美国国家科学院院刊。1999年9月28日；96(20): 11364–11369.
无名指介导泛素结合酶（E2）依赖性泛素化
国家癌症研究所基础科学部免疫细胞生物学实验室，马里兰州贝塞斯达Rockville Pike 9000号国家卫生研究院10号楼1B34室，邮编：20892-1152
*K.L.L.和J.P.J.对这项工作做出了同等贡献。
†现住址：日本福冈812-8582九州大学生物调控医学研究所分子与细胞生物学系。
由马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院Richard D.Klausner传达
收稿日期：1999年7月6日；1999年7月26日接受。
摘要
鉴定了一种含有环指的蛋白（AO7），该蛋白结合泛素结合酶（E2），是E2依赖性泛素化的底物。AO7无名指内阳离子配位残基的突变消除了泛素化，锌的螯合也消除了泛碱化。我们评估了几种其他相关的环指蛋白，包括BRCA1、Siah-1、TRC8、NF-X1、kf-1和Praja1促进E2依赖性泛素化的能力。在所有病例中，均观察到泛素化。无名指通过金属配位残基的突变或锌的螯合作用直接参与了这种活动。这些发现表明，大量具有不同结构和功能的RING指状蛋白可能通过泛素化在调节蛋白水平方面发挥以前未被认可的作用。
泛素链修饰是蛋白质靶向蛋白酶体降解的主要机制(1). 泛素化涉及Ub活化酶（E1）、Ub结合酶（UBC或E2s）和Ub蛋白连接酶（E3s）的顺序作用。该过程首先在E1和Ub的C末端之间形成硫醇酯键，然后将Ub转移到E2的活性位点Cys。至少有17种哺乳动物E2，其特征是具有保守的14-16-kDa核心，其中一些具有N或C末端延伸。在大多数情况下，Ub的C末端和底物上赖氨酸之间的异肽键的形成涉及一种被称为E3的额外蛋白质或蛋白质复合物。E3识别E2并促进Ub从E2转移到底物，在某些情况下与Ub形成巯基酯。E3s在催化底物上Ub分子链的形成（多泛素化或多泛素化）中起着重要作用，这对蛋白酶体的识别至关重要。
尽管有大量的底物，但在分子水平上对E3进行表征的相对较少(1). 氨基酸序列已知的E3包括酵母和哺乳动物的N末端规则E3(2)和HECT（与E6-AP C末端同源）家族成员。哺乳动物HECT E3s包括E6-AP，其靶向p53，在人类乳头状瘤病毒E6存在时实现泛素化(三)和Nedd4，泛素化上皮钠通道亚单位(4,5). 其他E3s包括Mdm2，它催化自身泛素化和p53泛素化(6)；后发复合体（APC）；以及底物包括Sic1p、G1细胞周期蛋白、IκB和β-连环蛋白(7).
为了鉴定其他Ub蛋白连接酶，该酶是高度保守的人类核心E2s家族的成员（UbcH5家族；参考文献。8和9)用于酵母双杂交筛选。这一筛选结果鉴定出一种以前没有特征的环指蛋白AO7，该蛋白在没有E1和E2以外的真核蛋白的情况下发生泛素化。AO7的表征使我们确定了另外六种不相关的RING蛋白也具有E2依赖性泛素化的能力。
材料和方法
结合和功能研究。
GST融合蛋白在对数期表达大肠杆菌用0.1 mM异丙基β诱导BL-21（DE3）（Novagen）-d日-硫代半乳糖苷在22°C下放置1小时。将细菌颗粒重新悬浮在50 mM Tris中，pH 7.4/1 mM EDTA/1%Triton X-100/5 mM DTT/2 mM PMSF（超声缓冲液）中，通过探针超声进行裂解，然后在28000×克，并在−70°C下储存。GST融合蛋白的水平通过将声波与谷胱甘肽Sepharose（GS）结合、洗涤和考马斯蓝定量（以BSA为标准）进行评估。抗GST免疫印迹法的相对定量与基于考马斯蓝的估计一致。
对于与GS结合材料的结合和功能研究，融合蛋白（20 pmol，除非另有说明）结合到GS，然后在PBS中洗涤。除非另有说明，否则使用每个小麦E1 20 ng进行GS结合物质的泛素化分析(13)和UbcH5B(8)以表示大肠杆菌泛素化反应缓冲液含有50 mM Tris（pH 7.4）、0.2 mM ATP、0.5 mM MgCl2、0.1 mM DTT、1 mM磷酸肌酸、15单位肌酸激酶和2μl用pET15B转化的BL-21细菌裂解物。用2×10在30°C下反应（30μl）1.5 h4第页，共页32P标记Ub。GST-Ub是32GS上标记的P(14)然后用苯甲脒Sepharose（Amersham Pharmacia）分解和去除凝血酶。用SDS/PAGE对β-巯基乙醇缓冲液中的样品进行解析，并用Storm Phosphor Imager（Applied Biosystems）进行分析。抗-Ub(15)除0.3μg野生型Ub或不含赖氨酸的Ub（UbK0)（来自马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学C.Pickart的礼物）。[35S] 蛋氨酸标记的UbcH5B由在体外使用TnT试剂盒（Promega）在小麦胚芽中进行转录和翻译。通过翻滚10进行结合研究5UbcH5B与GS结合蛋白在4°C的25 mM Tris中，pH 7.4/50 mM NaCl/5 mM DTT/0.5%Nonide P-40中的cpm作用16小时，然后在相同的缓冲液中于4°C下洗涤。
对于螯合实验，GS结合蛋白在4°C下孵育18小时，三次PBS加5 mM EDTA、二钠三氨基五乙酸（DTPA）或四（2-吡啶甲基）乙二胺（TPEN）（Sigma）。对于锌重建实验，在添加ZnCl之前，用PBS洗涤TPEN相关的GST-AO7T，然后用50 mM Tris（pH 7.4）洗涤2在4°C下持续3小时，然后用50 mM Tris和PBS进行顺序清洗。
COS细胞的转染和免疫沉淀按所述进行(9)；12CA5（抗HA；罗氏生物分子化学）用于免疫沉淀。用12CA5、抗Ub或兔多克隆抗UbcH5B（1388）进行免疫印迹。
Praja1、Siah-1和突变的Siah-1被标记为[35S] 会见者在体外使用TnT进行翻译。评估Praja1（2μl）或Siah-1（6μl）在pH 7.4/5 mM MgCl的50 mM Tris-HCl中的泛素化反应2/2 mM ATP/2 mM DTT/100 ng E1/100 ng UbcH5B/10μg Ub（西格玛）。反应在30°C下持续1小时。
结果
隔离UbcH5B绑定伙伴。
通过在小鼠T细胞文库的酵母双杂交筛选中使用编码UbcH5B的cDNA，分离出编码440 aa蛋白质（AO7）的cDNA。对小鼠组织的分析发现，普遍表达≈1.5千碱基mRNA（未显示）。对1490-nt GenBank表达的序列标签进行了表征，该标签编码了在酵母双杂交分离物中发现的整个氨基酸序列，在N末端还有16个氨基酸，包括翻译起始位点。A RING共识序列(16)在氨基酸134和198之间很明显；否则，AO7与已知蛋白质没有整体同源性。为了分离AO7与之相互作用的蛋白质，在第二个酵母双杂交筛选中使用了编码ORF的cDNA。获得了五个克隆，均为小鼠E2s，包括UBCM4（小鼠UbcH5B）、UBCM2和UBCM3。
AO7经历E2-依赖泛素化。
为了确定AO7是否在泛素化中起作用在体外使用了分析(8,9). 本试验使用表达于大肠杆菌其不表达Ub缀合系统的组分，避免了与污染或共纯化真核蛋白如E3相关的问题。被评估的蛋白质以GST融合表达，并通过与GS结合来分离。32P标记的重组Ub和重组E1和E2（UbcH5B）大肠杆菌添加裂解物。GST融合蛋白作为潜在底物，添加的细菌蛋白也是如此。GST-AO7评估（图。A类)显示出GST背景以上的大量泛素化。氨基酸363处AO7的C末端截短的GST融合（GST-AO7T）也被泛素化（图。A类，右车道）。由于GST-AO7表达不良，因此GST-AO7T用于后续分析。与HECT E3s的GST融合一样，GST-AO7T存在时的泛素化与E2相关（图。B类). 其他UbcH5家族成员也使用AO7（未显示）。对于AO7，对于表征良好的HECT E3，当从泛素化反应中分离出可溶性和GS组分时，大多数泛素化材料是GS结合的（未显示），这表明向融合蛋白中添加了多个Ub分子。GST-AO7的凝血酶切割显示GST部分上和AO7内的残基都是泛素化的（未显示）。因此，E2依赖性泛素化并不局限于融合蛋白的AO7部分。
AO7参与E2依赖的泛素化在体外. (A类)在E1、E2（UbcH5B）、细菌裂解物蛋白和32P标记Ub在30°C下持续1.5小时。整个反应在还原条件下通过SDS/PAGE进行分解。(B类)GST融合蛋白按照以下描述进行培养A类在E2（UbcH5B）缺失或存在的情况下。AO7T、Nedd4和E6-AP的GST融合分别在大约69、120和115 kDa处迁移。
定义E2依赖性泛素化所需的区域。
AO7的一系列N端和C端截断被生成为GST融合蛋白（图。). 表现E2依赖性泛素化和E2结合的最小区域跨越氨基酸85–363（AO7T5a）。当AO7T5a在氨基酸289（AO7T6）处被截断时，E2结合被维持，但没有检测到明显的泛素化（图。B类，右车道）。这些发现表明，C末端到氨基酸289的序列是泛素化所必需的，而不是E2结合所必需的。
E2依赖泛素化所需的区域。(A类)AO7和AO7截断的示意图在其N端与GST融合。显示了环和半胱氨酸（C）的位置。(B类)使用以下方法评估所示GST融合的等摩尔量泛素化32P标记Ub(上部)或用于绑定到35标有S的UbcH5B(下部).上部和下部来自不同的实验。
AO7泛素依赖于一个完整的RING-H2手指。
因为HECT E3的活动需要一个活性位点Cys(1)由于AO7包含一个RING共识序列，因此评估了AO7T活性中Cys残基的需求。AO7T含有10种半胱氨酸；AO7T5a中保留了除一个以外的所有（C62）。除了环中的七个半胱氨酸（图。A类)，AO7T5a在其C末端附近有两个半胱氨酸（C357和C358）。当这两种基因都突变为Ser（AO7T5b）时，E2依赖的泛素化和E2结合都没有受到不利影响（图。B类，右起第二条车道）。环内的半胱氨酸（见图。A类AO7 RING序列）通过突变Ser（C→S）进行评估，无论是单独突变（C152）还是成对突变（C134和137；C158和C160；C195和C198）。所有这些都导致了两种泛素化的丧失（图。B上部)和E2结合（图。B下部)，确定了至少四种环半胱氨酸的需求。环外半胱氨酸既不需要用于活性也不需要用于E2结合（图。B类和未显示）。这些发现表明环指结构本身可能对AO7中的E2结合和泛素化至关重要。
AO7的泛素化依赖于RING-H2和锌。(A类)AO7和RING-H2域示意图。半胱氨酸被编号。预测对锌至关重要的八种残留物2+协调由连接AO7和RING共识的线表示(16). 第二个和第三个（环路1）之间以及第六个和第七个（环路2）之间的可变环路预测Zn2+指出了配位残基。(B类和C类)GST融合蛋白检测泛素化(上部)和标签UbcH5B的绑定(下部). 车道上方的数字表示突变的残基。(C类，通道6–8）标记表示H157和C158改变的氨基酸。上部和下部来自不同的实验。(D类)用编码HA标记AO7（HA-AO7）、环突变体（HA-AO3）或空载体（pcDNA3）的质粒转染COS-7细胞。用SDS/12%PAGE对HA标记蛋白进行免疫沉淀和解析。用抗HA探针探测膜(上部)或多克隆抗UbcH5B(下部). (E类)转染细胞的抗-HA免疫沉淀物D类经SDS/8%聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离。用抗-Ub对膜进行探测。(F类)在测定泛素化之前，将结合GST-AO7T和GST-Nedd4的GST-AO7和GST-Nedd4与指定的螯合剂进行孵育。将数据归一化为未接触螯合剂的样品。(G公司)GS结合的GST-AO7T的TPEN螯合作用随后与ZnCl孵育2在评估泛素化之前，广泛清洗GS 3小时。
环，由八个半胱氨酸和组氨酸定义，它们协调两个锌离子（见图。A类对于一致序列），在长度和组成上有很大差异。RINGs在前三个和最后三个配位位点有半胱氨酸，在第四个位点有His。此外，带有该基序的蛋白质具有Cys[C三HC公司4RING（RING-HC）或His[C三H（H）2C类三环（RING-H2）]位于第五个位置。第一、第二、第五和第六半胱氨酸/组氨酸与一个阳离子配位，第三、第四、第七和第八半胱氨酸配位第二个阳离子(16). 根据共识序列确定，AO7属于RING-H2类别，所示氨基酸预计为配位位点（图。A类). 因此，如果RING为E2结合和泛素化提供了物理基础，那么C134或C137的突变应该导致泛素化的损失。对于下一对紧密间隔的半胱氨酸（C158和C160），预计C160是第六个配位位点，但预计H157而不是C158是第五个配位点。与RING-H2对这种活性至关重要一致，C134、C137、C160或H157的突变导致泛素化和E2结合的丧失（图。C类，车道2、3、5和6），而C158突变对这两者都没有影响（图。C类，车道4）。值得注意的是，H157突变为Cys，产生一个潜在的RING-HC，也消除了泛素化和E2结合，无论C158是保留还是转化为Ser（图。C类，第7和第8车道）。这些数据表明AO7的泛素化和E2结合都依赖于完整的RING-H2手指。
环指依赖性E2关联和AO7在细胞中的泛素化。
为了确定AO7在细胞中是否以环依赖的方式与E2s结合，COS-7细胞被转染为编码全长AO7并融合到HA N末端标记（HA-AO7）的质粒，或转染为C134和C137被改变为Ser（HA-AO3RM）的质粒。符合在体外数据显示，野生型HA-AO7，但不是RING突变型，由多克隆抗UbcH5B识别的共免疫沉淀内源性E2s（图。D下部). 当用抗HA免疫印迹相同的膜时，与HA-AO7和HA-AO7RM对应的条带很明显（图。D上部). 优势带上方的其他物种仅在HA-AO7中明显存在。通过低百分比凝胶上的分辨率和抗Ub免疫印迹法，确定这些代表泛素化AO7（图。E类). 用抗HA重新标记印迹证实这些印迹代表泛素化的HA-AO7（未显示）。因此，AO7在细胞中经历了依赖于环的泛素化。
锌在AO7泛素化中的作用。
AO7在泛素化过程中对二价阳离子的需求是由伴随二价阳离子螯合而发生的活性损失确定的，而更强的螯合剂DTPA和TPEN的作用大于EDTA（图。F类). 值得注意的是，阳离子螯合并没有抑制Nedd4，一种HECT E3。确定锌是否2+用TPEN处理GS结合的AO7，然后用ZnCl孵育2观察到泛素化的恢复，确立了锌的作用2+在AO7的泛素化中（图。G公司).
非相关RING-H2指蛋白介导E2-依赖性泛素化。
AO7的结果使我们解决了含有RING-H2的蛋白质通常具有泛素化内在能力的可能性。为了评估这种可能性，四种RING-H2蛋白与AO7无关，并且没有先验的选择在泛素化中可疑角色的原因进行评估。Praja1是一种功能未知的398-aa蛋白（图。A类; 裁判。10). Praja1 RING-H2的第八个配位点位于其C末端的7 aa范围内。考虑到AO7的活性对环远端序列的依赖性，该位置值得注意。引人注目的是，全长GST-Praja1表现出明显的E2-依赖性泛素化（图。B类，右两车道）。第五配位的His突变为Ser（H→S）导致活性丧失。与AO7一样，这个His突变为Cys（H→C），产生一个潜在的RING-HC，仍然导致泛素化的丧失（图。B类).
四种RING-H2蛋白的评估。(A类)蛋白质RING-H2区域的比对。环路和预测的协调位置如上所示。kf-1有两条可能的路线，从C618或C621开始；所示对齐从C621开始。蛋白质的全长形式如下图所示。粗线表示与GST融合的区域（Praja1为全长），环指区域（▧）。TRC8是一种多跨膜蛋白。(B类)对GST-Praja1和第五个假定的Ser（H→S）或Cys（H→C）配位位点的突变体进行泛素化评估。(C类)所示蛋白质的GST融合按照以下描述进行评估B类。kf-1、NF-X1和TRC8融合体分别包括氨基酸538–686、207–645和477–664。kf-1的C→S突变位于氨基酸621；NF-X1 C→S在C342和C345处为双突变。由于难以表达GST-NF-X1，只使用了5 pmol，而使用了20 pmol的NF-X1C→S。(D类)从泛素化反应中去除可溶性物质，如所述C类和GS珠被广泛清洗。两个组分均通过SDS/PAGE进行了分离。(E类)35S标记的Praja1直接在SDS/PAGE（输入）上解析，或在含有或不含UbcH5B的E1反应缓冲液中进行泛素化反应。(F类)用野生型Ub或UbK评估GS结合蛋白的泛素化0Western转移后，用抗Ub免疫印迹细胞膜。GST-Praja1和GST-kf-1分别以大约85 kDa和50 kDa的速度迁移。
对来自其他三种蛋白质的RING-H2区域的GST融合进行了评估（见图。A类用于环对齐和评估的蛋白质示意图）。NF-X1是一种抑制MHC II类基因表达的1154-aa蛋白(11). kf-1是一种假定参与膜蛋白分选的686-aa蛋白(17). TRC8是一种664个氨基酸的多平移膜蛋白，与Patched相似(18). 所有这些GST融合均显示E2依赖性泛素化（图。C类). 对NF-X1（车道6）、kf-1（车道9）和TRC8（未显示）进行了环半胱氨酸突变。在所有病例中，E2依赖性泛素缺失。如kf-1、Praja1和Nedd4所示，大多数泛素化物质是GS相关的，表明泛素化主要发生在融合蛋白上（图。D类). TRC8和NF-X1也获得了类似的结果（未显示）。在未固定GS的情况下进行反应时，还观察到GST融合的E2依赖性泛素化（数据未显示）。评估GST部分缺失时是否发生泛素化，35S标记全长Praja1由在体外网织红细胞裂解物中的翻译并评估泛素化。当添加E2时，绝大多数（≈80%）Praja1在迁移到凝胶顶部时发生了显著变化，表明E2依赖的泛素化（图。E类).
蛋白酶体识别泛素化蛋白质需要多个Ub链(1). 为了确定环指是否促进多Ub链的形成，使用野生型Ub或不含赖氨酸的Ub形式（UbK）与GST-Praja1和GST-kf-1进行反应0)因此不允许多泛素化。根据抗Ub免疫印迹测定，Ub和UbK均出现泛素化0然而，在GST-Praja1和GST-kf-1中，只有野生型Ub的物种延伸到凝胶顶部的水平显著（图。F类). 这些发现表明E2s与其他非相关RING-H2蛋白的相互作用可以导致多Ub链。
RING-HC指蛋白介导泛素化。
评估了两种RING-HC指蛋白促进E2依赖性泛素化的能力。巴西航空公司1(19)在其N末端附近显示出一个RING-HC手指。当BRCA1的第一个788 aa表达为GST融合时（图。A类)观察到E2依赖性泛素化。与RING依赖性一致，TPEN显著减少了泛素化（图。B类). Siah-1是一种324-aa蛋白，针对自身和结肠直肠癌（DCC）缺失基因产物进行蛋白酶体降解，蛋白酶体降解依赖于完整的Siah环(12,20). 为了测试Siah-1是否经历泛素化，Siah-1和第二个推测锌中的突变2+在以下情况下评估了配位位点（Siah-1C→S在体外翻译（图。C类). 表明泛素化Siah-1的条带仅在E2存在时出现，仅在野生型Siah-1中出现（图。C类，车道3）。为了证实这种泛素化不需要翻译混合物中存在其他真核蛋白，对GST融合进行了评估。野生型Siah-1检测到E2-依赖性泛素化，但C→S突变或环缺失型（Siah-1ΔR）未检测到E2依赖性泛碱化（图。D类). 这些发现表明，Siah-1具有RING和E2依赖性泛素化的能力。
RING-HC蛋白也参与泛素化。(A类)对小鼠BRCA1的1–788氨基酸的GST融合进行泛素化评估。(B类)GS结合的GST-BRCA1与（+）或不与（−）TPEN孵育，然后在泛素化反应前洗涤GS。(C类)标记的Siah-1（Siah-1）或第三配位位点（Siah-1C→S）的突变体被翻译为[35S] 小麦胚芽裂解液中的蛋氨酸。材料直接在SDS/PAGE（输入）上解析，或在有或没有UbcH5B的情况下评估泛素化。(D类)Siah-1、C→S Siah-1突变或环缺失的GST融合（Siah-1ΔR；参考。12)被评估为泛素化。
讨论
本研究的结果提供了强有力的证据，证明在适当的分子背景下，环指是一个与E2s相互作用并促进泛素化的模块。这里采用的分析使用测试蛋白本身，即环指蛋白或HECT E3s，作为主要的泛素化底物。本研究中评估的环指蛋白是否也作为E3s或E3s的组分用于特定异源蛋白，尚待确定。然而，现在有几个例子表明，RING包含在蛋白质或蛋白质复合物中，其主要已知功能是充当E3。含环的E3包括酵母（Ubr1p）、哺乳动物（E3α；参考文献。2)和Apc11p(21). 因为这些都没有确定环的重要性。最近，Rbx1/ROC1/Hrt1与Apc11p相同35%，已被证明是细胞周期蛋白、Sic1p和IκB的含cullin E3s的组成部分(22——26). 此外，我们现在知道Mdm2的E3活性取决于锌和多种金属配位环残基（S.F.、J.P.J.、K.H.Vousden和A.M.W.，未发表的工作）。我们认为，RINGs作为几个E3的组成部分的发现既不是巧合，也不是简单地反映了蛋白质（如Apc11和Rbx1）之间的整体相似性。相反，我们观察到，多个或不相关的含RING的蛋白质都介导E2依赖性泛素化，这使得最终可能会发现大量其他含RING的蛋白质是E3成分。
GenBank数据库中有数百个编码环指蛋白的cDNA。对于其中一些，例如TRAF(27)、IAP(28)，Cbl(29——31)，Hrd1p/Der3p(32,33)和单纯疱疹病毒Vmw110(34,35)，有数据表明与泛素化或调节降解相关的作用。对于这些，环介导的泛素化的可能作用现在有待确定。大多数环指蛋白要么功能未知，要么与泛素化没有明显关系，这是本研究中评估的大多数蛋白的情况。例如，TRC8是固醇传感Patched家族的成员(18)NF-X1和BRCA1在转录中都具有环依赖性作用(11,36). 尽管RAG1的无名指在泛素化中的作用尚待评估，但RAG1无名指的重组酶活性并不需要(37). 对于功能与泛素化没有明显关联的环指蛋白，一个有吸引力的可能性是环介导的泛素化以含环蛋白或相关蛋白为目标，以调节的方式降解。可以设想，体内构象的改变、磷酸化诱导的改变以及分子间结合的改变，如二聚化，可能会影响环指蛋白在泛素化中与E2s一起发挥作用的能力。通过这种方式，紧凑的RING模块可以赋予广泛的真核蛋白额外的调节作用。
关于BRCA1的潜在意义是发现一种与其N末端相关的去泛素酶，这导致推测BRCA1可能是泛素化的体内(38). BRCA1的As RING突变与家族性癌相关(39)现在重要的是确定通过BRCA1的RING介导的泛素化的生理意义。
现在出现的一个问题是环指蛋白如何与E2s一起催化泛素化。一种可能性是，与HECT E3s类似，含环蛋白既结合E2，又与Ub形成催化硫醇酯中间体。然而，对于AO7，只有那些被预测与锌配合的半胱氨酸才需要发挥作用，这使得这种可能性降低。AO7的部分抗性以及Praja1和Hrt1对完全灭活HECT E3的烷基化剂浓度的总抗性也与此机制相反（J.P.J.和A.M.W.，未发表的数据和参考文献。26).
或者，环可以提供一个与E2相互作用的位点，允许Ub从E2直接转移到目标赖氨酸。然而，对于含有AO7截短的RING（AO7T6），E2结合不足以支持泛素化。此外，在AO7容易检测到E2结合的条件下，一些泛素化水平最高的环指蛋白几乎没有检测出E2结合（K.L.L.、J.P.J.、S.F.和A.M.W.，未发表的数据）。因此，E2结合程度似乎不能直接预测活性。因此，我们赞成一种模型，其中RING和周围区域不仅与E2-Ub相关，而且还为Ub从E2转移到可用赖氨酸提供了有利的环境。这种机制类似于N端规则E3功能模型中的机制。(1).
尽管已知大量的蛋白质是泛素化的，但鉴定Ub蛋白连接酶已被证明是困难的(1). 我们的发现表明，环指是许多蛋白质固有的一个离散模块，赋予蛋白质E2依赖性泛素化的能力。其中一些环指蛋白可能主要作为E3发挥作用。然而，在其他情况下，RING指依赖性泛素化可能提供具有其他重要细胞作用的蛋白质，这些蛋白质具有以前未被认可的自我调节功能。
致谢
我们感谢E.Fearon、P.Howley、G.Hu、J.Huibregtse、B.Mishra、L.Mishra，H.Ono、S.Ono，C.Pickart、S.Sharan和J.You提供的试剂以及我们在美国国立卫生研究院院内项目中的同事对这份手稿进行的讨论和批判性审查。S.H.得到了日本科学促进会的部分支持。A.M.O.得到了霍华德·休斯医学研究所国家卫生研究院学者计划的支持。
缩写
| Ub（英国） | 泛素 |
| HECT公司 | 与E6-AP C末端同源 |
| 空气污染指数 | 后指复合体 |
| GS公司 | 谷胱甘肽Sepharose |
| 消费税 | 谷胱甘肽S公司-转移酶 |
| 哈 | 血凝素 |
| DTPA公司 | 二双三氨基五乙酸 |
| TPEN公司 | 四（2-吡啶甲基）乙二胺 |
工具书类
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