显示了β-catenin的剥离肝切除术印迹。（B） β-catenin丝氨酸磷酸化的计量分析。还绘制了每个时间点的总β-连环蛋白。在肝切除术的第一分钟，丝氨酸磷酸化β-连环蛋白减少了0.25倍，相当于β-连环素蛋白增加了约2倍，在5分钟时继续增加2.5倍。随后β-catenin的丝氨酸磷酸化增加约1.5倍，随后蛋白质减少约70%。肝切除术后6小时出现丝氨酸磷酸化的第二个峰值，导致残留蛋白进一步减少。（C） 丝氨酸磷酸化axin在5分钟时明显增加(胰头)肝切除术后18小时。
axin在特定丝氨酸残基上的磷酸化对其与APC、β-连环蛋白和GSK3β的成功组装至关重要，因此对β-连环素蛋白的降解至关重要。为了确定肝切除术后5分钟wnt信号减少时，axin是否在肝脏丝氨酸残基处磷酸化，用抗axin抗体免疫沉淀细胞裂解物，并用抗磷丝氨酸抗体印迹。代表性印迹显示axin在1分钟时磷酸化降低，然后axin在5分钟时丝氨酸磷酸化显著增加。这与5分钟时wnt-1蛋白和15分钟时β-catenin的减少相一致(和). 这与残余肝脏部分肝切除5分钟后，随着APC蛋白和丝氨酸磷酸化axin增加，β-catenin破坏复合物激活相一致，导致β-catentin降解。
肝再生过程中β-连环蛋白核转运增加
我们想确定残余的β-catenin是否转移到细胞核，至少部分在肝再生期间的细胞增殖中发挥作用。我们使用免疫荧光技术探讨肝再生过程中β-连环蛋白核定位的任何增加。在部分肝切除术后0、1、5、30分钟、6和48小时的时间点，对残余肝脏的4微米厚冰冻切片进行β-catenin（红色）染色，并用Sytox Green标记细胞核(). 计算显示β-连环蛋白核定位的肝细胞数量（黄色核）与同一区域内肝细胞总数的比值，以显示肝再生过程中β-连环素蛋白的重新分布。未显示肝细胞形态或因剪切或切片导致细胞核不规则的细胞被排除在计数范围之外。所示的数据分析代表了所进行的几项免疫荧光研究。在正常成年大鼠肝脏中，只有不到1%的肝细胞（70个肝细胞中的0个）显示β-catenin的核定位(). 使用石蜡包埋肝脏切片和HRP结合抗体进行免疫组织化学再次证实了这一点，结果显示肝细胞中的核β-连环蛋白显示有丝分裂图（数据未显示）。肝切除术后1分钟约2%的肝细胞显示核β-连环蛋白（63例中的1例）(). 部分肝切除术后5分钟，β-catenin的核定位明显增加，100%肝细胞（68个肝细胞中的68个）表现为核定位(). 这伴随着4μm切片中β-catenin的细胞质染色明显减少，但膜染色与早期时间点相当。这种再分配维持在30分钟，约92%的肝细胞显示核β-连环蛋白（50/55），尽管此时肝细胞的膜标记进一步减少(). 肝再生6小时时，肝细胞核和膜染色的肝细胞水平也升高，约90%的肝细胞（63例中的56例）仍显示β-连环蛋白的核定位增加(). 在部分肝切除术后18小时，其仍高于正常值（数据未显示）。肝部分切除术后48小时，肝细胞中β-连环蛋白的分布似乎接近正常，约7%的细胞（59个中的4个）显示出核β-连环素(). 在这个阶段，它似乎更多地局限于肝细胞的膜和细胞质，尽管染色没有正常肝脏那么强烈。
免疫染色显示肝切除术后5分钟残余β-catenin的核移位增加（bar=10μm）。（A） β-连环蛋白(红色)在0时间点定位于膜和细胞质，靠近膜。只有少数肝细胞（<1%）显示黄色的显示β-catenin存在的细胞核(箭头). （B） β-连环蛋白在1分钟时显示出类似的定位。（C） 几乎所有的肝细胞在5分钟时都显示出β-连环蛋白的核定位(箭头). 膜染色完整，但细胞质染色减少。（D） 上述重新分配保持在30分钟(箭头). （E） β-连环蛋白的细胞核和膜标记在6小时时增加。这一阶段的大多数肝细胞核β-catenin阳性(箭头). （F） 48小时后，β-catenin的核染色明显减少。染色主要为膜质和细胞质，很少有肝细胞显示核β-连环蛋白(箭头).
肝再生过程中β-连环蛋白酪氨酸磷酸化和E-钙黏蛋白水平的相对变化
我们想研究肝再生过程中β-连环蛋白定量变化对E-cadherin水平的影响，因为它们密切相关。32我们还研究了酪氨酸残基上β-连环蛋白的磷酸化，因为这一事件有利于细胞间粘附的负调控。31
图中所示的3组不同动物的代表性印迹显示部分肝切除术后1分钟E-cadherin蛋白减少，5分钟后增加。在肝切除术后15分钟到1到3小时内，蛋白质水平最高（大大高于生理水平），然后在6小时及以上降至接近正常水平。假手术肝脏未显示任何数量变化（数据未显示）。
β-catenin和E-cadherin相互作用的调节有助于在肝再生过程中6小时或更长时间内负调控细胞-细胞粘附。（A） E-钙粘蛋白水平在1分钟时下降，然后在5分钟时增加。部分肝切除术后15分钟至6小时内，患者的血压明显升高，随后在12小时至48小时至72小时内逐渐下降。（B） 肝脏再生期间，酪氨酸磷酸化β-连环蛋白水平在6小时到48小时内增加，如上部面板. The下部面板（B）的图中显示了β-catenin在化学计量分析中的重现性。（C） 肝再生期间酪氨酸磷酸化的化学计量学。绘制每个时间点酪氨酸磷酸化与总β-连环蛋白的比率。6小时时增加了3倍，在48小时内仍保持不变。18小时时下降了一倍，但仍比0时间点高出约2倍。
部分肝切除术后6小时，酪氨酸磷酸化β-连环蛋白显著升高，如（上面板）。在肝切除术后18小时和48小时内，该水平一直升高。剥离印迹，并用抗β-连环蛋白抗体重新验证酪氨酸磷酸化的化学计量（下面板）。肝切除术后6小时，β-catenin的酪氨酸磷酸化增加了3倍，在肝切除术48小时也很明显(). 尽管在再生过程中的18小时内，酪氨酸磷酸化降低，但仍比0时间点高出约2倍。这一结果表明，在肝再生过程中，通过β-连环蛋白-E-钙粘蛋白复合物的分解，在6小时到48小时内，细胞间粘附受到负调控。
讨论
为了阐明肝再生过程中wnt信号通路的变化，重要的是研究该系统的一些关键成分在正常肝脏中的定位。我们特别感兴趣的是肝脏中哪些细胞类型表达wnt-1、β-catenin和E-cadherin。这对于研究肝再生过程中的任何再分配，尤其是β-catening的再分配也至关重要。我们的结果表明，正常静息成人肝细胞中wnt信号的基本水平。我们在肝细胞核中发现β-catenin，其有丝分裂图占肝细胞的比例不到1%。我们认为，正常肝细胞中wnt-1的元素水平可能是正常成人肝脏中负责正常静息肝脏中最小细胞增殖的信号通路之一。因此，信令主要处于“关闭”模式。此外，β-连环蛋白和E-钙粘蛋白之间的相互作用是导致细胞-细胞粘附的重要因素之一。肝部分切除术后的肝脏再生是研究wnt/β-catenin通路两个方面的理想模型，即增殖和粘附，我们观察到随着修复和恢复过程的进行，该通路发生了独特的变化。
肝部分切除术后的肝再生体内描述受控增长的模型。典型免疫印迹组中wnt信号通路成分定量变化的图示如下在肝脏再生的早期几分钟内，观察到β-catenin蛋白水平升高（约2.5倍），以应对部分肝切除术引起的损伤。β-catenin蛋白的降解需要在特定的丝氨酸和苏氨酸残基处磷酸化，并通过泛素-蛋白酶体途径进行降解，涉及由APC和axin组成的破坏性机制的激活。22,23β-catenin蛋白的最初增加是由于其丝氨酸磷酸化减少导致降解减少所致。因此，这归因于稳态动力学的改变，在稳态动力学中，降解途径因蛋白质磷酸化状态的改变而失活。如结果所示，β-catenin的基因表达直到肝部分切除术后6小时才改变。β-catenin蛋白的早期增加伴随着肝切除术5分钟后的显著下降。β-连环蛋白增加可能触发肝细胞的反应，激活其降解途径。肝再生中的这种反应包括APC蛋白水平的增加（约7倍）和丝氨酸磷酸化axin的增加，这在部分肝切除术后5分钟后很明显。如前所述，此时丝氨酸磷酸化β-连环蛋白也升高了约1.5倍。这些事件对于β-catenin的破坏是绝对必要的。此外，这些事件与肝切除术后5分钟观察到的wnt-1蛋白减少（减少0.5倍）相一致。此时wnt-1蛋白的定量减少是β-catenin降解增加的原因。这些事件不仅限制了β-catenin蛋白的增加，而且还维持了正常细胞功能所需的某种最低水平的蛋白质。这一观察结果与关于β-catenin降解机制的现有研究基本一致。4,21,24,53因此，wnt信号通路成分的所有上述有意义的变化揭示了在这个受调控的生长模型中自由、单体和功能性β-连环蛋白的严格调控。
肝再生过程中wnt信号通路的有意义变化和调节生长的工作假设。（A） 图示肝再生过程中wnt途径成分定量变化的图形分析。β-catenin蛋白最初增加2.5倍，随后几乎减少3倍。随着β-catenin降解途径的激活，wnt-1蛋白也减少了0.5倍。除丝氨酸磷酸化β-连环蛋白和axin升高外，APC蛋白增加了7倍。在这些事件中，TCF-4水平基本保持不变。该图还描述了E-cadherin和β-catenin蛋白之间的反向定量关系。β-catenin蛋白的初始增加与E-cadherin水平的降低相一致，随后随着β-catening的降低E-cadherin蛋白的增加。（B） 假设了一个受调控的增长模型。β-catenin水平改变对wnt途径的调节（β-catentin蛋白增加后wnt-1蛋白水平降低）有助于在该途径中形成反馈-抑制环。过量的β-catenin蛋白[1]可能激活该反馈回路，导致wnt-1蛋白水平下降[2]。这可能通过泛素化激活β-catenin的降解途径，从而限制和调节剩余β-catentin用于核转位的可用性[3]，以控制靶基因表达和细胞增殖。这种反馈抑制或检查点的异常可能导致增长放松管制。
另一个新的观察结果是β-catenin和E-cadherin蛋白的定量水平存在明显的反向关系。E-cadherin水平的降低与β-catenin蛋白的初始增加相一致。随后，在部分肝切除术5分钟后，随着β-catenin蛋白降解，E-cadherin水平升高约4倍。
在早期肝脏再生过程中，β-连环蛋白及其核转位的初始增加有利于其在细胞增殖启动中的作用。然而，这种增殖是通过下调该途径和激活β-连环蛋白的破坏性机制来仔细监测的，以检查或限制其过度水平，从而保持这种生长受到调节。其他工作人员已经显示，该途径的异常导致了一些肿瘤的分子发病机制中的生长失调，导致β-连环蛋白水平持续升高。2,17我们假设β-连环蛋白可能通过反馈抑制机制在调节生长环境（如肝脏再生）中调节自身水平(). 这种反馈-抑制回路似乎适用于wnt-1蛋白水平，β-catenin蛋白水平的任何增加通常通过wnt-1信号的减少来检查。在肝脏再生过程中，在启动靶基因表达和细胞增殖所需的β-连环蛋白蛋白的初始增加后，其蛋白水平的任何持续升高都由其降解途径的激活控制。该反馈回路中的畸变可能是β-catenin和wnt-1蛋白持续升高的原因，使β-catentin发出组成性信号，并导致几种癌症中的生长失调。2,17包括β-catenin转基因动物的产生在内的进一步研究正在进行中，以证实这一假设。
肝细胞中预先存在的2种转录因子的激活已被证明是70%肝部分切除术后肝再生启动机制的一部分。核因子-κB、信号转导子和转录蛋白激活子-3的核转位被证明与几个靶基因的表达增加有关，包括c-myc、c-fos、和6月2日，在再生的早期。43–46肝切除术后5分钟，肝细胞中残余β-catenin蛋白的核移位增加，可能表明其在启动或促进靶基因表达和细胞增殖中的重要性。尽管wnt-1蛋白水平在肝切除术后5分钟开始下降，但此时丝氨酸磷酸化β-catenin增加，可能是由于其化学动力学的差异。这一事件有利于β-catenin与GSK3β、APC和axin的分离及其核转位。
已经描述了wnt途径的几个靶基因。7,27,28,54其中一些靶基因，包括c-myc、uPAR和cyclin D1，已被证明在肝脏再生中发挥重要作用。36,55–57C-myc表达在肝再生过程中很早就开始增加，在肝部分切除术后1小时至3小时和12小时达到峰值，可能（至少部分）是由于在肝再生的这些时间点发现核β-catenin升高所致。尽管在部分肝切除术后1分钟即观察到uPAR蛋白升高，但在以后的时间点，核β-catenin增加对uPAR蛋白质水平的积极影响不能排除，无需进一步研究。同样，再生肝脏中cyclin D1的表达可能受β-catenin的控制。因此，核β-连环蛋白水平的增加可能在指导任何这些靶基因的表达中发挥作用，并且正在进行进一步的研究，以确定对肝脏再生重要的特定靶点。
在肝再生过程中，细胞松动、流动性和重组对肝重塑至关重要。以前有报道称，肝再生过程中细胞间粘附受到负面影响。58早在肝部分切除术后2至3小时，就有报道称肝粘连连接蛋白的变化，包括管状蛋白和α-肌动蛋白。59此外，我们实验室之前有一份关于基质金属蛋白酶-2和-7激活的报告，它们负责在部分肝切除术后6至12小时消化细胞外基质。60因此，在肝脏再生3小时后，细胞粘附的一般负调控被不同的机制所定义。我们目前的研究表明，β-连环蛋白和E-钙粘蛋白的解离是在6小时及以后的肝脏再生过程中负调节肝细胞粘附的重要因素之一。在肝再生过程中，β-catenin和E-cadherin蛋白的定量水平的反向关系的新观察非常明显。β-catenin蛋白的初始增加与E-cadherin水平的显著降低相一致，随着β-catening蛋白的减少，E-cadherin蛋白水平显著升高。这种相互关系可能是一种代偿性事件，在早期再生过程中仍能维持肝细胞之间的细胞间粘附。然而，在部分肝切除术后6小时，酪氨酸残基上的β-连环蛋白磷酸化消除了这种代偿作用，并成为肝细胞间接触丧失的主要因素，而肝细胞间的接触对残肝的重建和重新填充为正常功能和恢复的肝脏至关重要。
致谢
作者感谢Bryon E.Petersen博士对部分肝切除术的帮助。作者感谢Wendy Mars博士和Chandrashekar Gandhi博士为肝脏中不同类型细胞的分离蛋白提供了Western blot。作者还感谢Mark Ross在免疫荧光显微镜方面的出色协助。
缩写
- GSK3β
- 糖原合成酶激酶3β
- 自动功率控制
- 大肠腺瘤性息肉病基因产物
- TCF-4型
- T细胞因子4
- uPAR公司
- 尿激酶受体
- 人力资源计划
- 辣根过氧化物酶
- PBS公司
- 磷酸盐缓冲盐水
脚注
由NIH CA30241和NIH CA35373向G.K.M拨款支持。
工具书类
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