通过短期培养的血液单核细胞的细胞内细胞因子染色测定慢性疲劳和纤维肌痛综合征中炎性细胞因子的正常产生

摘要

简介

目前，不明原因疲劳和/或慢性疼痛患者的首选术语是慢性疲劳综合征（CFS）和纤维肌痛综合征（FMS）。为了达到FMS的标准，个人必须有慢性广泛疼痛和检查时出现的“压痛点”。目前对慢性疲劳综合征的定义是，患者表现出严重的持续性疲劳，没有明确的原因，并且存在以下八种症状中的四种：肌痛、关节痛、喉咙痛、软结、认知困难、头痛、运动后不适或睡眠障碍[1].

有一个重要的观点认为CFS和FMS是神经内分泌免疫功能障碍疾病谱的一部分[2]. 这些慢性广泛疲劳/疼痛综合征很可能是由自主中枢神经系统之间的相互作用引起的[三,4]，下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴[5–7]和免疫系统[8].

细胞因子被认为在CFS/FMS的发病机制和临床表现中发挥作用。具体来说，肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1和IL-6是炎症的重要调节器，也可能参与HPA和交感神经系统的调节[9]. 与对照组相比，循环细胞因子水平的调查没有显示CFS或FMS的变化[10,11]. 然而，关于培养细胞分泌的细胞因子水平的公开数据是相互矛盾的。事实上，研究报告显示[11–14]，正常[5,10]甚至减少[15]使用酶联免疫吸附试验（ELISA）或聚合酶链反应（PCR）在CFS/FMS患者外周血单个核细胞（PBMC）的刺激或非刺激培养上清液中产生炎性细胞因子。

利用CD14分析炎症和抗炎细胞因子产生的数量和质量⁺（单核细胞）和CD14⁻来自CFS/FMS患者的PBMC（主要是淋巴细胞），我们采用细胞内细胞因子染色和流式细胞术分析来促进单个细胞产生细胞因子的检测。这是该技术首次应用于CFS/FMS中细胞因子产生的分析。

材料和方法

结果

在流式细胞仪中对活PBMC进行电子门控，并通过CD14产生细胞因子⁺和CD14⁻在CFS/FMS患者和正常人中检测到细胞。初步实验表明，当细胞在含有brefeldin A的添加10%FCS的培养基中培养时，细胞内细胞因子阳性CD14的比例较高⁺患者和对照组均检测到细胞(表1). TNF-α和IL-1α的表达尤其如此，IL-6和IL-10的表达较低。在多粘菌素B存在下培养细胞可显著降低患者和对照组中细胞因子阳性细胞的比例和平均荧光强度（MIF），尤其是CD14中炎性细胞因子（IL-1α、TNF-α和IL-6）的产生⁺单核细胞群(表2). 用多粘菌素B培养6小时后，CD14产生的细胞因子阳性细胞和细胞内TNF-α、IL-1α和IL-6的中间百分比⁺正常对照组细胞数由43%（327）、31%（254）和3.1%（126）降至1.2%（77）、0.18%（122）和不可检测水平；患者组分别从44%（194）、44%（225）和2.5%（98）降至1.4%（76）、0.22%（146）和不可检测水平(表1和表2）然而，MIF和CD14的百分比⁺和CD14⁻当细胞在有或无多粘菌素B的情况下无刺激培养6小时时，患者和对照组的细胞因子生成细胞具有可比性(P（P）> 0·05)（表1–3).

用佛波酯醋酸酯和离子霉素（PMA/I）刺激导致严重的细胞死亡和CD14表达下调（数据未显示）。因此，选择了一种更具生理刺激作用的刺激因子，即hrIFN-γ。CD14产生炎性和抗炎性细胞因子综述⁺和CD14⁻CFS/FMS患者和对照组在多粘菌素B存在下用hrIFN-γ刺激6小时后的细胞如图所示表2和​和3，三分别为。患者和对照组的MIF和细胞内TNF-α和IL-1α生成单核细胞百分比在刺激6 h后显著增加(P（P）< 0·05) (表2). 然而，hrIFN-γ刺激仅显著增加CD14中TNF-α的生成，而不增加IL-1α的生成⁻患者和对照组的细胞(表3). 在刺激或非刺激CD14中均未检测到细胞内IL-6⁺患者和对照组细胞中存在多粘菌素B和CD14产生IL-6⁻细胞数量非常少(表2和表3). 检测CD14的IL-10反应⁺和CD14⁻细胞对hrIFN-γ的反应表明，CFS/FMS患者或对照组的细胞均无反应(P（P）> 0·05). MIF和细胞因子产生CD14的百分比⁺和CD14⁻患者和对照组在hrIFN-γ刺激条件下测得的所有细胞因子均具有可比性(P（P）> 0·05).

根据Chalder疲劳量表测量，细胞因子产生细胞的频率与患者组内的疲劳/疼痛严重程度或疾病影响之间没有显著相关性[20]、简短痛苦清单[21]以及工作和社会调整量表[22].

讨论

在本研究中，使用流式细胞术，在单个细胞水平上测定并比较CFS/FMS患者和健康对照组的细胞百分比和炎症和抗炎细胞因子的MIF。主要发现是MIF和CD14的百分比⁺（单核细胞）和CD14⁻当细胞在有或无hrIFN-γ刺激以及有或无多粘菌素B的情况下培养6小时时，患者和对照组的（淋巴细胞）细胞因子生成细胞具有可比性。

据推测，细胞因子的异常产生可能在CFS/FMS的发病机制中起作用。然而，一些研究报告了使用ELISA或PCR检测循环和培养上清液中某些细胞因子水平的相互矛盾的结果。赵等. [13]据报道，脂多糖刺激的慢性疲劳综合征患者外周血单个核细胞IL-1β、IL-6和TNF-α释放增加，但血清中没有增加与对照组受试者。相比之下，斯旺尼克等. [15]表明内毒素刺激体外CFS中TNF-α和IL-1β的产生显著降低；然而，循环细胞因子和体外产生IL-1α。古普塔等. [14]研究在存在或不存在LPS或植物血凝素（PHA）的情况下培养的粘附（单核细胞）和非粘附（淋巴细胞）单核细胞上清液中的细胞因子水平。CFS患者单核细胞和淋巴细胞自发产生的IL-6水平显著升高，而IL-10水平下降。此外，国家卫生研究所最近对13名FMS患者和8名健康对照者的报告显示，IL-6血清水平没有差异[5]. 最后，通过测量新喋呤的水平，未发现FMS患者单核细胞活化的迹象，而单核细胞激活是炎症细胞因子的主要来源[23].

尽管这些相互矛盾的发现可能是由于实验方法的差异（例如捕获抗体的差异或ELISA中血清衍生阻断剂的作用）或患者病情的差异造成的，但与PBMC培养上清相比，患者的循环中细胞因子水平始终正常。事实上，从培养的单核细胞在刺激或非刺激条件下产生的细胞因子水平得出的数据之间总是存在差异[10–12]. 总体而言，文献回顾表明体内CFS/FMS中的促炎细胞因子水平是正常的，但在某些情况下，这些患者的PBMC会产生这些细胞因子水平增加在体外这可能是与CFS/FMS影响PBMC的病理生理学相关的其他因素的结果，但在某种程度上仅在人工在体外文化环境。因为我们的协议很简单体外培养6小时后，我们发现CFS/FMS患者的PBMC产生的细胞因子水平正常，这并不奇怪，正如其他人对循环细胞因子的观察一样体内.

单核细胞/巨噬细胞是炎症细胞因子IL-1、IL-6和TNF-α的主要来源。我们发现，培养单核细胞超过6小时后，由于细胞凋亡，这些细胞的频率显著降低。因此，准确评估培养超过6小时的PBMC中细胞因子水平的增加或减少是非常困难的。

MIF和细胞内细胞因子阳性细胞（尤其是TNF-α和IL-1α）的百分比显著降低在患者和对照组的单核细胞中，多粘菌素B的存在表明LPS污染了培养物：尽管尽了一切努力确保细胞培养在无内毒素的条件下进行。然而，值得注意的是，极低浓度的LPS能够与单核细胞表面的CD14结合[24]在暴露后1分钟内，并在5分钟内内化。结合依赖于LPS结合蛋白的存在，LPS结合蛋白质是一种正常的血浆成分。因此，5~10分钟暴露于生理相关浓度的LPS足以触发单核细胞最大TNF-α释放[25]. 多粘菌素B是LPS介导激活的抑制剂，基本上消除了LPS与单核细胞的LPS结合蛋白和CD14依赖性结合。我们的数据表明，从我们的系统中完全去除LPS是不可能的，考虑到LPS对单核细胞的主要影响，在没有多粘菌素B的情况下培养单核细胞可能会导致假阳性细胞因子的产生。细胞内细胞因子染色技术的高度敏感性进一步放大了这一点，该技术能够检测单个细胞内极少量的细胞因子。

虽然一些CFS/FMS症状可能直接由炎症细胞因子引起[26]我们的研究表明，来自循环单核细胞或非单核细胞（淋巴细胞）的细胞因子的失调不是这些综合征发病的主导因素。然而，它并没有完全排除细胞因子在CFS/FMS发病机制中的作用，原因如下：体外或在体外研究不一定代表体内条件。其次，CFS/FMS患者的一些神经精神症状可能与组织内细胞因子产生紊乱更密切相关，例如中枢神经系统内的胶质细胞[27]而不是在循环中产生细胞因子。

致谢

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