PTEN通过降低细胞周期蛋白D1水平和核定位诱导细胞周期阻滞

细胞生长分析。

U-87 MG（American Type Culture Collection）和U-251 MG（T.J.Liu的礼物）胶质母细胞瘤细胞系、MCF7乳腺癌细胞系（A.Monteiro的礼物）和Bosc23细胞在含有10%胎牛血清（FCS）的Dulbecco改良Eagle培养基中生长。两种胶质母细胞瘤细胞系PTEN缺乏，但p53基因状态不同(15).

其他地方详细介绍了用于转染、两栖缺陷逆转录病毒逆转录病毒感染、PTEN蛋白稳定表达、细胞增殖和软琼脂集落分析的方案(11). 为了两种蛋白的稳定共表达，细胞同时感染来自Bosc23细胞的上清液混合物，这些上清液分别用编码各自蛋白的构建物转染。

为了获得PTEN的非渗漏诱导表达，双重感染CX的U-87细胞_n个/TR2和CX_b条R（TO）-PTEN稀释至10²细胞/ml，分布在100μl的选择培养基（每ml含1 mg新霉素和10μg急变菌素）中的96个平板中。通过每ml加1μg多西环素处理，扩增存活细胞集落并测试非泄漏诱导PTEN表达，然后进行细胞裂解和Western blot分析。如上所述，分离、扩增双重感染的U-251细胞的单细胞集落，并测试PTEN的非泄漏诱导表达。

蛋白质分析。

先前描述了含有50 mM HEPES（pH 7.5）、150 mM NaCl、10 mM EDTA、10%甘油和1%Triton X-100的缓冲液中的细胞裂解和Western blot分析(11). 对于细胞质和细胞核提取物，按照制造商的说明使用细胞核和细胞质提取试剂盒（Pierce）。所有裂解缓冲液均补充有1mM二硫苏糖醇、1mM苯甲基磺酰氟、21μg抑肽酶/ml、1mM原钒酸钠和0.1mM钼酸钠。

获得PTEN（A2B1）、Myc标记（9E10）、cyclin D1（M-20）、cylicn A（H432）、Rb（C15）、PARP（H-250）、HA标记（Y-11；圣克鲁斯生物技术）、p27Kip1（转导实验室）、β-肌动蛋白（AC74；Sigma）、磷酸-Rb-S807/S811、磷酸-Akt-S473和Akt/PKB（细胞信号转导）的抗体。

免疫荧光分析。

血清饥饿的U-87细胞（2×10⁴)镀在聚乙烯上-d日-含有10%或20%FCS的生长培养基中的赖氨酸涂层玻璃盖玻片（Becton Dickinson）。必要时，抑制剂LY 294002和雷帕霉素与FCS同时添加，浓度分别为10μM和20 nM。在不同的时间段后，如前所述，将细胞固定并染色(12). 使用的二级抗体是异硫氰酸荧光素结合的抗鼠抗体和四甲基罗丹明异硫氰酸酯结合的抗兔抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories）。

PTEN诱导对G的影响₁-至S期细胞周期进展。

通过使用PTEN诱导系统，我们接下来分析了参与从G₁细胞周期的S期（图。​（图2）。2). PTEN诱导的U-87细胞在G₀通过剥夺血清24～48h，随后用血清刺激同步重新进入细胞周期。在添加血清的同时，用多西环素处理细胞以诱导PTEN表达或不治疗。未经处理的细胞从G细胞进入细胞周期₀0 h至晚G的相位₁在血清刺激后36小时进入新的细胞周期（图。​（图2A）。2安培). 正如预期的那样，用多西环素处理PTEN表达的细胞在24小时或更长时间内没有进展到S期（图。​（图2A2安培).

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图2。

G的时间进程分析₁-PTEN诱导后的S期细胞周期调控因子。PTEN诱导的U-87细胞在G₀剥夺血清24小时后，在存在（+）或不存在（-）多西环素的情况下，允许10%FCS刺激（stim.）在指定的时间段内重新进入细胞周期，以诱导PTEN表达。（A） 通过碘化丙啶DNA染色制备等量细胞，用于FACS细胞周期分析。该表显示了G中单元格的百分比₀/G公司₁使用ModFitLT程序计算细胞周期分析。（B） 用PTEN、cyclin（Cyc）D1、phospho-Rb（P-Rb）、Rb、p27Kip1（Kip1）、cyclinA和actin抗体对等量细胞的总细胞裂解液进行Western blot分析。右侧显示了对不表达PTEN（白条）或表达PTEN的细胞（灰条）的密度分析，其cyclin D1、p27Kip1和cyclin a的表达水平归一化为肌动蛋白，磷酸化Rb的表达水平标准化为总Rb。使用ImageJ软件进行量化。所示数据是三个实验的平均值和标准偏差。注意表达PTEN的细胞中cyclin D1水平降低，p27Kip1水平升高。

在6 h（早期G₁阶段）和用于细胞周期分析的相同时间点（图。​（图2B）。2B型). 与正常细胞相比，细胞周期蛋白D1在G₀并且G显著增加₁(4)，在所测试的转化细胞系中，在G₀G期及其总表达水平适度增加₁阶段。PTEN诱导对cyclin D1表达水平有早期影响，从6小时开始下降，并在整个细胞周期中持续下降。在PTEN诱导的U-251细胞中也观察到PTEN表达下调cyclin D1的类似时间过程（数据未显示）。细胞周期蛋白D1减少对细胞周期蛋白D/CDK4复合物活性的影响是通过使用识别仅由细胞周期蛋白D/CDK4磷酸化而非由细胞周期素E或a/CDK2磷酸化的残基的磷酸化Rb特异性抗体测量细胞周期蛋白D/CDK4对Rb的磷酸化来评估的(38). Rb的磷酸化在晚期G强烈降低₁这表明，在表达PTEN的细胞中，cyclin D1水平的降低伴随着cyclin D/CDK4活性的强烈降低。正如预期的那样，PTEN对p27Kip1的水平有相反的影响，从G开始增加₁阶段。对G细胞周期蛋白E水平无影响₁观察到细胞周期的S期（数据未显示）。细胞周期蛋白A是S期转换过程中合成的最新细胞周期蛋白，在表达PTEN的细胞中减少，很可能是因为PTEN诱导的细胞周期缺乏进展。

PTEN的磷酸酶活性突变形式不降低cyclin D1的表达。

为了确定PTEN导致细胞周期蛋白D1表达减少的机制，我们首先分析了PTEN的酶活性要求。野生型PTEN和两种非活性突变形式PTEN-C124S和PTEN-G129E在U-87和U-251胶质母细胞瘤细胞中诱导表达。据报道，G129E突变仅使磷脂酰肌醇上的PTEN磷酸酶活性失活，C124S突变使磷脂多肽和磷脂酰肌酸底物上的活性失活(24). 将PTEN对细胞周期蛋白D1水平的影响与细胞周期相对细胞周期素D1水平影响相分离，从而排除PTEN通过PTEN诱导的细胞周期改变对细胞周期因子D1水平产生间接影响的可能性，实验是在PTEN诱导前至少24小时剥夺血清的细胞进行的。因此，细胞在G中同步₀在整个实验过程中，在血清剥夺的情况下维持相。在用U-87和U-251细胞系进行的此类实验中，虽然PTEN使细胞周期蛋白D1水平降低了两倍以上，但这两种突变形式的表达对细胞周期蛋白D1水平没有显著影响（图。​（图3A）。3A级). 为了进一步证实这一发现，该发现与最近公布的数据不一致(35)，时间进程实验类似于图。​图22对PTEN的两种磷酸酶失活突变形式同时进行。这两种突变形式表现相似，与PTEN相比，对细胞周期蛋白D1或Rb磷酸化没有影响（图。​（图3B）。第3页). 这些结果表明，PTEN对细胞周期蛋白D1表达水平的影响需要磷脂酰化。

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图3。

野生型PTEN和PTEN酶活性突变形式对细胞周期蛋白D1蛋白水平的影响。（A） 诱导的U-87和U-251细胞被血清饥饿36小时，然后在没有血清的情况下用强力霉素处理12小时，以诱导PTEN或酶活性G129E和C124S突变形式的表达。用所示抗体进行Western blot分析。该图显示了细胞周期蛋白（Cyc）D1水平归一化为相应肌动蛋白水平的密度分析，并表示为PTEN诱导（+）细胞与非诱导（−）细胞的比率。误差条表示三个实验的标准偏差。在U-87细胞中，PTEN与C124S或G129E突变形式的细胞周期蛋白D1比率之间存在显著差异（*）(P（P）<0.02和P（P）分别<0.01）和U-251细胞(P（P）<0.01）。U-87中的C124S和G129E突变型之间没有显著差异(P（P）=0.26）或U-251(P（P）=0.27）电池。这个P（P）值是通过使用成对的、单尾的t吨测试。（B） 酶活性G129E和C124S突变形式的细胞周期分析表明，细胞周期蛋白D1或磷酸化Rb水平没有改变。按照图的图例所述进行分析。​图2。2预计。，刺激。

为了进一步证实细胞周期蛋白D1水平降低的机制是基于抑制PI-3激酶活性，我们使用了PI3-激酶途径的药物抑制剂。LY 294002和LiCl特异性抑制PI-3激酶和糖原合成酶激酶-3（GSK-3）(30)分别为。如图所示，用抑制剂和强力霉素同时处理血清缺失的PTEN诱导的U-87细胞12小时（图。​（图4）。4). LY 294002模拟了PTEN的作用，降低了细胞中cyclin D1的表达，在浓度大于10μM时达到最大效果（图。​（图4）。4). 氯化锂对GSK-3的抑制部分恢复了PTEN表达细胞中细胞周期蛋白D1的水平（图。​（图4）。4). GSK-3是一种被Akt/PKB磷酸化和失活的激酶(7)磷酸化核细胞周期蛋白D1，促进其降解(8). 这些数据表明，PTEN表达细胞中细胞周期蛋白D1水平的降低是由于PI-3激酶途径受到抑制所致。

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图4。

PI-3激酶途径抑制剂对细胞周期蛋白（Cyc）D1表达的影响。如果没有其他标记，则用强力霉素诱导PTEN诱导的U-87细胞（血清剥夺36 h）12 h，同时用抑制剂LY 294002（LY）和LiCl以指定浓度处理。用所示抗体进行Western blot分析。底部的图表显示了细胞周期蛋白D1的肌动蛋白正常化水平。请注意，LY 294002抑制PI-3激酶后，细胞周期蛋白D1水平降低，LiCl抑制GSK-3后，PTEN表达细胞中降低的细胞周期蛋白D2水平部分恢复。

PTEN阻止细胞周期蛋白D1的核定位。

通过G的血清刺激重新进入细胞周期的正常细胞₀期，细胞周期蛋白D1定位于G区的细胞核₁并在细胞通过S期时退出细胞核(4). 为了确定PTEN对细胞周期蛋白D1核转位的影响，我们通过对PTEN诱导的U-87细胞的细胞质和核提取物进行Western blot分析，研究了细胞周期蛋白D1在细胞内的定位（图。​（图5）。5). 在不表达PTEN的细胞中，当细胞进入G₁血清刺激后6h时，cyclin D1在细胞核中的表达显著增加，而在细胞质中仅略有增加（图。​（图5，5，上图），导致核质比显著增加（图。​（图5，5，下图）。与正常细胞相比，在这些转化的细胞中，细胞周期蛋白D1在S期保留在细胞核中（图。​（图5）。5). 在同时用强力霉素处理以诱导PTEN表达的血清刺激细胞中，与未处理对照组相比，细胞质和核水平均降低（图。​（图5，5，上图）。在G早期₁然而，在PTEN表达的细胞中观察到核细胞周期蛋白D1的初始增加和相应的核质比增加，与不表达PTEN的细胞中出现的增加相似（图。​（图5，5，图表）。这种初始增加似乎没有影响PTEN在12小时时阻止Rb磷酸化的能力（图。​（图2B）2B型)这可能是由于6小时时PTEN表达水平较低，可能不足以阻止细胞周期蛋白D1的核积聚。从晚G开始₁在PTEN表达细胞的12小时时，细胞核/细胞质cyclin D1比率显著降低(P（P）<0.01），并保持在与G类似的低值₀整个细胞周期的数值（图。​（图5，5，下图）。这些数据表明，除了降低细胞质和细胞核中cyclin D1的表达水平外，PTEN还阻止了细胞周期蛋白D1在G₁-到S相转变。

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图5：。

PTEN可阻止细胞周期蛋白（Cyc）D1的核定位。PTEN诱导的U-87细胞周期蛋白D1亚细胞分布的Western blot分析。等体积的细胞核（N）和细胞质（C）提取物，来自按图图例所述处理的细胞。​图22用指示的抗体进行分析。由于在加载相同体积的提取物后，细胞质提取物中的蛋白质浓度是核提取物中的两倍，因此这里的数据低估了核细胞周期蛋白D1的两倍。在细胞质提取物中测量cyclin D1的表达强度，并将其归一化为细胞质肌动蛋白水平，在核提取物中测量的cyclin D2表达强度归一化至核PARP水平。标准化的细胞周期蛋白D1水平绘制在上图中（○和□分别表示非诱导和PTEN诱导细胞的细胞质值，以及•和▪ 分别表示非诱导细胞和PTEN诱导细胞的核值）。下图显示了非诱导细胞（空柱）和PTEN诱导细胞（填充柱）的细胞周期蛋白D1标准化水平的核质比。给出了三个实验的平均值和标准偏差。星号代表显著差异(P（P）<0.01）。叠加曲线显示了PTEN诱导细胞（黑钻石）中PTEN水平在时间过程中的归一化值。刺激。，刺激。

由于诱导系统中PTEN的水平太低，无法通过免疫荧光检测，我们在U-87细胞中稳定表达了PTEN和PTEN-H93A磷酸酶失活突变体。血清刺激G后10至12小时₀-同步细胞，在表达PTEN-H93A的细胞或不表达PTEN的细胞中，通过免疫荧光测定在细胞质和细胞核中检测到细胞周期蛋白D1（图。​（图6A）6A级)90%的细胞出现核染色（图。​（图6B）。6亿). 相反，在PTEN表达细胞中，核细胞周期蛋白D1的细胞百分比下降到约40%（图。​（图6）。6). 与PTEN相比，阈下浓度为10μM的LY 294002对细胞周期蛋白D1核分布的影响较小，而雷帕霉素对其无影响，雷帕霉素间接抑制p70 S6激酶，后者是一种被PI-3激酶激活的下游激酶，与蛋白质合成有关（图。​（图6B）。6亿). 两种药物都能有效诱导细胞周期阻滞，这是由对照实验中S期细胞周期蛋白A的核表达减少所确定的。

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图6。

PTEN可阻止细胞周期蛋白（Cyc）D1在稳定的PTEN表达细胞中的核定位。（A） 使用抗PTEN单克隆（绿色荧光）和抗D1多克隆（红色荧光）抗体对甲醛固定细胞进行免疫荧光，并对稳定表达野生型PTEN或H93A酶活性PTEN突变形式的U-87细胞进行核4′，6′-二氨基-2-苯吲哚（DAPI）染色。使用40倍物镜和尼康荧光显微镜拍摄图像。（B） LY 294002、雷帕霉素（RAP）和PTEN对细胞周期蛋白D1和A核定位的影响。用10%的FCS刺激稳定表达PTEN或PTEN H93A突变形式的血清饥饿细胞，并分别用指定的细胞周期蛋白D1或细胞周期蛋白A检测抑制剂处理。通过免疫荧光检测细胞周期蛋白D1和A，如图A所示。使用兔多克隆抗体检测细胞周期蛋白A。在表达野生型PTEN或H93A突变型PTEN的细胞总数中，呈现细胞周期蛋白核定位的细胞所占的百分比是从三个不同的区域对每个类别中超过150个细胞的平均值。

核持久性突变体cyclin D1拯救PTEN诱导的增殖抑制。

为了评估细胞周期蛋白D1的核定位在PTEN诱导生长抑制中的作用，我们分析了PTEN诱导的生长缺陷是否可以通过强制的细胞核定位来修复。细胞周期蛋白D1从细胞核输出到细胞质，然后被蛋白酶体降解，这取决于GSK-3β对Thr 286的磷酸化(8). 因此，据报道，GSK-3β磷酸化缺陷的T286A细胞周期蛋白D1突变型由于降解率较低而在细胞核中持续存在并在细胞中积累(8). 我们稳定地将PTEN与野生型细胞周期蛋白D1或T286A突变型共存，并评估细胞的增殖情况。细胞周期蛋白D1的T286A突变形式完全修复了PTEN表达细胞的增殖缺陷，同时对PTEN-H93A表达对照细胞的增殖有中度影响（图。​（图7A）。第7章). 正如预期的那样，T286A突变型细胞周期蛋白D1在PTEN表达细胞的细胞核中的积累明显多于过度表达的野生型细胞周期素D1（图。​（图7B），7亿)这表明，这种突变形式的核表达增加是所观察到的增殖拯救的主要机制。

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图7。

PTEN对细胞生长的抑制作用可通过共表达细胞核持久性T286A突变型细胞周期蛋白D1来克服。（A） PTEN诱导的增殖缺陷由T286A突变型细胞周期蛋白D1的表达补充。相同数量的U-87细胞双重感染PTEN或H93A突变型PTEN和pCX_第页对载体、野生型细胞周期蛋白D1（D1）或T286A突变型细胞周期素D1（T286A）进行双药选择。病毒感染的效率接近100%，在药物选择过程中基本上没有细胞死亡。药物选择完成后3天，用血细胞仪计数细胞，对细胞增殖进行评分。（B） 过度表达的T286A细胞周期蛋白D1突变体的核定位增加。在添加10%FCS的培养基中随机生长的细胞中，PTEN与野生型细胞周期蛋白D1（D1）或T286A突变型细胞周期素D1（T286A）共存的细胞核（N）和细胞质（C）提取物的细胞周期蛋白D 1抗体进行Western blot分析。过度表达（箭头）的细胞周期蛋白D1水平被量化并归一化为肌动蛋白和PARP的水平，如图图例所示。​图5，5，并且相应的细胞质和细胞核表达水平如图所示。（C） PTEN表达细胞的比例随着传代数的增加而降低，但当细胞与T286A突变型细胞周期蛋白D1共存时，PTEN表达的细胞比例保持不变。A组中描述的细胞经过连续传代（p），在用抗PTEN抗体进行细胞内染色后，通过FACS分析评估表达PTEN的细胞数量。在右边，PTEN表达细胞（箭头）表示两个细胞群，第一个共存的PTEN和pCX_第页载体和第二个共表达PTEN和T286A突变型细胞周期蛋白D1。左边的图表显示了PTEN表达细胞沿着所分析的六个细胞群体的传代的进化，以表达PTEN的细胞占细胞总数的百分比表示。这些实验重复了至少两次，结果相似。

为了进一步分析细胞周期蛋白D1在PTEN引起的生长抑制中的重要性，我们对在同一培养皿中生长的表达PTEN的细胞和不表达PTEN细胞之间的生长竞争进行了分析。U-87细胞一方面与PTEN或PTEN-H93A共感染，另一方面与pCX共感染_第页载体控制、野生型细胞周期蛋白D1或T286A突变型（图。​（图7C）。7摄氏度). 对于这六种组合，表达PTEN或PTEN-H93A的细胞数量通过荧光激活细胞分选仪（FACS）对连续传代细胞内PTEN表达进行分析来确定。感染含有野生型PTEN的逆转录病毒后，约70%的受感染细胞表达PTEN，尽管所有细胞都对药物选择有抵抗力。从最初的混合细胞群开始连续传代后，不表达PTEN的细胞过度生长，生长有利的PTEN表达细胞在传代6时减少到所有细胞的20%（图。​（图7C，7摄氏度图和左侧FACS图）。当PTEN与野生型细胞周期蛋白D1共表达时，表达PTEN的细胞数量减少，尽管没有PTEN与对照载体共表达时显著减少（图。​（图7C，7摄氏度，图）。相反，当T286A突变型细胞周期蛋白D1同时表达时，表达PTEN的细胞数量在细胞传代过程中表现出增加的趋势（图。​（图7C，7摄氏度图和右FACS图）。这些结果表明，细胞周期蛋白D1的核定位对于PTEN诱导的增殖控制是重要的。

我们感谢C.Sherr、N.Ahmed、T.Chen和P.Tsichlis慷慨提供试剂，感谢F.Cross批判性阅读手稿。

在这项工作的最初阶段，M.M.G.在纽约洛克菲勒大学进行，得到了加拿大医学研究委员会和国家癌症研究所（CA09673）的研究金支持。美国国立卫生研究院拨款RO1 GM57569部分支持A.R。