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EMBO J。2007年3月7日；26(5): 1257–1267.
2007年2月22日在线发布。 数字对象标识：10.1038/sj.emboj.7601596
预防性维修识别码：项目经理1817641
PMID：17318182

整合素介导的基质信号调节TNFα的细胞毒性

Chih-Chiun Chen先生,1,* 詹妮弗·杨,1,* 里卡多·蒙森,1 陈宁宇,1 维克托·托多罗维奇,1和莱斯特·F·刘1,一
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摘要

肿瘤坏死因子（TNF）家族的细胞因子调节炎症和免疫，该家族的一个子家族也能以依赖于环境的方式诱导细胞死亡。虽然TNFα对某些肿瘤细胞株具有细胞毒性，但只有当NFκB信号被阻断时，它才能诱导正常细胞凋亡。这里我们表明，基质细胞蛋白CCN1/CYR61可以在不干扰NFκB信号或从头开始蛋白质合成，导致原代人成纤维细胞快速凋亡。CCN1通过结合整合素α发挥作用v（v）β5, α6β1和syndecan-4，通过5-脂氧合酶和线粒体的Rac1依赖机制触发活性氧物种（ROS）的生成，导致凋亡所必需的JNK的双相激活。携带基因组的小鼠通讯录1基因座替换为凋亡缺陷基因通讯录1等位基因对TNFα诱导的细胞凋亡具有实质性抵抗力体内这些结果表明，CCN1可能作为TNFα细胞毒性的生理调节器，为TNFα介导的细胞死亡提供细胞外基质的背景线索。

关键词：CCN2、CCN3、CTGF、NADPH氧化酶、伤口愈合

介绍

肿瘤坏死因子（TNF）超家族包含至少19种细胞因子，这些细胞因子在调节免疫系统的发育和功能中发挥关键作用(洛克西雷等, 2001;阿加瓦尔，2003年;瓦詹特等, 2003;Hehlgans和Pfeffer，2005年). 该家族的一个亚群，尤其是TNFα和FasL，也可以诱导细胞死亡。虽然TNFα对某些肿瘤细胞株具有细胞毒性，但它不会触发正常细胞的凋亡，而是刺激正常成纤维细胞的增殖(苏加曼等, 1985;巴特盖等, 1995). 这种二分法在一定程度上是由于TNFα作为NFκB激活剂的效力，NF-κB是一种促炎症转录因子，通过激活促生存基因和抑制促凋亡基因来促进细胞存活。因此，尽管TNFα也能诱导凋亡信号，但其在培养的正常细胞中的细胞毒性完全依赖于NFκB信号或从头开始蛋白质合成(Karin和Lin，2002年;Varfolomeev和Ashkenazi，2004年). 也观察到这种依赖性体内：靶向性缺失编码NFκB p65亚单位RelA或NFκ）B活化激酶IKKβ的基因会导致大量肝细胞凋亡和胚胎死亡，这些表型会被进一步的TNFα或其受体基因消融所消除(Doi公司等, 1999;罗森菲尔德等, 2000;森夫特莱本等, 2001). TNFα诱导细胞凋亡的一个关键信号元件是JNK的强健和长时间激活，当NFκB被抑制时发生(沙功等, 2003;卡马塔等, 2005). 这些发现阐明了TNFα诱导细胞凋亡的机制，并表明TNFα的细胞毒性是高度相关的；然而，在生理环境中释放这种细胞毒性的特定信号尚不清楚。

CCN家族由六种分泌的基质细胞蛋白组成，它们调节不同的细胞过程(Lau和Lam，1999年;Bornstein和Sage，2002年;布里斯托克，2003;普朗克和佩巴尔，2003年). CCN1/CYR61、CCN2/CTGF和CCN3/Nov是血管生成诱导物体内.始终如一，通讯录1-无效小鼠因心血管缺陷导致胚胎死亡(钼等, 2002;莫和刘，2006)，而通讯录2-由于严重骨骼畸形和骨骼生长板中血管生成受损的继发后果是呼吸衰竭，缺陷小鼠是围产期致死小鼠(伊夫科维奇等, 2003). 为了与细胞外基质（ECM）蛋白的保守结构域保持结构同源性，CCN与整合素受体结合并通过其发挥作用(补充图1) (刘和林，2005). 因此，CCN1通过整合素α支持细胞粘附和在成纤维细胞中扩散6β1和细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPGs），而αv（v）β三介导活化内皮细胞中CCN1的促血管生成活性(陈等, 2000;卢等, 2002).

CCN蛋白的表达与血管生成和炎症的部位有关，例如在伤口愈合、关节炎、肿瘤和血管成形术或动脉粥样硬化损伤的血管中(刘和林，2005). 由于这些也是TNFα表达的位点，我们假设CCN和TNFα可能会协同诱导细胞反应，例如凋亡。值得注意的是，我们发现CCN可以在不干扰NFκB信号或从头开始蛋白质合成，从而使TNFα能够诱导正常皮肤成纤维细胞（HSF）快速凋亡。CCN1通过与整合素α直接结合来实现这一作用v（v）β5, α6β1和HSPG syndecan-4诱导高水平活性氧（ROS）积累，导致在TNFα诱导的初始快速瞬时JNK活化后JNK重新激活。这种新的机制推翻了NFκB的抗凋亡作用，实现了对凋亡至关重要的JNK的重新激活。此外，具有基因组的小鼠通讯录1基因座替换为凋亡缺陷基因通讯录1等位基因对TNFα诱导的细胞凋亡有显著抵抗作用体内这些结果表明，细胞外基质环境可以深刻调节TNFα的细胞毒性。我们认为，CCN蛋白和TNFα在炎症反应期间的动态表达允许它们在关键阶段相互作用，导致死亡受体、整合素和HSPG的组合激活所指定的特定细胞类型的凋亡。

结果

TNF公司α-诱导的成纤维细胞凋亡依赖于ECM

为了测试TNFα的细胞毒性是否可由ECM调节，将HSF粘附在不同ECM蛋白涂层的表面。CCN是支持细胞粘附和细胞扩散的基质细胞蛋白，并诱导粘附信号，包括FAK、paxillin和Rac的激活(陈等，2001年a;托多罗维奇等, 2005). TUNEL分析和DAPI染色显示，与TNFα（10 ng/ml）孵育4 h后，约20–40%粘附CCN1、CCN2或CCN3的细胞发生凋亡(图1A和B). 相比之下，粘附于纤维连接蛋白（FN）、层粘连蛋白（LN）、卵黄凝集素（VN）、I型胶原（Col.I）或纤维蛋白原（FBN）的细胞中，无论是否含有TNFα，细胞死亡率均小于3%。因此，CCN提供了一种独特的基质环境，使成纤维细胞中的TNFα具有细胞毒性，而成纤维细胞是一种仅由TNFα刺激增殖而非细胞死亡的细胞类型(苏加曼等, 1985). 众所周知，细胞与ECM蛋白的粘附可以诱导前生信号，我们测试了这一过程是否可以防止CCN依赖性凋亡。将可溶性CCN1和TNFα单独或联合添加到粘附于Col.I、FBN、FN、LN或VN的细胞中。在所有情况下，CCN1和TNFα共同诱导了>20%的细胞凋亡，而单独使用其中一种因子都会导致最小的细胞死亡(图1C). 因此，CCN1和TNFα胜过了细胞粘附这些ECM蛋白所产生的生存前信号。此外，在10%血清中培养2天以在血清剥夺前沉积内源性基质的细胞中，CCN1与TNFα合作以剂量依赖性方式诱导细胞死亡，在2μg/ml CCN1下观察到20%的细胞死亡(图1D).

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成纤维细胞粘附CCN蛋白使TNFα诱导凋亡。原发性HSF按所述进行治疗，如有指示，暴露于CCN1和/或TNFα4.5小时。凋亡细胞被记为浓缩细胞核。(A类)在无血清培养基中，将HSF粘附在涂有纯化CCN1、CCN2、CCN3或FN的玻璃盖玻片上，并用TNFα或载体处理（对照）。细胞进行TUNEL分析并用DAPI进行复染以评估凋亡。(B类)对（A）中处理的细胞中凋亡细胞核的百分比进行量化，包括粘附在FN、LN、VN、Col.I和FBN上的细胞核(C类)用可溶性CCN1和/或TNFα处理粘附在基质基质上的细胞，并对细胞凋亡进行评分。(D类)HSF在含有10%FBS的培养基中培养2天，以允许内源性ECM沉积。在血清饥饿后，用不同浓度的CCN1处理细胞，如有或无TNFα所示。在整个研究中，所有条形图均显示了三次测定平均值的标准偏差。本研究中的每个实验重复至少三次，结果相似；给出了一个具有代表性的实验。

已知TNFα与其受体TNFRI的连接可激活caspase-8和-10，启动子caspase具有类似活性，可通过直接激活caspase-3激活外源性凋亡途径(费希尔等, 2005). 根据细胞类型，线粒体通过细胞色素放大半胱氨酸天冬氨酸酶激活c（c）caspase-9的释放和激活可能是细胞死亡所必需的(瓦詹特等, 2003). 在CCN1/TNFα处理的细胞中，Caspase-3、-8、-9和-10均被激活，Caspase-3、-9或-10抑制剂可有效阻止细胞凋亡(补充图2和3A). 这些结果证实了细胞死亡的凋亡性质，并表明受体介导的死亡信号通过细胞色素被放大c（c）释放，由促凋亡Bcl2家族蛋白如Bax介导的过程(科里和亚当斯，2002年). 事实上，凋亡需要启动子caspase、Bax活化和细胞色素的激活c（c）在CCN1/TNFα处理的细胞中观察到释放(补充图3B). 而caspase-10抑制剂阻断了人成纤维细胞的凋亡，caspase-8抑制剂或siRNA对caspase-8的敲除没有任何作用；然而，胱天蛋白酶-8抑制剂阻断了CCN1/TNFα诱导的小鼠成纤维细胞凋亡，而成纤维细胞缺乏胱天蛋白酶-10(补充图3C和D).

介导CCN1/TNF的受体α-诱导细胞凋亡

TNFα与TNFα1型（TNFR1）和2型受体（TNFR2）结合。TNFR1在其细胞质尾部包含一个死亡结构域（DD），该结构域招募适配器TRADD和FADD来激活蛋白酶-8和-10，而TNFR2缺乏DD，其在凋亡中的作用似乎是辅助的(瓦詹特等, 2003). 一贯地，用抗肿瘤坏死因子受体1单克隆抗体（mAb）预先培养细胞可有效阻止细胞凋亡(图2A). TNFR2优先被膜结合形式的TNFα激活，在当前实验条件下不起作用(图2A) (格雷尔等, 1995).

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CCN1/TNFα诱导细胞凋亡所需的受体。原发性HSF接受如下所述的各种治疗，然后用可溶性CCN1、TNFα或两者治疗4.5小时，然后进行凋亡评分。(A类)在用CCN1和TNFα治疗前，用中和TNFRI、TNFRII的100μg/ml单克隆抗体或抗syndecan-4多克隆抗体（100μg/ml）或正常兔IgG预先培养HSF 30分钟。(B类)在用CCN1和/或TNFα治疗之前，用各种抑制性单克隆抗体（50μg/ml）培养细胞。使用的抗体包括GoH3（抗整合素α6)，P5D2（抗β1)，LM609（抗αv（v）β三)，P1F6（抗αv（v）β5)和正常小鼠IgG。(C类)用CCN1或突变株DM、TM或D125A（各4μg/ml），或DM和D125A的联合治疗HSF，无论是否有TNFα。

CCN蛋白是整合素的配体，其功能是作为ECM蛋白的受体并调节多种细胞过程(海恩斯，2002). 在成纤维细胞中，CCN1与α结合并通过α发挥作用6β1-热休克蛋白，αv（v）β5、和αv（v）β三，分别介导促进细胞粘附、迁移和增殖(格列兹基维奇等, 2001). 抗α的抑制性单克隆抗体v（v）β5（P1F6）显著阻止细胞凋亡，而抗αv（v）β三单抗（LM609）的作用最小(图2B). 因此，αv（v）β5对CCN1/TNFα介导的凋亡至关重要，αv（v）β三作用相对较小。此外，抗α单克隆抗体6（GoH3）或β1（P5D2）均能消除CCN1/TNFα诱导的细胞凋亡(图2B)，表明α参与6β1可溶性肝素的存在或用肝素酶处理细胞也能消除细胞凋亡（数据未显示），符合细胞表面HSPG的要求。在成纤维细胞中表达的HSPG中，syndecan-4与整合素在局部黏附中共同定位，并促进细胞黏附和扩散(伍兹和考奇曼，2001年). 成纤维细胞与抗syndecan-4抗体的预孵育消除了细胞凋亡，而对照IgG没有影响(图2A)，表明辛迪加-4是CCN1/TNFα诱导的细胞毒性的关键细胞表面HSPG。这些结果表明整合素α的参与v（v）β5, α6β1和syndecan-4在CCN1/TNFα诱导的细胞凋亡中的作用。

我们之前已经确定了整合素α的CCN1-结合位点v（v）, α6β1和HSPG，并在这些位点中产生破坏的全长突变蛋白(补充图1). 其中包括DM（中断两个α6β1-域IV中的HSPG结合位点和TM（DM的联合突变和α的T1结合位点6β1在结构域III中），其在α中有缺陷6β1-HSPG依赖性活动，但在αv（v）β三-介导函数(卢等, 2004). DM和TM完全不能用TNFα诱导细胞凋亡，这进一步证实了CCN1与α直接结合的结论6β1-HSPG对此活动至关重要(图2C). D125A，一种在αv（v）-结合位点，但保留所有α6β1-HSPG介导的功能(陈等, 2004)，凋亡活性也显著受损(图2C). 有趣的是，DM和D125A的结合重建了完全的凋亡活性。这些结果表明CCN1与αv（v）整合素与α6β1-HSPG对TNFα诱导细胞凋亡至关重要，但这两个受体系统不需要通过同一CCN1分子参与。

CCN1型/TNF型α诱导独立于从头合成蛋白或NF的细胞凋亡κB信号

TNFα激活NFκB，其诱导编码抗凋亡因子的基因转录，如抗氧化蛋白、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂和Bcl2家族抗凋亡成员。因此，封锁从头开始TNFα诱导细胞凋亡需要蛋白质合成或NFκB信号(Karin和Lin，2002年). 然而，CCN1单独或与TNFα联合使用均不影响蛋白质合成速率(图3A)用放线菌酮（CHX）处理细胞并没有减少CCN1和TNFα的凋亡作用(图3B). 此外，CCN1与TNFα联合使用诱导的凋亡指数（>25%）是CHX和TNFα的2倍以上（～12%）。因此，CCN1能使TNFα诱导比CHX更大程度的细胞死亡，而不需要从头开始蛋白质合成。为了测试CCN1是否调节NFκB信号传导，我们监测了CCN1处理的成纤维细胞中p65 NFκ）B的磷酸化和NF-κB依赖性转录。正如预期的那样，TNFα在15分钟内诱导了快速且显著的p65磷酸化(图3C)以及通过瞬时转染NFκB-荧光素酶报告构建物的细胞中的荧光素素酶活性判断，NF-κB依赖性转录增强了约6倍(图3D). CCN1单独或与TNFα联合对p65磷酸化或NFκB依赖性转录均无影响。总之，这些结果表明CCN1不能通过既定的阻断模式促进TNFα诱导的细胞凋亡从头开始蛋白质合成或NFκB信号传导，表明参与了一种不同的途径。

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CCN1/TNFα诱导的凋亡独立于NFκB信号转导，但完全依赖于ROS的积累和随后的双相JNK1/2激活。HSF接受所述的各种处理，并与CCN1、TNFα、CHX或所示的组合孵育。(A类)成纤维细胞在含有1μCi/ml35S-蛋氨酸与CCN1和/或TNFα共同作用4小时，并将合并放射性作为酸沉淀计数进行测量。CHX作为对照。(B类)HSF用CHX预孵育30分钟，然后用CCN1处理4小时，有或没有TNFα。DAPI染色后计数凋亡细胞。(C类)HSF与CCN1和/或TNFα孵育不同时间，细胞裂解物在SDS-PAGE上溶解，然后用NFκB-65的S536磷酸特异性抗体进行免疫印迹。去除印迹，并用抗总NFκB-65的抗体进行再验证。(D类)通过瞬时转染由NFκB反应序列驱动的荧光素酶报告子构建来评估NFκ的B依赖性转录(高田等, 2004). 转染细胞用CCN1和/或TNFα处理指定时间，并测定细胞裂解液中的荧光素酶活性。对照转染效率控制标准化活性。(E类)HSF预先用细胞渗透性JNK抑制肽（50μM）或SP600125（25μM）孵育30分钟，然后用CCN1和/或TNFα处理4小时，然后进行凋亡评分。如有指示，在CCN1/TNFα治疗3小时后添加JNK抑制剂。(F类)如图所示，用CCN1和/或TNFα处理HSF不同时间（10分钟至8小时），并用抗双磷酸化JNK1/2的抗体（T183/Y185）电泳和免疫印迹细胞裂解物。去除印迹，并用识别总JNK1/2的抗体进行再验证。(G公司)细胞预先用10 mM NAC或0.4 mM BHA孵育30 min，然后用CCN1和/或TNFα处理4 h，然后进行凋亡评分。(H（H）)用Nox1 siRNA转染细胞48小时以下调Nox1，或用Rac1抑制剂NSC23766（0.4 mM）、MK886（10μM）或鱼藤酮（10μM）预培养30分钟，然后用CCN1/TNFα治疗15分钟或5小时（见图5更多详细信息）。细胞裂解物在SDS-PAGE上溶解，并用双重磷酸化和总JNK1/2抗体进行免疫印迹。

CCN1/TNF需要ROS依赖的双相JNK激活α-诱导的细胞凋亡

由于活化JNK的MAPK磷酸酶（MKPs）的作用，TNFα激活JNK通常是温和和短暂的，这不足以引起细胞凋亡。当NFκB依赖性信号被抑制，因而抗氧化蛋白未被诱导时，TNFα诱导的活性氧维持在较高水平。这种高水平的活性氧反过来又通过半胱氨酸氧化使MKP活性部位失活，导致JNK激活延长，导致细胞死亡(沙功等, 2003;卡马塔等, 2005). 因此，我们测试了ROS积累和JNK激活是否对CCN1/TNFα诱导的细胞凋亡是必要的。用来自JIP-1的细胞通透性JNK抑制肽或SP600125（竞争性抑制ATP-JNK结合）预处理HSF，有效阻止CCN1/TNFα诱导的凋亡(图3E)，表示此流程需要JNK活动。正如预期的那样，TNFα在10分钟内迅速诱导T183和Y185处的JNK磷酸化达到最大值，治疗后1小时磷酸化降至背景无法检测的水平(图3F). 相比之下，CCN1本身并没有激活JNK，但在刺激后4-8小时，在TNFα的存在下，导致JNK激活的第二阶段，伴随着细胞死亡。值得注意的是，即使在CCN1/TNFα加入细胞后3 h，JNK抑制肽和SP600125也能有效阻止细胞凋亡(图3E). 这一结果表明，JNK激活的第一波在1h内达到峰值并下降到检测不到的水平，不足以诱导CCN1/TNFα诱导的细胞凋亡。相反，CCN1和TNFα联合诱导的第二波JNK激活对细胞死亡是必要的。活性氧清除剂丁基羟基茴香醚（BHA）和N个-乙酰半胱氨酸（NAC）均能完全阻断细胞凋亡(图3G)表明ROS可能对凋亡所必需的JNK激活至关重要。此外，BHA和NAC（数据未显示）以及对凋亡至关重要的ROS特定细胞来源的抑制剂（见下文）阻断了JNK激活的第二波，而不是第一波，即CCN1非依赖性激活(图3H). 因此，在CCN1/TNFα刺激后>4小时发生的JNK激活的第二阶段对凋亡和ROS都是必需的。

CCN1通过Rac1和5-脂氧合酶依赖机制诱导ROS积累

已知TNFα可诱导ROS积累，这对其细胞毒性至关重要(沙功等, 2003;沙基拜等, 2005). 令人惊讶的是，我们发现CCN1病毒本身也能诱导细胞内H水平的急剧增加2O（运行）2显著高于TNFα单独诱导的水平(图4A). 虽然TNFα信号转导减弱了CCN1诱导的ROS水平，但显然是通过NFκB诱导的抗氧化蛋白(沙功等, 2003;彭等, 2004)CCN1和TNFα共同诱导的ROS水平显著高于单独TNFα，尤其是在治疗后4 h，凋亡显著。即使在NFκB信号通路存在的情况下，CCN1诱导的ROS水平显然足以使凋亡所必需的JNK的ROS依赖性再激活(图3E-H). 整合素α抗体v（v）β5, α6，或syndecan-4都完全阻断了CCN1诱导的ROS积累，而针对α的抗体v（v）β三收效甚微(图4B)表明CCN1（αv（v）β5, α6β1和syndecan-4）诱导活性氧需要凋亡所必需的。一直以来，CCN1突变体结合α缺陷6β1-HSPG（DM和TM）或αv（v）整合素（D125A）不能诱导ROS或凋亡，而DM和D125A的联合可以重建ROS诱导和凋亡活性(图2C和​和4C4摄氏度).

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CCN1通过其凋亡受体诱导ROS。HSF在玻璃盖片上培养，并与CCN1和/或TNFα孵育，然后在加载H后通过荧光显微镜检测ROS2DCF-DA（PBS中为5μM）。每个样品拍摄十个随机选择的高功率场，每个细胞的平均荧光强度以任意单位表示。(A类)用CCN1和/或TNFα处理细胞不同时间。(B类)在用CCN1治疗2小时之前，用50μg/ml的以下抗体预先培养细胞（30分钟），并如上所述检测ROS积累：P1F6（抗αv（v）β5)，LM609（抗αv（v）β三)，GoH3（抗α6)、兔多克隆抗yndecan-4抗体和正常IgG作为对照。(C类)用野生型CCN1、DM、TM、D125A或DM和D125A的组合处理细胞2小时。

与凋亡相关的活性氧的主要细胞来源包括NADPH氧化酶（Nox）、5-脂氧合酶和线粒体。整合素介导的细胞粘附CCN1后在HSF中激活的小GTPase Rac1(陈等，2001年a)与Nox和5-脂氧合酶的激活以及成纤维细胞线粒体ROS的产生有关(沃纳和沃布，2002年;基亚鲁吉等, 2003;Hordijk，2006年). siRNA沉默Rac1可消除CCN1和TNFα诱导的ROS积累，并阻断CCN1/TNFα或TNFα在CHX存在下诱导的细胞凋亡(图5A和B). 同样，Rac1抑制剂NSC23766阻断Rac1与其鸟嘌呤交换因子的相互作用，也消除了CCN1依赖的ROS积累和凋亡，证实了Rac1对CCN1/TNFα和TNFα/CHX诱导的凋亡的需求(补充图4A、C). Nox1，gp91的同源物荧光粉/中性粒细胞中发现的Nox2在平滑肌细胞和成纤维细胞中表达(Hordijk，2006年) (图5F). 有趣的是，siRNA敲低Nox1仅部分抑制CCN1诱导的ROS积累，并没有阻断CCN1/TNFα诱导的细胞凋亡，但有效阻断了TNFα诱发的ROS生成和TNFα/CHX诱导的凋亡(图5A和B). 氮氧化物抑制剂apocynin也观察到类似的结果，它可以阻止氮氧化物酶复合物的组装(补充图4). 因此，Nox对CCN1诱导的ROS积累和CCN1/TNFα诱导的细胞凋亡是不必要的，但对TNFα/CHX诱导的ROS和细胞凋亡是必需的。相比之下，MK886阻断花生四烯酸转移蛋白FLAP向5-脂氧合酶传递底物，减少CCN1依赖的ROS积累和CCN1/TNFα诱导的凋亡，但不影响TNFα/CHX诱导的ROS或凋亡(图5C和D). 5-脂氧合酶抑制剂NDGA还阻断CCN1依赖的ROS生成和凋亡，进一步支持5-脂氧酶在这些过程中的作用(补充图4A和C). 活性氧的另一个重要来源是线粒体。鱼藤酮是一种细胞渗透性毒素，可阻断线粒体呼吸链复合物I中的电子传递，抑制CCN1/TNFα和TNFα诱导的依赖于CCN1-和TNF-α的ROS积累和凋亡(图5C和D). 线粒体复合物III抑制剂，包括斯的马特林和粘噻唑，也能阻断CCN1/TNFα和TNFα/CHX诱导的细胞凋亡(补充图4C和D). CCN1/TNFα诱导的活性氧是细胞死亡所必需的JNK激活的第二阶段所必需的，因为Rac1（NSC23766）、5-脂氧合酶（MK886）或线粒体复合物I（鱼藤酮）的抑制剂都阻断了JNK活化的第二个阶段，而Nox1-siRNA没有作用(图3H). 总之，这些结果表明，CCN1通过5-脂氧合酶和线粒体的Rac1依赖机制，通过TNFα诱导ROS积累、第二相JNK激活和随后的凋亡，而Nox1是不必要的。相反，TNFα/CHX诱导的细胞凋亡需要通过Nox1和线粒体产生ROS，但该系统不需要5-脂氧合酶。

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CCN1和TNFα通过不同的细胞来源诱导ROS积累，以及ROS对细胞凋亡的需求。用对照siRNA（四个无关序列的混合物）、Rac1 siRNA或Nox1 siRNA转染HSF，或用5-脂氧合酶抑制剂MK886（10μM）或线粒体复合物I抑制剂鱼藤酮（10μM）预处理HSF。然后，在ROS检测前用CCN1、CHX和/或TNFα孵育细胞1小时，或在凋亡检测前4.5小时。siRNAs和抑制剂对活性氧累积的影响(A类,C类)和凋亡(B类,D类)如图所示。用抗Rac1和β-肌动蛋白抗体免疫印迹总细胞裂解物显示Rac1与Nox1 siRNA在转染细胞中的作用(E类)或通过RNA印迹探测32P标记的人类Nox1（显示2.0 kb Nox1 mRNA）和GAPDH cDNA(F类).

Ccn1的等位基因替换与凋亡缺陷突变体钝化TNFα-介导的细胞凋亡体内

为了确定CCN1和TNFα之间的凋亡协同作用是否发生在生理环境中，我们构建了具有内源性通讯录1基因组位点替换为编码DM的突变等位基因(卢等, 2004)，一种CCN1突变体，在与TNFα的细胞凋亡协同作用中完全缺陷(图2C). 突变等位基因的敲入通过Southern blotting、PCR分析和诊断的存在得到确认速度I站点(图6A-C). 由于DM结合α有缺陷6β1-热休克蛋白(陈等, 2000)，MEF中产生的突变CCN1来自通讯录1分/分小鼠不能与肝素结合，而来自野生型同胞的CCN1与肝素具有高亲和力(图6D). 与胚胎致死性相比通讯录1-无鼠标(钼等, 2002),通讯录1分/分小鼠是活的、可繁殖的，并且没有表现出明显的异常，这表明通讯录1糖尿病等位基因具有生物活性，在发育过程中不会显著损害CCN1的功能。

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的生成通讯录1分/分小鼠和钝性TNFα介导的细胞凋亡体内. (A类)基因靶向结构取代了生态RI–圣诞节的I片段通讯录1带有cDNA编码通讯录1糖尿病.重组等位基因维持了通讯录1启动子和转录起始位点并表达通讯录1糖尿病保留5′和3′非翻译序列的cDNA。胸苷激酶（tk）和PGK-新作为ES细胞同源重组的选择性标记。B中，巴姆你好；X、，圣诞节我；R、，生态RI；S、，速度一、(B类)从野生型（WT）或通讯录1dm/Ccn1型小鼠（+/-）用速度我用一个巴姆HI（高）/生态RI片段，产生6.3（野生型）和5.7（靶向）kb条带，如（A）所示。(C类)从MEF中分离出总RNA，逆转录和通讯录1PCR扩增序列。这个通讯录1糖尿病cDNA包含工程诊断速度1个位点，在野生型序列中不存在。(D类)MEF来自通讯录1分/分对小鼠及其野生型同窝小鼠进行血清刺激，诱导CCN1的合成，同时标记35S-半胱氨酸。总细胞裂解物通过肝素-葡萄糖柱，并用含有不同浓度NaCl的缓冲液洗脱，如图所示。用抗CCN1抗体免疫沉淀洗脱的蛋白质，在SDS-PAGE上溶解并暴露于X射线胶片。(E类)尾静脉注射ConA（20 mg/kg体重），8 h后用TUNEL分析（罗丹明标记）分析肝细胞凋亡。在三个随机选择的字段中计算凋亡细胞的数量，并表示为cells/1mm2组织。（重量，n个=5;通讯录1分/分,n个=8;*P（P）<0.001). 组织切片如所示(F类). (G公司)皮下注射TNFα（每50μl 400 ng）可诱导细胞凋亡。8小时后，收集、处理注射部位的皮肤组织，并进行TUNEL分析。凋亡细胞数如上所示。（重量，n个=4;通讯录1分/分,n个=7;*P（P）<0.001). 组织切片如所示(H（H）)，放大倍数较高的视图如所示(J型). (我)ConA或PBS处理的WT或通讯录1分/分用抗8-OHdG抗体对小鼠进行染色。

TNFα介导的细胞凋亡的一种广泛使用且文献丰富的模型体内是指静脉注射伴刀豆球蛋白A（ConA），它会导致肝脏中的泛T细胞活化和自然杀伤T细胞依赖的TNFα合成，导致肝炎和TNFα依赖的肝细胞凋亡，这些可以通过抗TNFα抗体治疗或TNFR1和TNFR2基因消融来消除(特劳特温等, 1998;狼等, 2001). 值得注意的是，ConA诱导的细胞凋亡在通讯录1分/分与野生型小鼠相比，CCN1对ConA诱导的细胞凋亡很重要体内(图6E和F). ConA处理的野生型和突变型小鼠中浸润的CD3+T淋巴细胞数量相似，表明T细胞反应相似（数据未显示）。8-羟基-2′-脱氧鸟苷（8-OHdG）特异性抗体，一种氧化DNA损伤标记物(前田等, 2005)，检测到ConA诱导的WT小鼠肝脏的反应性水平远高于通讯录1分/分老鼠(图6I). 这些结果表明，CCN1是ConA治疗的肝脏中DNA氧化损伤的重要因素，并表明ConA治疗后肝细胞凋亡减少通讯录1分/分小鼠ROS生成受损相关。进一步证实CCN1可与TNFα协同作用体内皮下注射纯化可溶性TNFα后检测皮肤成纤维细胞凋亡(图6G、H和J). 细胞凋亡通讯录1分/分与野生型小鼠相比，小鼠也减少了60%以上。总之，这些结果表明，在表达凋亡缺陷型CCN1的小鼠中，TNFα介导的凋亡严重减弱，从而建立CCN1/TNFα协同作用作为重要的凋亡途径体内.

讨论

本研究揭示了TNFα和CCN基质细胞蛋白家族之间一种新的、意想不到的促凋亡协同作用。TNFα是炎症和免疫的重要调节因子，而CCN蛋白调节血管生成、基质重塑和损伤修复。由于TNFα的细胞毒性与环境有关，需要阻断NFκB信号体外，它是如何发生的体内没有被很好地理解。值得注意的是，CCNs可以揭开TNFα的细胞毒性，并将其从一种通常促进成纤维细胞增殖的细胞因子转化为一种诱导快速凋亡的细胞因子。这些结果表明，TNFα的细胞毒性可能受ECM微环境的调节，并确定CCN是TNFα细胞毒性的重要调节剂。

这项研究的一个惊人发现是，具有等位基因替换的小鼠通讯录1带有凋亡缺陷突变体(通讯录1糖尿病)对TNFα介导的细胞凋亡有显著抵抗作用，从而确立了CCN1/TNFα协同凋亡的生理意义。皮下注射TNFα后，ConA诱导的肝细胞凋亡和皮肤成纤维细胞死亡在通讯录1分/分老鼠(图6). IFN-γ已被证明通过抑制NFκB依赖性转录促进TNFα诱导的某些细胞系凋亡(苏克语等, 2001). 我们的结果提出了一个独特的范式，即基质蛋白CCN1通过整合素信号传导控制TNFα介导的凋亡，覆盖NFκB的抗凋亡作用而不抑制其转录活性。CCN蛋白和TNFα在组织损伤和炎症过程中受到动态调节(陈等，2001年1月;莫里等, 2002)，它们在关键阶段的共表达可能提供了环境背景，从而决定TNFα是以细胞类型依赖的方式作为促生细胞因子还是产生细胞因子。

从机制上讲，CCN1通过αv（v）β5, α6β1和syndecan-4，导致ROS的高水平积累，远远超过TNFα单独诱导的ROS积累(图4A). CCN1诱导的高水平ROS覆盖了NFκB的作用，导致JNK活化和凋亡(图3和​和5）。5). 然而，ROS积累就其本身而言不足以引起细胞凋亡，如H2O（运行）2在TNFα存在的情况下外源性添加会导致坏死细胞死亡而非凋亡（数据未显示），这表明活性氧的性质、质量和数量可能会影响生物学结果。虽然TNFα可以通过凋亡和坏死诱导细胞死亡(阿加瓦尔，2003年;瓦詹特等, 2003)CCN1/TNFα诱导的细胞死亡是通过凋亡机制发生的，我们通过流式细胞术和annexin-V和碘化丙啶染色（数据未显示），在暴露于CCN1/TNFα长达24小时的HSF中仅检测到最低程度的本底坏死。CCN1和TNFα通过涉及线粒体的Rac1依赖机制诱导ROS积累(沃纳和沃布，2002年) (图5). 然而，CCN1/TNFα诱导的ROS积累需要5-脂氧合酶，但Nox不是必需的，而CHX/TNFα诱导的ROS积累需要Nox而不是5-脂氧合酶，这突显了CCN1和TNFα导致ROS生成的独特机制(图5). 与TNFα/CHX相比，CCN1/TNFα诱导的ROS数量相当，但细胞死亡水平较高(图5)ROS细胞来源的这种差异可能有助于CCN1/TNFα诱导细胞凋亡的相对疗效。由于Nox和5-脂氧合酶分别位于质膜和核膜中，它们产生的ROS的亚细胞定位可能会影响它们在细胞凋亡中的作用(Fukai Ushio，2006年).

ROS在CCN1/TNFα诱导的细胞凋亡中的特殊作用似乎是JNK的重新激活(图3E-H)，这是TNFα细胞毒性所必需的(Varfolomeev和Ashkenazi，2004年) (图7). 已经观察到短暂和适度的JNK激活促进细胞增殖，而长期和强烈的JNK激活促进细胞死亡(卡马塔等, 2005). JNK已被证明通过诱导仅BH3蛋白Bid的切割和激活来介导细胞凋亡(邓等, 2003)或通过泛素连接酶ITCH的磷酸化促进半胱氨酸蛋白酶8/10激活抑制剂FLIP的降解(张等, 2006) (图7). 需要长时间激活JNK才能从预先存在的细胞内池和从头开始NFκB诱导的合成。然而，TNFα诱导短暂的JNK激活，但不足以诱导细胞凋亡(图3F)由于JNK被MKPs迅速灭活，其中一些由NFκB诱导。抑制NFκB导致ROS积累增加和JNK持续激活，因为NFκ的B诱导MKPs以及抗氧化蛋白，如Mn2+超氧化物歧化酶和铁蛋白重链。研究表明，活性氧的持续积累可以通过半胱氨酸氧化作用使MKP的活性部位失活，从而延长JNK的活化时间(卡马塔等, 2005). CCN1诱导的高水平ROS触发第二波JNK激活(图3H)从而绕过了抑制NFκB信号的需要，以实现凋亡所需的持续JNK激活。值得注意的是，TNFα刺激的NFκB p65缺乏的MEFs中的JNK激活也呈双相(沙功等, 2003)尽管JNK活化的两个波发生在更压缩的动力学中。

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CCN1/TNFα协同作用模型。通过CCN1的基质信号转导可以覆盖NFκB的抗凋亡作用，使TNFα诱导凋亡(图1,​,22和​和3）。三). 本文提供的数据支持CCN1与其受体（整合素α）结合的模型v（v）β5, α6β1和syndecan-4）导致依赖Rac1、5-脂氧合酶和线粒体的活性氧累积增加和延长，导致在TNFα存在下JNK的双相激活(图3,​,44和​和5）。5). 其他研究表明，活性氧使磷酸酶失活(卡马塔等, 2005)导致JNK持续激活，进而触发c-FLIP的降解(张等, 2006)通过TNFα依赖的细胞质复合物II激活caspases-8(Micheau和Tschopp，2003年). 通过Bax介导的细胞色素通过线粒体扩增caspases-8/10信号c（c）caspase-9和-3的释放和激活，导致细胞凋亡。

CCN在基质蛋白中与TNFα的凋亡协同作用是独一无二的(图1). 虽然ROS也是在整合素介导的细胞粘附FN时以Rac1依赖性方式生成的，但在这种情况下没有线粒体参与(基亚鲁吉等, 2003). 因此，CCN1诱导活性氧的产生与FN不同。对多种CCN1受体（αv（v）β5, α6β1，和syndecan-4）用于CCN1/TNFα诱导的ROS积累和凋亡，可能有助于相对精确地指定靶细胞，鉴定用于消除的特定细胞类型。例如，CCN1在内皮细胞中存活，即使存在TNFα也不会诱导细胞凋亡（数据未显示）。值得注意的是，CCN1和CCN2本身对特定细胞类型具有促生存或促凋亡作用，CCN1可以通过p53依赖机制诱导p21缺陷的Rat1a成纤维细胞凋亡，同时促进活化内皮细胞的存活(托多罗维奇等, 2005).

我们目前对CCN1如何与TNFα协同作用的理解总结于图7经检测，CCN2也通过ROS、JNK、caspases和与CCN1相同的受体发挥作用，表明其作用机制类似(补充图5). CCN和TNFα之间观察到的凋亡协同作用增加了这两个多功能蛋白家族的其他成员也可能合作的有趣可能性，并且它们的协同作用可能超越凋亡。CCN基质细胞蛋白可以提供决定TNFα细胞毒性的环境背景，以及基质环境可能深刻影响TNF细胞因子大家族的不同作用的可能性，显然值得进一步研究。

材料和方法

细胞培养

来自新生儿的原发性正常HSF来自美国型培养物收集，保存在含有10%胎牛血清（FBS；Hyclone）的Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM；Invitrogen）中，并在第6代之前使用。在使用含有0.1%BSA的IMDM进行实验之前，将细胞进行隔夜的血清饥饿处理。来自正常成年小鼠关节的初级滑膜成纤维细胞是John Varga博士（西北大学）慷慨捐赠的，并用Earl的平衡盐溶液、2 mM谷氨酰胺、，1 mM丙酮酸、0.1 mM非必需氨基酸和10%FBS。在第5代之前使用细胞。

蛋白质、试剂、抗体

利用昆虫细胞中的杆状病毒表达系统产生重组CCN1、CCN2和CCN3，并通过离子交换纯化(陈等，2001年1月)或免疫亲和力(卢等, 2004)色谱法。使用抗标记免疫亲和层析纯化DM和TM(卢等, 2004)而D125A是用镍提纯的2+列通过其组氨酸标记(陈等, 2004). 试剂供应商列于补充材料和方法在所有实验中，除非另有说明，否则CCN1的使用浓度为4μg/ml，TNFα的使用浓度是10 ng/ml，CHX的使用浓度则是10μg/ml。

细胞凋亡分析

对于DAPI染色，成纤维细胞培养在24孔板（105细胞/孔），血清饥饿并用凋亡诱导因子处理，然后在室温下用10%福尔马林固定过夜。清洗后，将细胞与1μg/ml的DAPI在PBS中孵育5分钟，每个孔添加2滴氟钼-g。使用荧光显微镜，对每孔10个随机选择的高倍视野（每视野约60个细胞）的凋亡细胞（浓缩细胞核）和非凋亡细胞进行计数。使用ApopTag Red检测试剂盒（Chemicon公司）按照制造商的方案进行TUNEL分析。安装前用DAPI对样品进行复染。

法国试验标准κB依赖性转录活性测定

核因子κB活性（pNFκB-Luc）和转染效率（pRL-CMV）的报告构建物来自Promega（威斯康星州麦迪逊），并按照供应商的描述使用Lipofectamine-2000（加利福尼亚州卡尔斯巴德Invitrogen Corp.）转染。荧光素酶活性用双荧光素素酶报告系统（Promega）测定。

ROS的测量

使用细胞渗透性染料H测定细胞内过氧化物2DCF-DA，在细胞内过氧化物/过氧化氢氧化后变为荧光(奥巴等, 1994). 对正常的HSF进行电镀（105每个孔的细胞）在24孔板中的玻璃盖玻片上，并在含有FBS的培养基中培养。然后，在如上所述的凋亡处理之前，将细胞在苯酚无红培养基中缺血过夜。对于使用阻断抗体的实验，在因子治疗之前，用50μg/ml抗体或对照正常IgG培养细胞30分钟。用含5μM H的PBS替换培养基2刺激后在指定时间进行DCF-DA，并在37°C下孵育10分钟。然后将盖玻片安装在载玻片上，并通过荧光显微镜成像。使用NIH的ImageJ软件对每种条件下随机选择的10个高功率场进行拍照，并测量积分密度（每种条件60–100个细胞）。

小干扰RNA

通过针对胱天蛋白酶-8、Rac1和Nox1的siRNA进行的基因沉默采用了已建立的序列和方案，如补充数据.

生成Ccn1分/分小鼠与细胞凋亡体内

带有通讯录1糖尿病突变(陈等, 2000)通过替换生态RI–圣诞节内源性I片段通讯录1基因组位点，包含转录起始位点、外显子I和外显子II的一半，带有包含通讯录1启动子，cDNA编码通讯录1糖尿病和选择标记PGK-Neo(图6A). 的5′和3′非翻译区通讯录1均保存在cDNA中。在svJ129 ES细胞中选择具有等位基因替换的重组体，并将其植入C57/BL6小鼠的囊胚中(钼等, 2002). 通过基因组印迹和PCR分析鉴定了种系嵌合体，并将其杂交产生通讯录1分/分老鼠(图6A-D). 通过尾静脉注射ConA（20 mg/kg体重）治疗小鼠，8小时后处死。用3.0%缓冲多聚甲醛固定肝脏，石蜡切片进行TUNEL分析，并用DAPI进行复染。TNFα诱导皮肤成纤维细胞凋亡(阿利卡尼等, 2004)每只小鼠皮下注射0.4μg可溶性TNFα50μl。8小时后，收集、处理组织，并如上所述进行TUNEL分析。

补充材料

补充材料和方法

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补充图1

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补充图2

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补充图3

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补充图4

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补充图5

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致谢

我们感谢John Varga赠送小鼠滑膜成纤维细胞，感谢GR Scott Budinger、V Juric和N Hay的有益讨论。JLY得到了NIH（T32 HL07829）和美国心脏协会的博士后研究金支持。VT得到了美国心脏协会的一项研究金的支持。这项工作得到了美国国家癌症研究所（CA46565）对LFL的资助。

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文章来自欧洲分子生物学组织由以下人员提供自然出版集团