雄激素诱导前列腺癌对氧化应激的适应：放射治疗的意义1
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杰奥纳桑·H·平瑟斯
*加拿大安大略省多伦多大学健康网络前列腺癌中心
†加拿大安大略省多伦多市多伦多大学安大略癌症研究所医学生物物理系
‡加拿大安大略省汉密尔顿市麦克马斯特大学外科
Inna Bryskin公司
†加拿大安大略省多伦多市多伦多大学安大略癌症研究所医学生物物理系
约翰·特拉希滕贝格
*加拿大安大略省多伦多市大学健康网络前列腺癌中心
江平路
‡加拿大安大略省汉密尔顿市麦克马斯特大学外科
古尔米·辛格
§加拿大安大略省汉密尔顿麦克马斯特大学病理和分子医学系
爱德华·弗里德曼
‡加拿大安大略省汉密尔顿市麦克马斯特大学外科
布莱恩·威尔逊
†加拿大安大略省多伦多市多伦多大学安大略癌症研究所医学生物物理系
*加拿大安大略省多伦多市大学健康网络前列腺癌中心
†加拿大安大略省多伦多市多伦多大学安大略癌症研究所医学生物物理系
‡加拿大安大略省汉密尔顿市麦克马斯特大学外科
§加拿大安大略省汉密尔顿麦克马斯特大学病理和分子医学系
收稿日期：2006年11月16日；2006年12月21日修订；2006年12月27日接受。
版权©2007 Neoplasia Press，Inc.版权所有 摘要
放射治疗是前列腺癌（PC）的标准治疗方法。辐射治疗的假定作用机制是产生活性氧（ROS）。辅助雄激素剥夺（AD）治疗已被证明在高危局限性PC患者中比单纯放疗具有生存优势。然而，这种相互作用的机制尚不清楚。我们假设雄激素通过调节细胞氧化稳态来改变PC的放射反应性。使用雄激素受体（AR）+22rv1和AR-PC3人PC细胞系，我们证明睾酮增加了基础活性氧（bROS）水平，导致磷酸-p38和pAKT的剂量依赖性激活，并增加了簇蛋白、过氧化氢酶和锰超氧化物歧化酶的表达。在三例人类PC异种移植中获得了类似的数据；生长在补充睾酮或去势SCID小鼠体内的WISH-PC14、WISH-PC23和CWR22。这些作用通过AD或通过与还原剂孵育是可逆的。此外，睾酮增加了过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽还原酶的活性。因此，AD显著促进了AR的反应+细胞对氧化应激的挑战。因此，睾酮通过生成被AD修饰的bROS升高，诱导预先设定的细胞对辐射的适应。这些发现为局部PC的激素和放射联合治疗提供了合理的依据。
关键词：前列腺癌、辐射、氧化应激、雄激素、适应
介绍
2005年，美国估计有234460例新诊断的前列腺癌病例，27350名男性死于这种疾病[1]. 广泛的前列腺特异性抗原（PSA）筛查已导致早发性前列腺癌的诊断。放射治疗是局部前列腺癌的一种常见可行的治疗选择。然而，患者对放射的反应存在很大的异质性。使用目前的高剂量适形放射治疗方案，45%的局部局限性疾病患者出现治疗失败[2]. 很可能，除了个别患者的风险因素外，细胞辐射敏感性也存在内在差异，这解释了反应的多样性。将辐射剂量增加到超高水平是一种用于克服治疗失败的实验方法。尽管治疗结果与PSA、Gleason评分和临床分期等风险因素直接相关，但辐射剂量的增加可以改善癌症控制，即使是中等风险到高危患者[三]. 然而，结果仍然不令人满意，据报道直肠毒性增加[3,4].
联合放射治疗和雄激素剥夺（AD）治疗是对抗治疗失败的另一种策略。几个第3阶段随机对照试验表明，与单独接受放疗的患者相比，接受联合放疗和AD的局部晚期疾病患者的总体生存益处[5–7]. 然而，AD治疗对大多数中等风险PC患者的具体作用仍存在争议[8]. 从临床角度来看，有人担心联合疗法的净效益主要来自激素效应就其本身而言也不清楚AD治疗是否消除了剂量增加的需要，或者在使用更高的辐射剂量时是否有必要。不幸的是，为解决这些问题而设计的动力充足的试验尚未报告。AD治疗在细胞还原和控制微转移疾病方面的潜力已经被假定[9].体内使用雄激素敏感性志贺氏肿瘤的研究表明，当AD被添加到辐射中时，整体细胞杀伤增加[10].体外雄激素可阻断Fas抗体或肿瘤坏死因子α（TNFα）联合照射LNCaP PC细胞诱导的凋亡[11]. 此外，AD治疗可能通过其抗血管生成作用促进辐射[12]并通过降低HIF-1α水平[13]实验表明在体外HCT116和PC3肿瘤的放射敏感性[14].
在本研究中，我们研究了雄激素可能在PC辐射治疗效果中发挥作用的一种新机制。我们研究了在有雄激素和无雄激素的情况下，细胞对氧化应激挑战的敏感性。
辐射的主要治疗特征是诱导靶向癌细胞的毒性氧化损伤。活性氧（ROS）是由细胞水在辐射过程中通过高能沉积产生的。这些自由基介导多级细胞损伤：脂质过氧化破坏血浆、线粒体、核和内质网膜，诱导蛋白质交联，导致膜通透性增加和功能丧失。活性氧氧化氨基酸残基（主要是半胱氨酸），改变正常的蛋白质功能和降解过程。最重要的是，活性氧氧化线粒体和核DNA，导致链断裂。然而，ROS是作为正常酶代谢反应的副产物不断形成的。因此，为了防止过度氧化损伤，细胞在促氧化反应和抗氧化反应之间保持基本的氧化还原平衡。
尽管对雄激素和PC进行了大量研究，但很少有关于AD对PC细胞氧化应激影响的报道。Ripple等人[15]证明雄激素的生理水平能够增加LNCaP细胞的氧化应激，他们认为这部分是由于线粒体活性增加。有趣的是，Sun等人[16]假设PSA而非睾酮是睾酮对ROS生成影响的因素，因为雄激素受体（AR）阻滞剂氟他胺和抗PSA抗体可以阻断该作用。这些研究尚未使用PC患者样本进行报道。
老年PC患者的血清睾酮水平差异很大。从第四个十年开始，这一时期被认为与前列腺癌的发生和发展有关[17]，循环睾酮水平开始显著下降[18]. 研究表明，雄激素水平对个体肿瘤表型的影响不同[19]. 这一发现可能表明，患者自身的雄激素环境模拟了其个体肿瘤特征和治疗反应。
在这项研究中，我们检验了AD使PC细胞对氧化应激敏感从而增强辐射反应的假设。我们证明，在雄激素存在的情况下，表达AR的人类PC细胞对氧化应激具有相对抵抗力。这种适应过程源于雄激素增加基础活性氧（bROS）水平的事实。反过来，这刺激应激分子和抗氧化酶的激活和表达，以更好地应对氧化还原平衡的转变。然后，在氧化应激疗法（如放射或光动力疗法）的后续挑战中，与雄激素分泌细胞相比，这些细胞对ROS毒性水平的敏感性降低，因此对治疗的敏感性降低。
材料和方法
细胞系和异种移植
22rv1和PC3人类PC细胞系均购自美国型培养物收藏中心（弗吉尼亚州马纳萨斯），并在37°C、5%CO的增湿空气中培养2在空中。22rv1培养基由苯酚无红RPMI 1640和2 mM组成我-调整谷氨酰胺，使其含有1.5 g/l碳酸氢钠、4.5 g/l葡萄糖、10 mM HEPES、1.0 mM丙酮酸钠和10%炭化胎牛血清（CSFCS）。PC3培养基由2 mM无酚红DMEM组成我-调整谷氨酰胺，使其含有1.5 g/l碳酸氢钠和10%的CSFCS。CWR22号机组[20]、WISH-PC14和WISH-PC23[21]根据机构指南，在魏茨曼科学研究所SPC菌落内的SCID小鼠皮下移植人前列腺腺癌。Eshhar教授（魏茨曼科学研究所）提供了LuCAP-35异种移植物的石蜡块，该移植物生长在去势和补充睾酮的雄性SCID小鼠体内[22].
激素治疗
体外
细胞生长在由无酚培养基和10%CSFCS组成的雄激素缺失培养基中。成年男性血清中睾酮的正常值为14-35nM。因此，睾酮（R1881；西格玛，圣路易斯，密苏里州）被添加到最终浓度为10-10个到10-8M以创建雄激素补充培养基。为了阻止睾丸激素的作用，AR阻滞剂比卡鲁胺（阿斯利康，英国柴郡麦克尔斯菲尔德）被添加到最终浓度为10-5M、 模拟接受比卡鲁胺单药治疗（每天150毫克）的PC患者的平均血浆浓度（50.2µM）[23]. 在几个实验中，10-5将M比卡鲁胺添加到雄激素缺失培养基中，以排除药物本身的影响。为了诱导不同的激素效应，在进一步操作之前，将细胞在这些培养基中预培养48至72小时。
体内
如前所述，为了诱导AD或雄激素补充，在7至10周龄雄性小鼠（CB.17-SCID BEIGE）中生长肿瘤，这些小鼠接受双侧睾丸切除术，或皮下移植90天缓释睾酮丸（12.5 mg/丸；佛罗里达州萨拉索特美国创新研究所）[24].
全球代谢活性的测量
WST-1分析（加拿大魁北克罗氏）用于根据制造商的说明评估细胞代谢活性。
bROS的检测体外试验
我们使用了两种方法来检测bROS。
硝基四氮唑（NBT）测定
细胞在96周的平板中生长汇合。在实验前48小时添加R1881和/或比卡鲁胺。通过NBT分析（Sigma）检测ROS生成。NBT是一种黄色的水溶性粉末，在ROS还原后，会变成深蓝色的不溶性甲霜。细胞在含有0.1%NBT的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中培养90分钟。福尔马赞在50%乙酸中通过超声溶解，并在560nm处测定光吸收率。减去化验空白后，将结果归一化为WST-1化验测定的每种激素条件下细胞的代谢活性。
共焦显微镜
22rv1细胞在上述不同激素条件下的细胞培养中培养72小时。然后将细胞与5 mM NAC（Sigma）孵育或不孵育3小时，然后进行PBS洗涤和胰蛋白酶化。然后将等量的细胞以10的密度放置在玻璃盖玻片上三细胞/ml。24小时后，在37°C下，用5µM二氢乙硫酸氢钠（DHE；Molecular Probes，加拿大安大略省伯灵顿）负载细胞30分钟。在两次PBS洗涤后，添加新鲜培养基。DHE被ROS氧化生成乙炔，乙炔的荧光由蔡司SM510共焦荧光显微镜测量（加拿大安大略省多伦多市卡尔蔡司；激发=475 nm，发射=610 nm）。使用Image Pro软件（Media-Controlnetics，Silver Spring，MD）对图像进行分析。如上所述，在减去背景值并将代谢活动归一化后，结果表示为平均值±1 SD。
免疫印迹分析
细胞在上述不同的激素条件下生长到亚融合状态。当指示时，细胞与H预孵育2哦21 mM，持续30分钟。在用冰镇PBS进行两次洗涤后，细胞在添加有抗蛋白酶和抗磷酸酶混合物（Sigma）的1%Triton X-100/PBS裂解缓冲液中在4°C下裂解30分钟。12000离心克分离不溶性物质15分钟。将上清液溶解在Laemmli样品缓冲液中。使用蛋白质提取试剂盒（Biochain Institute，Inc.，Greenland，NH）从肿瘤组织中纯化蛋白质。在8%至12%的凝胶中（80 V，20分钟；100 V，1小时），通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳分离等量的蛋白质（30–50µg），并通过电印迹（100 V，1.5小时）将其转移到PVDF膜上。使用含有0.05%吐温-20（TBS-T）和5%脱脂奶粉的Tris缓冲盐水（TBS）阻断非特异性结合后，用抗p38的一级抗体（1:1000；Sigma）培养印迹；磷酸化p38（第38页）（1:1000；西格玛）；磷酸化AKT（ser473）（1:1000；细胞信号转导，丹弗斯，马萨诸塞州）；抗全局AKT（1:1000；细胞信号）；小鼠抗4-羟基壬醛（4-HNE）（1:10；Oxis公司，加利福尼亚州福斯特市）；兔抗过氧化氢酶（1:2000；Chemicon International，Temecula，CA）；兔抗锰超氧化物歧化酶（MnSOD），DD-17（1:1000；西格玛）；兔抗HSP27，H-77（1:250；加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司）；小鼠抗HSP70（1:1000；圣克鲁斯生物技术公司）；小鼠抗HSP90（1:1000；StressGen Biotechnologies，密歇根州安娜堡）；和兔抗聚簇素H-330（1:100；Santa Cruz Biotechnology），置于TBS-5%牛血清白蛋白（BSA）中，在4°C下过夜或在室温下放置1小时。然后用TBS-T洗涤膜多次，并与适当的辣根过氧化物酶偶联的第二抗体：山羊抗小鼠或山羊抗兔（Sigma）在室温下以1:1000稀释孵育1小时。根据制造商推荐的方案，使用增强化学发光试剂盒（伊利诺伊州阿灵顿高地Amersham）检测蛋白质-抗体复合物。Western blot分析的所有定量都是通过用1:1000小鼠抗β-肌动蛋白抗体（Sigma）重制印迹来进行的，以确保蛋白质负载相等，然后使用Quantity-One软件（Bio-Read，Hercules，CA）进行扫描和密度测定。
中性红活性测定
细胞分三份接种在96周的平板中。用H治疗24小时后2哦2在不同浓度（200–1500µM）下，用中性红（Sigma）在培养基中稀释至最终浓度40µg/ml培养细胞2小时。用含有0.5%甲醛和0.1%CaCl的固定液冲洗细胞2用PBS快速清洗后，在室温下用提取液（1%冰乙酸和50%乙醇）处理细胞10分钟。用扫描多阱分光光度计ELISA读卡器（Tecan Systems，San Jose，CA）在570 nm的激发下测量吸光度。减去分析空白后，每个激素条件的结果表示为H的平均值±1 SD2哦2相对于未与H孵育的细胞，诱导10%、20%或30%细胞死亡的浓度2哦2（针对每种激素状况）。
克隆放射分析
如前所述，对激素预处理48小时的22rv1细胞进行克隆形成放射分析（0-4 Gy）[25].
pAKT和p38活性测定
根据制造商的说明，使用特定的非放射性试剂盒（细胞信号传递）测定pAKT和pp38激酶活性。简言之，用固定化抗AKT或抗pp38一级抗体在4℃下对全细胞裂解物进行免疫沉淀过夜。对于pAKT激酶分析，将细胞裂解物/固定化抗体与ATP/GSK-3融合蛋白在30°C下培养30分钟。对于p38激酶分析，细胞裂解物/固定化抗体与ATP/ATF-2融合蛋白在30°C下孵育30分钟。通过添加十二烷基硫酸钠样品缓冲液并加热至95°C 5分钟来终止反应。然后对样品进行如上所述的Western blot分析。使用抗磷酸化GSK-3α/β一级抗体开发印迹，以测定pAKT活性，并使用抗磷酸-ATF-2一级抗体测定pp38活性。
免疫组织化学
来自补充睾酮或去势SCID小鼠（WISH-PC14、WISH-PC23和LuCAP-35）的石蜡包埋福尔马林固定人PC异种移植物样品在室温下用蛋白酶K（DakoCytomation，Glostrup，Denmark）预处理5分钟，并用PBS-T清洗。样品在10%的正常兔血清（Sigma-Aldrich，St。Louis，MO）在用山羊抗8-羟基-2′-脱氧鸟苷（8-OHdG）抗体（1:200；Chemicon International）孵育1小时之前，在2%BSA-T中稀释30分钟。使用生物素化兔抗羊IgG抗体（1:500；Vector Laboratories，Burlingame，CA）进行检测，然后用30%的H抑制内源性过氧化物酶活性2哦2溶液，用PBS-T（x2）清洗，用ABC试剂培养（Vector Laboratories），用Vector NovaRED底物试剂盒（Vectors Laboratory）显影。用苏木精和伊红（Sigma-Aldrich）对载玻片进行复染。
超氧化物歧化酶（SOD）活性测定
SOD活性通过商业分析（BIOXYTECH SOD525；Oxis公司）进行测量。22rv1细胞在75-cm中生长72小时的细胞裂解物210个烧瓶-8M R1881带或不带10-5在裂解物缓冲液中不使用蛋白酶抑制剂制备M比卡鲁胺或不使用激素操作（对照），然后根据制造商的方案进行测定。
过氧化氢酶活性测定
生长在75厘米内的22rv1细胞的裂解物210个烧瓶-8M R1881带或不带10-5M bicalutamide或不使用激素操作（对照）72小时，根据制造商的说明（Cayman Chemicals，Ann Arbor，MI），用商业试剂盒测试过氧化氢酶活性。
谷胱甘肽还原酶（GR）活性测定
通过测量NADPH氧化为NADp的速率来分析GR活性+同时，340 nm处的吸光度变化与GR活性成正比。根据制造商的说明使用了商业GR活动套件（Cayman Chemicals）。
全球抗氧化能力分析
根据制造商的说明，采用两种热量测定法，对22rv1细胞在不同激素处理下预处理72小时后的总抗氧化能力进行了检测。BIOXYTECH AOP-490分析（Oxis公司）测量铜的减少2+到Cu+通过样品中所有抗氧化剂的联合作用，而ImAnOx分析（ALPCO Diagnostics，Salem，NH）测量样品中抗氧化剂与一定量外源性H的反应2哦2，含残余H2哦2与抗氧化能力成反比。然后使用WST-1分析将所有测量值归一化为单个样本的代谢活性，以控制因不同激素刺激引起的代谢活性差异而产生的潜在偏差。
数据分析
使用方差分析（ANOVA）对正态分布数据进行分析。需要时，使用Box-Cox变换以达到正常值。用双侧Student’st吨检验和Dunnett检验在5%显著性水平上。NBT和DHE数据采用带“细胞”因子的单向方差分析。采用带有“细胞”和“治疗”因子以及细胞x治疗相互作用项的双向方差分析（ANOVA）进行中性红细胞存活率实验和克隆形成存活率数据。这些结果通过使用Mann-Whitney检验进行的二次非参数分析得到了证实（CT=在含有CSFCS和无酚红的培养基中生长的对照细胞；T=在相同培养基中但添加了10 nM R1881的细胞；T+B=细胞在相同培养基中生长，但同时添加10 nM R1881和10µM比卡鲁胺；结果来自至少三个实验，并表示为平均值±SD）。
结果
AD对氧化应激反应的影响
为了避免因去除必要的生长因子而产生的偏见，我们选择了表达AR和无生长依赖性的雄激素反应性的22rv1人类PC细胞作为我们所有研究的原型在体外实验。我们首先尝试测试雄激素补充（在成年男性的血清范围内，～10-8M） 对氧化应激具有保护作用。我们最初用毒性水平的H直接刺激细胞2哦2并用中性红活性测定法测定其存活率。与H孵育24小时后2哦2在不同剂量（200–1500µM）下，用10-8发现MR1881比在无R1881的情况下生长的对照细胞更具耐药性(P（P）< .05) (). 在条件培养基中添加比卡鲁胺部分恢复了敏感性(P（P）< .05).
雄激素在22rv1人PC细胞中诱导对氧化应激挑战的相对抵抗，可被AD逆转。LD=致死剂量。（B） 通过集落形成试验测定22rv1细胞对γ辐射的存活率。CT=在含有CSFCS且不含酚红的培养基中生长的对照细胞；T＝在相同培养基中生长但添加10nM R1881的细胞；T+Bic=细胞在相同培养基中生长，但同时添加10 nM R1881和10µM比卡鲁胺。结果来自至少三个实验，表示为平均值±SD。
然后，我们使用1到4 Gy的单次剂量将细胞暴露于γ射线下，这代表了治疗性辐射期间每天1.8到2 Gy的临床剂量。除1-Gy辐射剂量外，R1881预处理诱导了显著的保护作用(P（P）< .001) (). 此外，比卡鲁胺的加入显著恢复了R1881存在下生长的细胞的辐射敏感性(P（P）< .001).
这些结果表明，雄激素赋予22rv1细胞的相对抗氧化能力是通过AR诱导的，因为与R1881和比卡鲁胺共培养可以逆转这种作用。
雄激素对bROS的影响
为了确定雄激素对ROS生成的主要影响，我们首先测量了用递增剂量R1881处理的22rv1细胞中的ROS水平。为了避免对雄激素对ROS产生的净作用的潜在误解，因为雄激素在雄激素应答和雄激素依赖的PC细胞中充当主要生长因子（因此诱导的代谢活性高于雄激素依赖细胞的代谢活性），ROS测量值被归一化为不同激素处理下细胞的代谢活动。我们发现用R1881处理22rv1细胞以剂量依赖性方式增加bROS水平(). 比卡鲁胺可以在所使用的所有R1881补充剂水平上显著阻止这种现象（P<0.05）。bROS的最高水平是在补充10-8M R1881，相当于成年男性的血清范围。
雄激素以AR依赖的方式增加bROS水平。（A） 通过NBT还原试验测定R1881对22rv1细胞中ROS水平的剂量依赖性影响。添加10µM比卡鲁胺可对抗此效果。（B） 通过NBT还原试验测定，雄激素诱导的bROS增加仅在表达AR（22rv1）的PC细胞中明显，而在不表达AR的PC3细胞中不明显上图：DHE荧光测量（在存在和不存在R1881和/或比卡鲁胺的情况下，22rv1细胞的DHE荧光的代表性显微视图）。下图：不同激素操作下细胞代谢活性正常化（使用WST-1分析测量）后bROS水平的量化（通过共焦荧光显微镜测量）。CT=在含有CSFCS且不含酚红的培养基中生长的对照细胞；T=细胞在相同培养基中生长，但添加10 nM R1881；T+Bic=细胞在相同培养基中生长，但同时添加10 nM R1881和10µM比卡鲁胺。结果来自至少三个实验，表示为平均值±SD。
然后我们选择使用10-8M R1881进一步测试雄激素刺激后bROS诱导增加是否是AR介导的。研究发现，R1881只能在表达AR的PC细胞中增加bROS。这通过两种实验证明：NBT减少()和DHE荧光染色，DHE被ROS氧化产生荧光(). R1881对不表达AR的PC3细胞中bROS水平没有影响(). 此外，在R1881中添加比卡鲁胺显著降低了(P（P）=.01）bROS水平(,B类和C类)在22rv1细胞中，与未经R1881处理的细胞或仅经比卡鲁胺处理的细胞中获得的结果相似(). 总之，这些结果表明雄激素以AR-依赖性方式诱导bROS水平升高，与代谢率增加无关。培养基的雄激素耗竭可防止bROS水平升高，而AR阻断（比卡鲁胺）可在补充R1881的细胞中逆转这一现象。
进一步验证bROS的增加不仅受雄激素调节在体外在一个模型中，我们确认体内使用三种人类PC模型，宿主的雄激素环境决定了基础氧化还原状态。这表明，与持续补充睾酮的肿瘤相比，在缺乏内源性或外源性雄激素的情况下生长的肿瘤，过氧化物诱导的4-HNE蛋白加合物的表达降低(). 这些加合物是由与多不饱和脂肪酸的脂质过氧化反应产生的4-HNE等高活性醛类共价连接形成的，与细胞的氧化状态相关。同样，与生长在去势动物体内的相同肿瘤相比，生长在补充睾酮的雄性SCID小鼠体内的人类PC异种移植瘤对8-OHdG的染色更为强烈(). 这种染色可以识别羟基自由基攻击形成的修饰DNA。
雄激素以AR依赖的方式增加bROS水平。体内对人类PC异种移植的影响。（A）体内通过4-HNE蛋白加合物的存在检测到的氧化应激诱导的脂质过氧化的表达，通过免疫印迹法和抗4-HNE-抗体判断。WISH-PC23、WISH-PC14和CWR22异种移植物在去势（雄激素）的皮下肿瘤中生长-)或补充睾酮（雄激素+)SCID小鼠。（B）体内8-OHdG在去势（A）皮下肿瘤生长的WISH-PC14、WISH-PC23和LuCAP-35人PC异种移植物中的表达-)或补充睾酮（A+)SCID小鼠（原始放大倍数，x400）。
雄激素对应激相关分子表达和活性的影响
一般来说，细胞对氧化应激，特别是对辐射的适应性反应包括诱导一组蛋白质和信号分子，以帮助对抗进一步的挑战[26]. 因此，我们选择研究不同剂量的雄激素补充与AD对几个关键应激分子细胞内水平的影响，这些应激分子以前与氧化应激疗法的适应性反应有关[26,27]. 因此，与在没有R1881的情况下生长的细胞相比，R1881显著上调了AKT-pAKT活化形式（ser473）(P（P）=0.004）或在R1881和比卡鲁胺的组合存在下(P（P）= .03) (). 激素预处理后，当细胞受到有毒剂量的活性氧刺激时，这些差异更加明显。22rv1细胞在10的存在下生长-8M R1881，随后暴露于1 mM H2哦2与用10-5M比卡鲁胺(P（P）=4 x 10-5)或使用10的组合-8M R1881和10-5M比卡鲁胺(P（P）=0.007）。我们清楚地证明，随着雄激素的补充，pAKT（ser473）的表达水平增加；然而，我们没有观察到激酶活性的增加。
雄激素在22rv1细胞中诱导应激蛋白的激活和表达，这些蛋白可以通过AD（A）pAKT（ser473）的表达来逆转。（B） pp38表达。（C） pp38活性由ATF-2客户蛋白的磷酸化决定。（D） Clusterin表达。（A–D）下部面板显示图形中的相对表达式。结果来自至少三个实验，并表示为平均值±标准偏差。（E）22rv1细胞中HSP70、HSP27和HSP90的表达不受雄激素补充或剥夺的差异影响，但随着氧化应激的反应而增加（与50µM H隔夜培养）2哦2). CT=在含有CSFCS且不含酚红的培养基中生长的对照细胞；Bic=细胞在相同培养基中生长，但添加了10µM比卡鲁胺；T=细胞在相同培养基中生长，但添加10 nM R1881；T+Bic=细胞在相同培养基中生长，但同时添加10 nM R1881和10µM比卡鲁胺。结果来自至少三个实验，表示为平均值±SD。
我们发现，与在没有R1881的情况下生长的细胞相比，R1881也显著上调了激活型p38（pp38）(P（P）=0.004）或在R1881和比卡鲁胺的组合存在下(P（P）= .04) (). 与pAKT表达一样，暴露于毒性水平（1 mM）的H2哦2雄激素预处理增强pp38的表达(). 此外，R1881显著提高了pp38的催化活性(P（P）=0.0001），并被添加比卡鲁胺抑制(P（P）= .0001) ().
以前有人认为，簇合素是一种分子伴侣，可能有助于抵抗氧化应激介导的损伤，尤其是在存在雄激素的情况下[28]. 因此，我们检测了在无雄激素或R1881治疗的细胞中，在比卡鲁胺存在或不存在的情况下，聚集素的表达。雄激素以剂量依赖性的方式增加聚集素的表达，通过添加比卡鲁胺可以将其降低到控制水平(). 用10-9或10-8M R1881比在存在条件下生长的细胞中的含量高10-5M比卡鲁胺(P（P）=0.003和P（P）分别为.04）。在不表达AR的PC3细胞中，补充雄激素或AD对聚集素的表达没有影响（数据未显示），进一步支持雄激素调节的应激蛋白表达。体内与去势宿主中生长的肿瘤相比，AR+在持续补充睾酮的情况下生长的雄激素应答异种移植物表达较高水平的pAKT、pp38和clusterin().
体内补充和剥夺雄激素对应激分子和抗氧化酶表达的影响。雄激素诱导体内应激分子pAKT和p38的激活，以及聚集蛋白、抗氧化酶MnSOD和过氧化氢酶的表达，如三种人类PC异种移植物WISH-PC23、WISH-PC14和CWR22中所记录的。这些肿瘤生长于去势（雄激素-)或补充睾酮（雄激素+)SCID小鼠。注意，pAKT和p38的整体表达在雄激素补充或剥夺的情况下没有改变，而不是它们的活化（磷酸化）形式。
最后，几位作者证明热休克蛋白HSP70、HSP27和HSP90在保护细胞免受氧化应激中发挥作用[27]和辐射[29]. 然而，我们也无法证明在体外或体内雄激素对这些蛋白表达水平的任何差异影响。因此，我们推测，只有当氧化应激开始成为威胁时，雄激素才能促进这些应激分子在PC细胞中的表达。为了测试这一点，我们用10-8M R1881，带10个-8M R1881+10-5M比卡鲁胺，或不加激素（对照）48小时。然后用10至50µM H进行隔夜培养2哦2针对每个条件。尽管HSP70、HSP90和HSP27的表达因氧化应激而增加，但这并不取决于雄激素的存在().
雄激素对抗氧化酶表达和活性的影响
接下来我们研究了AD是否会导致几种抗氧化酶的表达和/或活性降低。我们首先选择测量不同激素环境下细胞的抗氧化能力，发现雄激素确实以剂量依赖的方式增加抗氧化能力(). 此外，用比卡鲁胺阻断AR可以降低抗氧化能力，但这没有达到统计学意义(P（P）= .057) ().
雄激素增加22rv1细胞的抗氧化能力。（A） R1881对细胞抗氧化能力的剂量依赖性影响。（B） AD使用10µM比卡鲁胺，可以降低补充10 nM R1881的22rv1细胞的抗氧化能力。（C） 雄激素补充可显著增加22rv1细胞中过氧化氢酶和MnSOD（D和E）的表达和活性，AD可降低其表达和活性。结果来自至少三个实验，表示为平均值±SD。CT=生长在含有CSFCS和不含酚红的培养基中的对照细胞；Bic=细胞在相同培养基中生长，但添加了10µM比卡鲁胺；T=细胞在相同培养基中生长，但添加10 nM R1881；T+Bic=细胞在相同培养基中生长，但同时添加10 nM R1881和10µM比卡鲁胺。
还研究了两种关键酶，MnSOD和过氧化氢酶，以检测雄激素是否调节抗氧化酶的表达。与AD细胞相比，雄激素补充细胞中这两种酶的表达显著增加(P（P）=.04（MnSOD和P（P）过氧化氢酶分别为.004），用比卡鲁胺阻断AR显著降低其表达水平(P（P）=0.036和P（P）MnSOD和过氧化氢酶分别为.004）(). 同样，体内，全部三个AR+与去势宿主中生长的相同肿瘤相比，在持续睾酮支持下生长的异种移植物表达的两种酶水平更高(). 此外，与AD对照组相比，R1881处理的细胞中这两种酶的活性显著增加(P（P）MnSOD和P（P）过氧化氢酶=.022）(,D类和E类). 在培养基中R1881中添加比卡鲁胺会降低这两种酶的活性，但这在统计学上并不显著。与AD相比，雄激素的生理水平显著增加了GR的活性(P（P）= .032) (). 总之，这些结果表明雄激素诱导表达AR的PC细胞的抗氧化能力增加，而不管其代谢率如何，并且以雄激素调节的方式，这种方式可以被AR阻断逆转。这可能是双重作用的结果：抗氧化酶的表达增加，活性增强。
bROS水平升高对氧化应激适应性反应的影响
在发现雄激素以雄激素调节的方式诱导bROS水平升高后，我们研究了这是否是导致获得性适应氧化应激挑战的主要机制。为了测试这一点，我们在用还原剂进行单独的激素预处理后培养细胞N个-乙酰半胱氨酸（NAC）试图淬灭bROS。通过与5 mM NAC短期预孵育，在所有激素支持条件下，bROS水平均降低至同等程度(). 使用该方案，R1881对clusterin、pAKT（ser473）和pp38表达的差异作用不再明显(,B–D). 事实上，对照细胞（无雄激素）、R1881预处理细胞和R1881和比卡鲁胺预处理细胞之间这些分子的表达没有差异。总之，这表明雄激素诱导bROS水平升高是导致这些应激蛋白表达增加的主要因素。同样，我们还证明MnSOD和过氧化氢酶的表达直接依赖于bROS水平。用5 mM NAC对细胞进行短期预培养，消除了雄激素补充和AD对这些酶表达的差异影响（数据未显示）。直观地说，雄激素诱导的bROS水平增加也可以刺激抗氧化酶活性的增加；然而，我们没有对此进行测试，因为与还原剂（如NAC）培养会自然降低抗氧化酶的活性。
雄激素诱导应激分子和抗氧化酶的激活和表达源于它们被升高的bROS诱导。（A） 在所有激素条件下，用5 mM NAC孵育可降低bROS。上图：DHE荧光测试（在存在和不存在R1881和/或比卡鲁胺的情况下，22rv1细胞的DHE荧光的代表性显微镜视图）。下图：不同激素处理下细胞代谢活动正常化后bROS水平的量化（用共焦荧光显微镜测量）。将22rv1细胞与R1881和还原剂NAC联合预培养，可消除不同激素处理对聚集素（B）、pAKT（ser473）（C）和pp38（D）表达的差异影响。（E） 将22rv1细胞与R1881和还原剂NAC联合预培养可消除雄激素赋予细胞的相对抗辐射性。结果显示，经3-Gy单次照射后，22rv1细胞在集落形成试验中存活。CT=在含有CSFCS且不含酚红的培养基中生长的对照细胞；Bic=细胞在相同培养基中生长，但添加了10µM比卡鲁胺；T=细胞在相同培养基中生长，但添加10 nM R1881；T+Bic=细胞在相同培养基中生长，但同时添加10 nM R1881和10µM比卡鲁胺。结果来自至少三个实验，表示为平均值±SD。
最后，我们证明，通过NAC短期预处理消除bROS（由雄激素诱导）水平的增加可以消除R1881预处理细胞的相对放射抗性，使其达到与AD预处理细胞相同的水平()，而在用10nM R1881预处理后，雄激素缺乏的细胞对3-Gyγ辐射的敏感性几乎是相同细胞的三倍（平均存活率，17.55%与49.3%;P（P）< .001). 在R1881中加入比卡鲁胺可使细胞杀伤增加两倍(P（P）= .0036). 然而，NAC预处理也几乎使所有激素治疗的放射敏感性相等（10µM比卡鲁胺、10 nM R1881和10µM比卡鲁酰胺+10 nM R11881的存活率分别为6%、8.7%和8.1%）。因此，通过在所有激素条件下降低bROS水平，NAC本身的净效应是使细胞对辐射敏感。
讨论
这里的主要发现是AD改变了PC细胞的氧化还原环境，从而提高了它们对辐射杀伤的敏感性。这可能会加强前列腺癌辅助激素治疗和放射治疗的生物学合理性。我们证明雄激素可诱导前列腺癌细胞对氧化应激挑战的适应。细胞适应应激的发展需要在暴露于较低水平的相同应激源后获得对应激的相对耐受性。因此，细胞对氧化应激的适应通常涉及许多细胞蛋白的表达和/或活性的变化，这些变化将使细胞具备抵抗更严重氧化攻击的能力。事实上，活性氧的产生导致各种信号通路的刺激，如丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和其他应激反应蛋白激酶[30]. 特别是，应激反应信号转导途径受到细胞内氧化还原状态的严格调控[31].
这项研究的框架侧重于被认为在肿瘤细胞对辐射的反应中起重要作用的蛋白质。越来越多的证据表明磷脂酰肌醇3-激酶（PI3-K）-AKT信号通路是辐射抗性的主要因素。在接受放射治疗的头颈癌患者中，发现肿瘤pAKT免疫阳性与局部对照之间存在显著关联[32]. 此外，最近研究表明，抑制ser473的AKT磷酸化可使肿瘤对辐射增敏，这两方面都有在体外和体内[33]. 用siRNA抑制AKT1可降低肿瘤细胞的辐射存活率，而外源性AKT1在AKT1 siRNA处理的细胞中的过度表达可将辐射敏感性恢复到基线水平[34]. Baron等人[35]显示雄激素可以通过AR和I（a）类PI3-K的p85a调节亚单位之间的直接相互作用刺激AKT磷酸化。这里，我们认为雄激素诱导的ser473位置AKT磷酸化还与雄激素增加细胞内bROS水平有关，触发AKT磷酸化，从而提高氧化损伤后的细胞存活率。值得注意的是，非磷酸化AKT的表达水平没有受到影响，在体外（未显示数据）或体内()由雄激素引起。
p38通路的激活与应激密切相关，p38通常被称为应激激活蛋白激酶。低水平的氧化应激倾向于瞬时激活p38，而不是持续激活蛋白质，后者支持细胞生存而非凋亡[30]. 据报道，p38激酶的激活可保护细胞免受TNFα诱导的凋亡，而TNFα在辐射引起的凋亡反应中起作用[36]. 研究还表明，p38激酶可以在紫外线辐射后介导AKT活化[37]也会引发氧化挑战。同样，一些研究表明，p38活性的增加对暴露于氧化应激的细胞具有生存优势，这可以通过细胞的氧化预处理来诱导。我们的结果表明，主要是细胞氧化状态的增加，而不是直接的雄激素调节作用，触发了pp38的表达增加及其活性，因为NAC预处理（降低bROS水平）可以改善不同激素操作中pp38表达和活性的差异(). 有趣的是，Takada等人[38]结果表明，MnSOD过度表达改变SK-OV-3人卵巢癌细胞的氧化还原状态，通过ROS生成增强p38-MAPK通路，从而诱导对辐射的抵抗。这里可能暗示了同样的机制，因为PC细胞中bROS和MnSOD的水平都升高了在体外和体内由于雄激素刺激。有趣的是，非磷酸化p38的表达水平没有受到影响在体外（未显示数据）或体内()雄激素；因此，雄激素（通过其对bROS的作用）似乎通过激酶的激活形式对p38 MAPK途径发挥作用。
Clusterin是一种应激相关的细胞生存分子。格里夫和三宅[39]证明在雄激素消融、放射治疗和化疗治疗后，使用反义寡核苷酸抑制PC细胞中的聚集素水平可增强杀伤作用。聚集素的过度表达可抵抗PC细胞中的有毒氧化膜损伤，尤其是在存在雄激素的情况下[28]. 我们的研究结果清楚地表明，雄激素会增加clusterin的表达水平在体外和体内如四种人类PC模型（22rv1、CWR22、WISHPC14和WISH-PC23）所示。在一项免疫组化研究中，使用128名患者的根治性前列腺切除术存档标本报道了相反的现象，其中一些患者接受了新辅助激素治疗[40]. 术前接受新辅助激素治疗的患者恶性前列腺组织中聚集素的表达显著增高。然而，这可能反映了激素剥夺雄激素依赖性PC导致的应激诱导的聚集蛋白表达，而不是聚集蛋白是一种雄激素重表达基因。事实上，钙通道阻滞剂对雄激素依赖性志贺氏肿瘤去势诱导的凋亡的抑制阻止了聚集蛋白基因的上调，这表明聚集蛋白不是直接的雄激素表达，而是由凋亡刺激调节的[41]. 此外，有研究表明，AD患者标本中聚集素的表达增加反映了抗凋亡基因表达的部分适应性增加[40].
热休克蛋白的诱导与获得对包括氧化应激在内的各种细胞应激的耐受性相一致[27]. Plaks等人[27]在H5V小鼠胚胎内皮细胞中显示，氧化应激适应性表型的获得与HSP70和HSP27的表达相关。我们无法证明雄激素本身能够增加HSP70或HSP27的表达在体外或体内虽然我们清楚地证明雄激素显著增加bROS水平，但这可能不足以触发HSP70和HSP27的诱导表达。有趣的是，即使用雄激素和H进行预处理2哦2不能诱导这些热休克蛋白的差异表达；然而，正如预期的那样，这确实增加了这些热休克蛋白（以及HSP90）在所有激素条件下的全球表达(). HSP90是一种参与调节细胞应激反应的分子伴侣，对Raf-1和AKT等关键分子具有较高的选择性，这些关键分子与防止辐射诱导的细胞死亡有关。有鉴于此，HSP90抑制剂已被用于包括PC在内的多种肿瘤模型中，以降低多种放射防护调节蛋白的水平，从而提高辐射敏感性[42].
当氧化应激疗法与激素疗法相结合时，另一种可能有效的机制是抗氧化酶的表达和活性降低，因为可以解毒的活性氧较少。在本研究中，我们测量了MnSOD和过氧化氢酶的表达和活性(和,C–E类)以及GR的活动(). ROS，包括超氧化物，不可避免地由正常的细胞代谢产生，主要是在线粒体中作为电子传递链的副产品。SOD是一组含金属的酶，具有重要的抗氧化作用，催化超氧化物（一种与氧和氢反应强烈的阴离子）的歧化2哦2.一旦成型，H2哦2必须还原为水，以防止形成有毒的羟基自由基。这主要由过氧化氢酶执行。因此，SOD和过氧化氢酶构成了ROS基础细胞生成产物解毒的第一道酶防线。培养基中添加R1881可增强细胞的抗氧化能力(,一个和B类)增加MnSOD和过氧化氢酶的表达()增加过氧化氢酶、SOD和GR的活性(,C、 D类、和F类). 谷胱甘肽（GSH）是最丰富的细胞内抗氧化剂，细胞内氧化还原状态通常通过GSH（还原）与氧化谷胱甘苷（GSSG）的比值来衡量[43]. 细胞内GSH水平升高与放射抗性相关在体外[44]. 因此，Husbeck等人[45]通过用亚硒酸盐消耗GSH使人PC细胞放射增敏，从而降低GSH/GSSG比率。在本研究中，我们证明AD降低GR的活性()，负责通过GSSG的减少来补充GSH。这可能是雄激素诱导对电离辐射产生的氧化应激适应的另一个重要机制。
总之，我们认为AD治疗通过双重机制促进基于氧化应激的PC治疗(). 首先，它可能会降低PC细胞中bROS的水平，导致适应性应激分子的表达和活性降低。其次，它还可能抑制抗氧化酶的表达和活性，从而降低细胞的抗氧化能力。AD对抗氧化酶表达和活性的影响可以通过AR介导和/或通过减少bROS的表达来实现。
提出的前列腺癌放射治疗雄激素驱动适应模型。雄激素在前列腺癌细胞中诱导较高的bROS，导致应激分子（pAKT和pp38蛋白激酶）和聚集素的表达和活性增加，以及刺激细胞抗氧化能力的抗氧化酶活性增加。AD治疗可降低bROS水平，从而逆转应激分子和抗氧化酶活性的增加，促进基于氧化应激的治疗，如放射治疗。
虽然超出了本研究的范围，但我们认识到雄激素诱导氧化应激疗法适应的另一个潜在机制可能是DNA修复系统的诱导[26,46]支持即使在放射治疗课程结束后定期继续AD的做法。
这些发现的一个潜在的未来应用是能够使用pAKT、clusterin、pp38、MnSOD、过氧化氢酶和GR的表达谱作为氧化应激相关的肿瘤适应标记物，将局部PC患者分为亚组，以制定精确的放射前预后标准。有趣的是，对人类淋巴细胞的研究在体外表明人类对电离辐射的适应性反应是异质的，这可能至少部分由基因决定[47]. 很容易推测，AD的应用通过克服适应性分子障碍，在一定程度上消除了这些差异。未来的策略将是检测那些需要辅助性AD的PC患者，使其免受其他患者的影响。
总之，我们首次证明了PC细胞中雄激素对细胞内氧化还原状态的改变通过几种应激激酶和抗氧化酶的过度表达和活性增加改变了对辐射的反应。AD可以对抗这些效应，使表达AR的PC细胞更容易受到辐射。这些发现阐明了临床观察结果，即伴随的AD和局部PC放射可带来治疗益处。
缩写
| 4-HNE公司 | 4-羟基壬醛 |
| 8-欧姆 | 8-羟基-2′-脱氧鸟苷 |
| AD公司 | 雄激素缺乏 |
| 应收账 | 雄激素受体 |
| bROS公司 | 基础活性氧 |
| CSFCS公司 | 炭疽胎牛血清 |
| DHE公司 | 二氢乙炔 |
| 克 | 谷胱甘肽还原酶 |
| 锰超氧化物歧化酶 | 锰超氧化物歧化酶 |
| NAC公司 | N个-乙酰半胱氨酸 |
| 个人计算机 | 前列腺癌 |
| PSA公司 | 前列腺特异性抗原 |
| 草地 | 超氧化物歧化酶 |
脚注
1加拿大前列腺癌研究基金会支持这项工作。J.Pinthus得到了Muzzo基金会/玛格丽特公主医院（加拿大安大略省多伦多市）的支持。
工具书类
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