美国国家科学院院刊。2007年2月27日；104（9）：3591–3596。
tau磷酸化通过稳定β-连环蛋白对抗凋亡，β-连环素是阿尔茨海默病神经退行性变的机制
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李红莲
*华中科技大学同济医学院病理生理学系，武汉430030；
王海红
*华中科技大学同济医学院病理生理学系，武汉430030；
刘世杰
†湖北省神经疾病重点实验室，武汉430030；和
燕秋登
†湖北省神经疾病重点实验室，武汉430030；和
张永杰
*华中科技大学同济医学院病理生理学系，武汉430030；
青田
*华中科技大学同济医学院病理生理学系，武汉430030；
王晓川
*华中科技大学同济医学院病理生理学系，武汉430030；
陈晓倩
*华中科技大学同济医学院病理生理学系，武汉430030；
杨莹
*华中科技大学同济医学院病理生理学系，武汉430030；
张嘉玉
*华中科技大学同济医学院病理生理学系，武汉430030；
Qun Wang（王群）
†湖北省神经疾病重点实验室，武汉430030；和
徐华西
‡加利福尼亚州拉霍亚伯纳姆医学研究所神经科学与衰老中心92037
弗朗西丝卡·冯·廖
‡加利福尼亚州拉霍拉市伯纳姆医学研究所神经科学与衰老中心，邮编92037
王建之
*华中科技大学同济医学院病理生理学系，武汉430030；
†湖北省神经疾病重点实验室，武汉430030；和
*华中科技大学同济医学院病理生理学系，武汉430030；
†湖北省神经疾病重点实验室，武汉430030；和
‡加利福尼亚州拉霍拉市伯纳姆医学研究所神经科学与衰老中心，邮编92037
英国牛津大学L.L.Iversen编辑，2007年1月3日批准
作者贡献：H.-L.L.、H.-H.W.和S-J.L.对本作品的贡献相等；J.-Z.W.设计研究；H.-L.L.、H.-H.W.、S.-J.L.、Y.-Q.D.、Y.-G.Z.、Q.T.、X.-C.W.，X.-Q.C.、Y.Y.、J.-Y.Z.，Q.W.和F.-F.L.进行了研究；H.-L.L.、H.-H.W.、S.-J.L.、H.X.、F.-F.L和J.-Z.W.分析数据；J.-Z.W.写了这篇论文。
以过度磷酸化tau积聚和神经原纤维缠结（NFT）形成为特征的慢性神经退行性变是阿尔茨海默病（AD）和相关tau病的标志性病变(1——4). 尽管神经退行性变的机制尚不明确，但研究表明，与AD相关的毒性刺激，如β淀粉样蛋白，会导致细胞死亡，表现为凋亡标记物上调，这一观点支持了神经元在神经退行过程中发生凋亡的观点(5,6). 然而，凋亡仅占AD脑中神经元丢失的一小部分(7); 大多数携带NFT的神经元发生慢性变性(8——13)而不是细胞凋亡，尽管它们不断暴露于细胞凋亡刺激，这表明存在使神经元逃避细胞凋亡的机制。
对死后AD大脑的研究表明，异常高磷酸化的tau是NFT的主要蛋白亚单位(1——4)这表明tau的过度磷酸化可能在导致神经元细胞沙漠化凋亡中发挥作用。Tau是一种微管相关蛋白。τ的主要功能是促进微管组装并保持微管的稳定性。tau过度磷酸化和积累在AD脑神经纤维变性发展中的作用(1——4)和相关的tau病(14)在过去的二十年里，人们进行了广泛的研究。最近，在tau转基因小鼠中已经证明，抑制突变tau表达可以改善记忆功能(15,16). 然而，tau丝的形成似乎具有神经保护作用(17,18). 到目前为止，关于tau磷酸化在决定神经元慢性变性与急性凋亡中的作用的直接证据仍然缺乏。
Tau磷酸化受蛋白激酶和蛋白磷酸酶的调节。糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）是参与阿尔茨海默样tau过度磷酸化的最重要的tau激酶之一(19——21). GSK-3β不仅磷酸化tau，而且磷酸化β-catenin；后者是一种参与Wnt信号传导的磷酸蛋白(22,23). 在Wnt途径中，GSK-3β对β-catenin的磷酸化促进其蛋白水解，而未磷酸化的β-catentin是稳定的，因此可以转移到细胞核中以促进细胞存活。tau和β-catenin磷酸化之间的关系目前尚不清楚。
在这项工作中，我们发现tau过度磷酸化通过稳定两种不同细胞系以及大鼠和tau转基因小鼠模型中的β-catenin使神经元抗凋亡。这些结果解释了为什么AD和相关τ蛋白病患者大脑中缠结的神经元不会因凋亡而死亡。
结果
过度表达Tau的细胞对凋亡刺激诱导的凋亡更具抵抗力。
为了研究tau在细胞活性中的作用，我们在小鼠神经母细胞瘤N2a（N2a/tau）和人类HEK293（HEK293/tau）细胞中稳定表达了最长形式的人类tau（tau441），其中最后一个细胞不表达内源性tau(A类). pcDNA（载体）稳定表达作为对照。然后，我们用凋亡诱导剂处理细胞。与未转染的N2a或HEK293细胞相比，在不同时间的staurosporine治疗后，表达高水平tau蛋白的细胞的凋亡程度要轻得多，如Annexin V-碘化丙啶（PI）染色所示(B类)然后用流式细胞术定量检测凋亡率( C类和D类). 表达高水平tau的细胞对喜树碱和H诱导的凋亡也表现出显著的抵抗力2O（运行）2( E–H（E–H）)与3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）测定的细胞活力显著增加[支持信息（SI）图6A–F]和乳酸脱氢酶测定(SI图6G–L). 为了消除通过选择稳定的细胞株而不是通过tau诱导细胞抗凋亡的可能性，我们将tau瞬时转染到N2a细胞中48 h，并用staurosporine处理细胞6 h，然后通过流式细胞仪测量凋亡率。我们观察到短暂转染tau也使细胞对凋亡更具抵抗力(SI图7). 这些结果表明，tau可能在细胞中发挥抗凋亡的作用。
过表达tau的细胞对凋亡刺激诱导的细胞凋亡更具抵抗力。(A类)人tau441（tau）或pcDNA（Vector）在小鼠神经母细胞瘤N2a和人胚胎肾HEK293细胞中稳定表达。用抗体R134d进行Western blotting检测总τ。Actin用作加载控件。(B类)如图所示，用1μM staurosporine处理未转染（Wt）或转染pcDNA（Vector）或人tau441（tau）的细胞0–24 h，并用Annexin V–PI染色测定凋亡细胞的数量。（比例尺，20μm）(C类,E类、和G公司)用1μM staurosporine或1μM喜树碱或250μM H处理N2a细胞2O（运行）20～24h，流式细胞仪检测细胞凋亡率进行定量。(D类,F类、和H（H）)用1μM staurosporine或1μM喜树碱或250μM H处理HEK293细胞2O（运行）2如图所示持续0–24小时，然后用流式细胞仪测量凋亡率以进行量化。*，P（P）< 0.05; ∗∗,P（P）<0.01接受治疗与未接受治疗的对照组；##，P（P）<0.01，在相同时间点，tau441转染与载体或野生型相比。
GSK-3β对Tau的过度磷酸化可挽救诱导的凋亡刺激和GSK-3β增强的细胞凋亡。
为了探讨tau磷酸化在上述抗凋亡中的作用，我们测量了tau的磷酸化状态和GSK-3的活性。在N2a细胞中，凋亡刺激诱导GSK-3激活(A类)以及伴随的血清tau过度磷酸化增加396–序列号404在tau过度表达的情况下被抗体PHF-1识别(B类)表明tau的抗凋亡作用涉及tau磷酸化和GSK-3。在两种GSK-3亚型中，GSK-3α和GSK-3β是AD病理中起作用的主要τ激酶(19). 为了进一步确定GSK-3β和tau磷酸化在抗凋亡中的作用，我们将GSK-3α-HA瞬时转染到N2a细胞中，并在其中稳定表达tau441或不稳定表达tau 441。GSK-3β-HA的表达(C类)GSK-3活性显著增加(D类)和强PHF-1τ阳性(E类)已由在体外 32P标记激酶分析和Western blotting。缺乏tau时GSK-3β的过度表达促进了staurosporine诱导的N2a细胞凋亡(F类)和HEK293(G公司)单元格。然而，在高水平外源性tau的存在下，GSK-3β的促凋亡作用被完全消除，细胞对staurosporine诱导的凋亡比对照细胞更具抵抗力( F类和G公司). 这些数据表明，tau磷酸化可能拯救staurosporine诱导的和GSK-3β增强的细胞凋亡。
tau的过度磷酸化抑制凋亡刺激诱导的凋亡。(A类)GSK-3活性通过32以磷酸GS肽2为底物的P标记分析(42)并在用1μM staurosporine处理0–24小时的N2a细胞中表达为相对水平*，P（P）< 0.05; ∗∗,P（P）<0.01，与0h时的矢量（平均值±SD，n个= 5). (B类)用R134d（总τ）和PHF-1（Ser396–序列号404-过磷酸化tau）。(C类)将外源性GSK-3β-HA或其pcDNA转染到N2a中，转染后48h用抗GSK-3？抗体检测外源性tau的表达。(D类)GSK-3活性由32表达后的P标记分析。**，P（P）<0.01与矢量（平均值±SD，n个= 5). (E类)GSK-3β表达后48小时，测量N2a细胞PHF-1表位处的Tau磷酸化。(F类)流式细胞术检测GSK-3β-HA或pcDNA转染N2a细胞48 h和1μM staurosporine处理6 h后的细胞凋亡率。(G公司)观察结果与F类在不表达内源性tau的HEK293细胞中显示。(H（H）)将野生型tau或在氨基酸396（S396A）或404（S404A）处具有Ser-to-Ala取代的tau构建物与GSK-3β同时转染到原始N2a细胞中48 h，并用staurosporine处理细胞6 h。通过流式细胞术测定凋亡率。*，P（P）< 0.05; ∗∗,P（P）<0.01，如中所示F–H（飞行高度）（平均值±SD，n个= 3).
我们接下来突变了tau氨基酸残基Ser396谷胱甘肽激酶-3β磷酸化的关键靶点是Ala（S396A），并观察到tau蛋白保护细胞免受凋亡的能力下降(H（H）)这表明该位点的磷酸化在tau的抗凋亡活性中起着重要作用。tau-Ser的类似突变未观察到明显变化404（S404A），另一个GSK-3β位点(H（H）)。
在短暂转染GSK-3β并用staurosporine处理的N2a/tau细胞中，过度磷酸化的tau（绿色）和两个主要的凋亡标记物活化的caspase-3（红色）和碎裂的细胞核（蓝色）的互斥免疫染色进一步支持了tau磷酸化的抗凋亡功能(A类). 此外，tau磷酸化使细胞对凋亡产生抵抗的观点也得到了支持体内通过两组实验。首先，我们将staurosporine注入大鼠海马，观察PHF-1阳性tau和活化caspase-3的相互排斥分布(B类). 我们在过度表达野生型人类tau（WTTau-Tg）或FDTP突变型R406W-tau（RWTau-Tg）的转基因小鼠系中进行了类似的观察(24); 后者更容易磷酸化(25)和室友对照组（非Tg）。经staurosporine治疗后，3个月龄小鼠的大脑中PHF-1和激活的caspase-3呈非重叠阳性，RWTau-Tg小鼠PHF-1表位tau的磷酸化最为显著(C类). 总的来说，我们的数据强烈表明，GSK-3β介导的tau磷酸化阻断了细胞对外源性促凋亡刺激的反应。
过度磷酸化tau与凋亡标记物的分离。(A类)转染GSK-3β48 h的N2a/tau细胞用1μM staurosporine处理6 h，并用Hoechst染色、活化caspase-3抗体和PHF-1标记三重标记。(B类)将Staurosporine（500μM，3μl）注射到大鼠海马24小时，并对脑切片进行活化的胱天蛋白酶-3和PHF-1τ的免疫染色。(C类)将Staurosporine（500μM，1μl）注射到非转基因同窝小鼠（Non-Tg）、野生型tau转基因小鼠（WTTau-Tg）和R406W-tau转基因鼠（RWTau-Tg）的海马(24)24小时后，对大脑切片进行活化caspase-3和PHF-1 tau的免疫染色。(下部)放大倍率更高。合并图像显示Hoechst（蓝色）或/和活化的胱天蛋白酶-3（红色）与PHF-1τ（绿色）的相互排斥的免疫染色模式。（比例尺，20μm）
Tau的过度磷酸化可稳定β-连环蛋白。
为了确定tau磷酸化抗凋亡作用的机制，我们询问tau磷酸化是否会改变β-连环蛋白（一种公认的细胞生存因子和GSK-3β底物）的水平和定位。GSK-3β在N2a/载体细胞中的表达导致β-catenin总水平显著降低( A左边和B类). 然而，当GSK-3β在N2a/tau细胞中表达时，β-catenin的总水平显著增加，但磷酸化的β-catentin水平显著增加(P（P）-β-catenin）显著降低，伴随PHF-1阳性tau水平升高( A左边和B类和C类). 这些数据表明，tau磷酸化通过GSK-3β拮抗β-连环蛋白的磷酸化，并维持高水平的β-连环素。因为β-catenin的促生存功能需要其核转位(26)，我们检测了细胞质和细胞核部分的β-连环蛋白水平。与tau表达可忽略不计的细胞相比，细胞质和核组分中的总β-catenin水平显著升高，而P（P）-表达tau的细胞胞质组分中β-catenin减少( A中心和赖特和B类和C类). Tau过度表达增强β-catenin向核部分的移位( A正确和B类)，免疫荧光证实了这一结果，表明当tau过度表达时，核β-catenin信号清晰(D类，箭头）。
GSK-3β对tau的过度磷酸化可稳定β-catenin并促进β-catentin的核转位。(A类)将外源性GSK-3β-HA或其pcDNA转染到N2a中，在有或无外源性tau表达的情况下转染48 h，并用1μM staurosporine处理细胞6 h。获得细胞质和细胞核组分，并对β-catenin和磷酸化β-catening进行免疫印迹(P（P）-β-catenin）测定。DM1A和PCNA分别用于加载细胞质和核组分的对照和标记。(B类和C类)定量分析A类. ∗,P（P）< 0.05; ∗∗,P（P）<0.01与矢量；##，P（P）<0.01，GSK-3β/tau组与GSK-3α组（平均值±SD，n个= 3). (D类)用GFP标记的tau或pcDNA和GSK-3β（1:3）瞬时共转染幼稚N2a细胞(50)48 h，然后用1μM staurosporine处理6 h。用罗丹明红X偶联二抗（红色）进行β-连环蛋白免疫染色，并对细胞核进行Hoechst染色（蓝色）；图中显示了tau表达细胞（箭头）中β-catenin从胞浆向细胞核的移位。（比例尺，20μm）
β-儿茶素介导Tau磷酸化的抗凋亡功能。
为了探讨β-连环蛋白在介导tau磷酸化的抗凋亡作用中的直接作用，我们使用siRNA敲除β-连环素。siRNA减少β-catenin（≈70%）可消除tau的抗凋亡作用( A类和B类). 为了证实β-catenin的抗凋亡功能，我们在初生N2a细胞中过度表达β-catening(C类). staurosporine治疗后，凋亡细胞的数量( D类和E类)和细胞凋亡率(F类)β-catenin转染细胞中表达量显著降低。这些结果强烈表明，β-catenin上调可能是由于GSK-3β竞争性磷酸化tau和β-catentin导致的，可拮抗细胞凋亡。
β-catenin的敲除消除了tau的抗凋亡作用，β-catening的过度表达抑制了staurosporine诱导的凋亡。(A类)在先前用GSK-3β-HA转染N2a/tau细胞6h后，用β-catenin siRNA或干扰siRNA对照转染N2a/tau细胞48h。通过Western blotting测定β-catentin水平，并将对照水平定义为1个任意单位来计算。(B类)表达GSK-3β-HA和不同siRNAs的细胞A类用1μM staurosporine进一步处理6 h，并通过流式细胞术定量细胞凋亡率，P（P）与对照组相比<0.01（平均值±标准差，n个= 3). (C类)GFP-β-catenin或含GFP-的载体在初生N2a细胞中瞬时表达，转染后48小时通过Western blotting检测β-catentin。(D类)表达GFP-β-catenin或GFP-载体的细胞C类用1μM staurosporine处理6 h，并用抗活化caspase-3（红色）和Hoechst（蓝色）染色。β-catenin阳性细胞中凋亡细胞（黄色）的数量显著低于载体对照细胞。（比例尺，20μm）(E类)中三个独立实验的定量分析D类. (F类). 通过流式细胞术量化凋亡率。**，P（P）<0.01（平均值±SD，n个= 3).
讨论
以细胞内过度磷酸化τ积聚和神经纤维缠结形成为特征的神经变性是AD和相关τ蛋白病的标志性病变(1——4). 然而，尚不清楚为什么携带高磷酸化tau和缠结的神经元选择进行慢性变性而不是急性凋亡，即使它们经常暴露在促凋亡环境中，尤其是在AD或相关tau病的发展过程中。在本研究中，我们发现tau过度磷酸化能使细胞逃避凋亡，这一现象可以解释为什么大多数携带NFT的神经元在促凋亡损伤后存活下来，并因退化而慢性死亡。在小脑颗粒神经元中也观察到tau参与细胞存活(27)最近对表达突变型和非突变型人类tau的转基因小鼠模型中神经元的组织学分析进一步支持了这一观点(17,28,29). 在这两种情况下，τ丝的存在与单个神经元的死亡没有直接关系。我们还观察到，tau-1表位的去磷酸化tau与凋亡标记物共标记（数据未显示），这支持了之前的报告，即tau去磷酸化使细胞更容易发生凋亡(30). 虽然也报道了tau假磷酸化的促凋亡作用(31)我们认为tau的抗凋亡功能需要其磷酸化。由于成年人的神经元很少得到补充，神经元很可能已经进化出机制，能够在凋亡攻击中幸存下来，以维持最佳的大脑结构。我们认为，如我们的研究所示，其中一种机制是tau磷酸化诱导的凋亡流产，这可以使神经元在凋亡攻击中存活下来，并等待自我修复的机会。
Tau是一种磷酸蛋白，每mol Tau蛋白通常含有2–3 mol磷酸盐。AD患者大脑中总tau的水平是对照组的4到5倍，并且以异常磷酸化tau的形式增加(32). 一组蛋白激酶催化τ的磷酸化；其中，GSK-3β是最显著的tau激酶之一(20). 先前对表达少量tau蛋白的SH-SY5Y细胞的研究表明，GSK-3β促进了外源性诱导的细胞凋亡(33). 在本研究中，我们还观察到GSK-3β的过度表达单独增强了staurosporine诱导的细胞凋亡。然而，tau的同时过表达消除了GSK-3β增强的凋亡，表明tau磷酸化可以挽救GSK-3α介导的细胞死亡。除tau外，GSK-3β还磷酸化β-catenin，从而调节蛋白质的蛋白水解和细胞移位(26). β-连环蛋白作为“Wnt/GSK-3/β-连环蛋白”的一种成分，在神经系统中越来越受到重视。我们的结果表明，在tau过度磷酸化过程中β-catenin的上调在防止细胞凋亡中起到了作用。由于tau和β-连环蛋白都是GSK-3的有利底物，我们推测tau磷酸化可能通过竞争机制改变β-连环素的磷酸化/活性。事实上，β-连环蛋白的过度表达阻断了一氧化氮诱导的结肠癌细胞凋亡(34)而β-catenin的失稳或下调会增强细胞凋亡(35,36). 这些发现表明β-catenin是AD神经元存活的关键介质，并支持Wnt信号通路功能丧失可能在AD进展中发挥作用的观点(37). Tau还可以通过稳定微管发挥抗凋亡作用。然而，众所周知，过度磷酸化的tau从微管上脱落，导致微管断裂。因为我们研究中的tau是过磷酸化的，所以可以排除这种可能性。
由于过度磷酸化的tau是AD脑退化神经元中NFT的主要蛋白亚单位，因此研究一直集中于tau过度磷酸化带来的有害影响；例如，过度磷酸化的tau不再能够促进微管的组装(38)，它隔离正常的tau，从而破坏微管(39). 此外，显示tau过度磷酸化的神经元不能维持轴突运输，这是神经退化的标志(40). 在本研究中，我们证明了tau磷酸化的抗凋亡功能。最近还提出了tau磷酸化对氧化应激的保护作用(41). 看来，tau的过度磷酸化可能通过导致神经元逃避凋亡来防止大脑中大多数神经元的快速丢失，但tau过度磷酸化的神经元是“病态的”，不再具有正常的生理功能，例如促进微管组装和维持正常的轴突运输。此外，延长这些患病神经元的存活时间，使其对环境/代谢损伤的抵抗力降低，还允许NFT从过度磷酸化的tau进化而来。这些功能不全、有病的神经元可能是神经退化的根源。因此，AD脑中NFT的形成可能是由于神经元能够中止急性凋亡细胞死亡并进入最终导致慢性神经变性的通路。我们认为，tau过度磷酸化细胞中这种慢性死亡途径的选择受到多种因素的严格调控，值得进一步研究。综上所述，本研究和之前的研究结果表明，在AD和相关τ蛋白病的不同阶段调节τ蛋白磷酸化，为拯救细胞免受急性凋亡死亡和防止退化提供了良好的机会。
材料和方法
抗体、大鼠和转基因小鼠。
本工作中使用的抗体的详细信息列于雄性Sprague-Dawley大鼠（3个月龄）由同济医学院实验动物中心提供。过度表达野生型和FDTPτ突变体R406W（由钙/钙调素依赖性激酶II（CaMKII）-TA启动子驱动）的转基因小鼠系（3个月龄）和同窝对照(24)是A Takashima（日本理化研究所）的礼物。所有动物实验均按照1995年神经科学学会修订批准的《神经科学研究中使用动物和人类的政策》进行，动物研究得到了我院学术审查委员会的批准。
表1。
| 抗体 | 特定 | 类型 | 工作分解结构 | 国际单项体育联合会 | 来源 |
|---|
| 134d兰特 | 总τ | 个人通讯簿 | 1:30,000 | | K.伊克巴尔 |
| PHF-1型 | Ser的磷酸化τ396–序列号404 | 单克隆抗体 | 1:500 | 1:300 | P.戴维斯 |
| 反tau-1 | Ser处的非磷酸化tau198–序列号199–序列号202 | 单克隆抗体 | 1:20,000 | 1:200 | 化学图标 |
| HA标签（6E2） | HA标签 | 单克隆抗体 | 1:1,000 | | 细胞信号 |
| 裂解半胱天冬酶-3（天冬氨酸175)抗体 | 与天冬氨酸相邻的裂解产生的活化caspase-3的大片段（17/19 kDa）175 | 个人通讯簿 | 1:1,000 | 1:100 | 细胞信号 |
| GSK-3β | 总GSK-3β | 单克隆抗体 | 1:1,000 | 1:50 | 细胞信号 |
| 小鼠抗β-连环蛋白 | β-连环蛋白 | 单克隆抗体 | 1:500 | 1:100 | Zymed公司 |
| DM1A公司 | α-管蛋白 | 单克隆抗体 | 1:1,000 | | 西格玛 |
| 抗磷酸-β-连环蛋白（pSer33/pSer系列37) | β-连环蛋白在血清中磷酸化33和Ser37 | 单克隆抗体 | 1:400 | | 西格玛 |
| 增殖细胞核抗原（PCNA） | 增殖细胞核抗原 | 单克隆抗体 | 1:400 | | 电子生物科学 |
| β-肌动蛋白 | β-肌动蛋白 | 单克隆抗体 | 1:1,000 | | 阿布卡姆 |
| 山羊抗鼠过氧化物酶 | | | 1:5,000 | | 皮尔斯化学公司。 |
| 山羊抗兔过氧化物酶 | | | 1:5,000 | | 皮尔斯化学公司。 |
| 俄勒冈州绿色488山羊抗小鼠IgG（H+L） | | | | 1:1,000 | 分子探针 |
| 罗丹明红X | | | | 1:1,000 | 分子探针 |
| 山羊抗鼠IgG（H+L） | | | | | |
| 罗丹明红X | | | | 1:1,000 | 分子探针 |
| 山羊抗兔IgG（H+L） | | | | | |
稳定表达Tau或其载体的细胞系的建立。
根据制造商的说明，用脂质内酰胺2000（Invitrogen）将最长的人类tau构建物（tau441）或pcDNA（载体）转染到小鼠神经母细胞瘤N2a或HEK293细胞中，并选择单个克隆建立稳定过度表达tau44l的细胞系（即N2a/tau和HEK293/tau）或pcDNA（即N2a/vector和HEK293/vector）。细胞在50%DMEM/50%Opti-MEM中培养，并添加5%FBS和200μg/ml G418。每3天更换一次培养基。
大鼠和转基因小鼠的脑注射。
使用立体定向仪（SR-6N；日本东京Narishige科学仪器实验室）进行脑注射(42). 在AP−4.0、l/R−2.0和V−3.0（单位：mm）的前角和硬脑膜坐标处，将Staurosporine（3μl，500μM）注入大鼠海马。24小时后，制备脑片进行免疫荧光分析。将staurosporine（1μl of 500μM）以坐标1.9 mm/−1.0 mm/1.9 mm注入转基因小鼠系的海马区。
诱导细胞凋亡。
在给予凋亡诱导剂之前，细胞在无血清培养基中培养12小时以诱导分化。为了诱导细胞凋亡，用1μM喜树碱处理细胞(43)，1μM staurosporine(44)，或250μM H2O（运行）2(45)在无血清培养基中培养3、6、12和24小时。按照制造商的程序，使用Annexin V–PI染色试剂盒检测细胞凋亡（加州圣布鲁诺Bender Medsystems）(46)，并通过流式细胞仪和仪器的标准化程序（FACSCalibur，BD Biosciences，San Jose，CA）自动量化凋亡率。细胞活力也通过MTT测定(47)和乳酸脱氢酶测定(48)。
GSK-3活性测定。
用磷酸化GS肽2测定大鼠海马提取物中GSK-3的活性(42). 简单地说，将7.5μg蛋白质与250μmol/L肽底物和200μmol/升[γ-32P] ATP（1500 cpm/pmol ATP）在30 mmol/l Tris中，pH 7.4/10 mmol/l MgCl2/10 mmol/升NaF/1 mmol/升Na三VO（旁白）4/总体积为25μl的2 mmol/l EGTA/10 mmol/l 2-巯基乙醇。用25μl的300 mmol/l停止反应o（o）-磷酸。将25μl的反应混合物一式三份应用于磷酸纤维素单元。用75 mmol/L清洗过滤器三次o（o）-磷酸干燥后，用液体闪烁计数器计数。相对激酶活性以对照组为基础进行表达。
双或三标记免疫荧光。
过量使用水合氯醛（1 g/kg）或一氧化碳杀死大鼠或小鼠2和固定的就地在24 mM NaH中灌注4%多聚甲醛20分钟2人事军官4/126 mM钠2高性能操作44°C时pH值为7.2。用冷冻切片机（CM1900，Leica Microsystems，Wetzlar，Germany）在35μm处切割海马组织的冠状脑切片。然后将切片与各图中所示的一级抗体在4°C下孵育过夜，并用罗丹明红X或俄勒冈州绿488-共轭二级抗体检测免疫反应性（参见). 对于三重标记研究，使用1μg/ml Hoechst 33258（Sigma，St.Louis，MO）进行核染色。对于每个一级抗体，使用每个大脑的三到五个连续切片。这些图像是用激光共焦显微镜（FV500；日本东京奥林巴斯）或荧光显微镜（系统显微镜BX60；奥林匹斯）观察的。对于细胞研究，将细胞培养在盖玻片上，并在4°C下用4%多聚甲醛固定1.5小时，然后在4°C下用一级抗体孵育12≈36小时过夜。其余过程与上述相同。
西方印迹法。
根据我们实验室建立的方法进行蛋白质印迹(42). 简单地说，将细胞匀浆或脑提取物与含有50 mmol/l Tris·HCl（pH 7.6）、2%十二烷基硫酸钠、10%甘油、10 mmol/L DTT和0.2%溴酚蓝的样品缓冲液混合并煮沸5分钟。用10%十二烷基磺酸钠/PAGE分离蛋白质并转移到PVDF膜。使用化学发光底物试剂盒和CL-X Posure胶片对免疫染色进行可视化，并使用数字科学1D软件（纽约州罗切斯特市伊士曼柯达）进行定量分析。带强度以总光密度测量，并表示为相对于每个对照的水平。Tau磷酸化水平相对于总Tau进行了标准化。数据采用SAS 8.01统计软件进行分析，以平均值±SD表示。多组和系列研究之间的差异通过重复测量方差分析进行检验。包含S396A或S404A突变的tau突变体表达结构是F.Liu（纽约州立基础研究所，纽约州斯塔顿岛）的礼物。
β-连环蛋白的亚细胞分离和分析。
亚细胞分离是按照既定的方法进行的(49). 约2×106用1×PBS清洗细胞，并将其悬浮在100μl缓冲液A（10 mM Tris·HCl，pH 7.4/10 mM NaCl/3 mM MgCl）中2/0.03%Nonide P-40），含有蛋白酶抑制剂的混合物，即每种抑肽酶和亮氨酸蛋白酶10μg/ml和100μg/ml PMSF。样品在冰上培养，直到95%以上的细胞能被台盼蓝染色。然后在4°C下以1000 rpm（转子号12154-H；Sigma）离心样品5分钟。收集上清液（细胞质部分），并用缓冲液B（50 mM NaCl，10 mM Hepes，pH 8.0/25%甘油/0.1 mM EDTA/0.5 mM精脒/0.15 mM精胺）清洗颗粒，然后再悬浮在100μl缓冲液C中[350 mM NaCl/10 mM Hepes，pH 8.0/25%（vol/vol）甘油/0.1 mM EDTA/0.5 mM精脒/0.15 mM精胺]，并在4°C中摇晃30分钟。样品在14000×克持续10分钟。所得上清液含有核质级分。
为了敲除β-catenin，我们使用瞬时转染GSK-3β的N2a/tau细胞6小时。然后，根据制造商的说明，使用siPORT胺转染剂（德克萨斯州奥斯汀市Ambion）转染β-catentin siRNA或对照siRNA（20 nM）（加利福尼亚州圣克鲁斯生物科技公司）。48 h后，通过定量Western blotting检测细胞的β-catenin水平，或进一步用1μM staurosporine处理6 h，以流式细胞术检测细胞凋亡。
