体细胞切除证明c-Jun通过诱导干细胞因子诱导细胞迁移和侵袭^{▿ †}

试剂和抗体。

MAP激酶的激酶抑制剂（PD98059）、Jun N末端激酶（SP600125）和磷脂酰肌醇3（PI3）-激酶（LY294002）均来自加州加州加州圣地亚哥Calbiochem EMD Bioscience。p38 MAP激酶抑制剂（SB203580）来自Tocris Cookson Inc.（密苏里州埃利斯维尔），表皮生长因子（EGF）来自Biosource International（加利福尼亚州卡马里洛），转化生长因子β（TGF-β）来自Promega（威斯康星州麦迪逊），白细胞介素-1（IL-1）和肿瘤坏死因子α来自Sigma-Aldrich（密苏达州圣路易斯）。还使用了Peprotech Inc.（新泽西州洛基山）的SCF、抗c-Jun抗体（H-79；加利福尼亚州圣克鲁斯的圣克鲁斯生物技术公司）、抗GDI（马里兰州盖瑟斯堡的RTG Sol）、抗SCF抗体（明尼苏达州明尼阿波利斯的研发系统公司）以及罗丹明-抗-球蛋白和DAPI（4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚）（均来自密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich Corp.）。Biodipy 650/665抗phaloidin来自Molecular Probes，Inc.（俄勒冈州尤金市）。

细胞培养、病毒细胞转导和报告基因分析。

细胞保存在补充有10%胎牛血清和100μg/ml青霉素和链霉素的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）中，并在5%的CO中培养₂37°C时。之前描述过腺病毒的传播(65). 感染是在20倍的感染（MOI）下进行的，细胞培养过夜，在实验分析之前更换培养基。如前所述进行逆转录病毒感染(65). 如前所述，使用Genejuice转染试剂（加州圣地亚哥EMD Biosciences）和Lipofectamine（加州卡尔斯巴德Invitrogen Corp）进行转染(7). 采用Mann-Whitney U检验进行统计分析。

显微镜和指骨样蛋白染色用于F-肌动蛋白定量。

在六孔板上检测免疫阳性MSCV-IRES-GFP-和MSCV-c-jun-IRES-GFP-转导的细胞。使用奥林巴斯LSM-5 Meta激光共焦扫描显微镜的20×和60×物镜进行相控显微镜和荧光成像。如前所述进行罗丹明-球蛋白F-actin染色(35). F-actin定量也通过荧光激活细胞分选分析进行(40). 简单地说，汇合c-六月^{飞行/飞行}收集经腺病毒处理的细胞，并用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗。细胞颗粒用多聚甲醛固定并用Triton X-100渗透。用PBS洗涤后，在室温下用PBS中的0.6μM biodipy 650/665 phaloidin（Molecular Probes，Eugene，OR）将细胞染色10分钟(64)。

将细胞接种在纤连蛋白涂层的玻璃盖玻片上，并生长至约80%汇合，并如前所述进行扫描电子显微镜检查(35)。

细胞粘附试验。

九十个六孔细胞表面基质涂层的带状组织培养板（无涂层、I型胶原、IV型胶原、聚-我-赖氨酸、层粘连蛋白、纤维连接蛋白和玻璃体凝集素）用于细胞粘附测定。在每个涂层孔的底部播种等量的细胞，并通过在37°C和5%CO中培养培养板使其粘附₂用于计划的时间间隔。在30分钟、1小时、1.5小时、2小时、3小时和4小时取出含有贴壁细胞的条带；将细胞固定在1%戊二醛中10 min，并用0.1%结晶紫染色30 min。在PBS洗涤后，向每个孔中添加100μl 0.5%Triton X-100，以溶解细胞并通过在室温下轻轻摇晃培养板过夜来提取染料。通过测量595nm处的吸光度，对提取的染料进行定量。对于每个细胞表面基质，从没有接种细胞的涂层孔中记录背景，并减去背景，以获得595的实际吸光度值。

细胞运动、迁移和侵袭的检测。

将细胞置于涂有10μg/ml纤维连接蛋白的塑料皿上，并在含有5%胎牛血清的DMEM中培养过夜。使用蔡司倒置显微镜监测细胞运动。视频图像由一个电荷耦合设备摄像头（2400型）按计划的时间间隔采集，并进行数字化，然后使用3.5版Metamorp软件存储为图像(18). 图像被转换为QuickTime电影，并跟踪细胞核的位置以量化细胞运动。使用Metamorph软件以微米为单位计算细胞速度。用25μM PD98059、25μM LY294002、25μM-SB203580、25μMSP600125、10μM Y27632、10μMH-1152和10μM HA-1100培养细胞，测定激酶抑制剂对细胞迁移的影响(6,10,27,47,49,67). 在检查对细胞运动的影响之前，进行了3小时的分析。此时，迁移方向性的持续性被确定为相对D类/T型表示直接距离比率的比率(D类)从起点到终点除以总轨道距离(T型) (18). 从起点到终点每15分钟测量一次净位移。每一组或每个治疗组至少收集100个细胞的数据。

如前所述，使用Boyden室测定细胞在膜上的迁移(31,32). 通过向下室添加SCF（0.5 ng/ml），形成SCF梯度。如前所述，对三维侵入活动进行分析(44). 总共10个⁵将细胞包埋在96孔板中的100μl胶原蛋白中，培养24小时。将胶原蛋白细胞塞转移到24孔板中，包埋在1 ml胶原蛋白中并培养5天。用相控显微镜监测从中心塞向周围胶原的迁移。

细胞因子阵列分析。

硝酸纤维素膜上发现的小鼠细胞因子阵列来自Raybiotech（Norcross，GA）。来自Ad-Null-和Ad-Cre-treated c的调节介质-六月^{飞行/飞行}通过在无血清DMEM中培养细胞24至48小时来制备细胞。然后根据制造商的说明处理膜，以评估条件培养基中的分泌细胞因子和生长因子。

实时PCR、ChIP检测和酶联免疫吸附检测（ELISA）。

所有基于凝胶的PCR和逆转录PCR（RT-PCR）均使用ExTaq DNA聚合酶试剂盒（日本志贺县Takara Shuzo），使用表中列出的寡核苷酸引物进行​表1。1RNA采用标准异硫氰酸胍法提取，RQ1 DNase I（Promega，Madison，WI）处理，酚氯仿提取。RNA定量在安捷伦2100生物分析仪（加州帕洛阿尔托）中进行，等量用于反转录反应。使用Primer Express 5.1（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）设计所有基因的引物，包括家政控制基因转录本（表​（表1）1)或引用自Sugimoto等人(54). 染色质免疫沉淀（ChIP）分析是根据Upstate Biotechnology，Inc.提供的标准方案进行的，只需稍作修改(14,22). 使用Takara ExTaq试剂盒和表中列出的寡核苷酸引物进行PCR扩增​表1。1对SCF启动子内不含任何AP-1位点的区域进行PCR扩增，作为声波作用的对照（阴性）。

对于ELISA，细胞接种在80%的汇流处，用PBS清洗样品后，24小时后将生长培养基更换为含有0.1%牛血清白蛋白的基本培养基。48小时后，收集条件培养基，以2000 rpm离心5分钟获得上清液，然后通过0.45μm孔径的膜过滤器过滤。根据制造商的建议，使用小鼠SCF ELISA试剂盒（Raybiotech，Narcross，GA）测量条件培养基中的SCF，一式三份，并根据每个样本培养基中总蛋白水平进行标准化。使用小鼠TGF-βQuantikine ELISA试剂盒（明尼苏达州明尼阿波利斯R&D Systems公司）进行TGF-？和EGF-？ELISA检测(11)和小鼠EGF Quantikine ELISA试剂盒（研发系统公司，明尼阿波利斯，明尼苏达州）(8)分别是。实验至少进行了三次。

c-Jun增强细胞迁移速度。

伤口闭合的速度代表了几个因素的组合，包括迁移速度和迁移方向的持续性(18). 对伤口闭合进行了视频显微镜检查（图。3A和B)确定c-Jun缺陷细胞的细胞速度的详细分析（图。​（图3C）。3C公司). 伤口闭合延迟-六月^−/−电池（图。​（图3B）。第3页). c-六月^−/−细胞速度降低（～45%）（图。​（图3C）3C公司) (P（P）< 0.05).

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图3。

c-六月切除会降低细胞迁移率。未经治疗、Ad-Null-或Ad-Cre-treated c的伤口愈合试验-六月^{飞行/飞行}细胞。（A） 每隔15分钟用视频显微镜对细胞成像24小时。显示了0、12和24小时的典型图像。c-六月^−/−细胞在24小时时显示伤口闭合减少。图表显示0、12和24小时的伤口大小（B）、迁移速度（C）和PMD（D）。D类/T型计算基于分析细胞每15分钟运动3小时的视频图像后收集的数据。数据显示为三个以上单独实验的平均值±标准误差。*，P（P）< 0.05.

与细胞速度降低相比，伤口闭合率缺陷相对较大-六月^−/−细胞提示，定向持久性缺陷可能导致伤口闭合缺陷。因此，对迁移方向性（PMD）的持续性进行了分析。使用以15分钟间隔追踪3小时以上的纤维连接蛋白涂层载玻片上细胞运动的代表性示例来确定c-Jun在迁移方向持续性中的作用（图。​（图3D）。三维). PMD的定量使用相对D类/T型比率，表示从起点到终点的直接距离除以总轨道距离的比率(18). c-Jun缺陷细胞的方向性持续性下降了66%（图。​（图3D三维)。

为了确定c-Jun是否足以逆转细胞迁移缺陷，c-六月^−/−用编码c-Jun.c的逆转录病毒表达载体转导MEF-六月^{飞行/飞行}用Ad-Cre或Ad-control转导细胞，然后用编码IRES-GFP或c-Jun-IRES-GFP的逆转录病毒表达载体依次转导。在转导后48小时用编码c-Jun的逆转录病毒进行重新分析。c-Jun表达逆转了细胞速度和迁移方向的缺陷（图。​（图44)。

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图4。

c-Jun拯救了c的迁移缺陷-六月^−/−细胞。c-六月^{飞行/飞行}用Ad-Cre转导细胞以切除c-六月^{飞行/飞行}术后48小时用表达GFP或c-Jun的逆转录病毒再次转导。视频显微镜显示，c-Jun表达诱导了细胞迁移，并挽救了细胞迁移-六月^−/−细胞。（A） 细胞运动的路径追踪。（B） 细胞速度定量。（C） 迁移方向性的持续性。EB，误差栏；SEM，平均值标准误差。

接下来评估c-Jun对粘附细胞细胞面积的影响。删除c-六月增加了细胞面积（图。5A和C). c的再引入-六月通过病毒转导，与野生型对照细胞相比，细胞面积减少（图。5A和C). 进行研究以确定c-Jun是否能够挽救细胞迁移中的缺陷，或者迁移中的缺陷是否由独立于c-Jun的次要效应维持-六月到c-六月^−/−细胞也拯救了丰富的c-Jun蛋白，这与c-六月^+/+细胞，通过Western blot分析进行评估（图。​（图5B）。5亿). 与c相比-六月^+/+单元格，c-六月^−/−细胞面积增加了三倍。将c-Jun重新引入c-六月^−/−细胞将细胞面积恢复到c-六月^+/+电池（图。​（图5C5摄氏度)。

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图5：。

c-六月拯救c细胞形态-六月^−/−细胞。将IRES-GFP或c-Jun-IRES-GFP表达的MSCV载体转染到未经处理、Ad-Null-或Ad-Cre-treated的细胞中-六月^{飞行/飞行}细胞。（A） c的荧光显微镜-六月^−/−（c） 与用c拯救的细胞相比-六月（f） ●●●●。（B） MEF的Western blot分析-六月或用c救出-六月GFP由使用的MSCV载体表示。（C） 使用NIH Image软件确定细胞面积。EB，误差栏；SEM，平均值标准误差。

SCF是对内源性c-Jun的反应而分泌的，并促进细胞迁移。

早期人类角质形成细胞与c-六月^−/−成纤维细胞鉴定IL-1为c-Jun靶基因，通过旁分泌调节角质形成细胞分化(56). 为了考虑c-Jun可能调节旁分泌因子的分泌，而旁分泌因子又有助于成纤维细胞的迁移，从c-Jun培养基中提取条件培养基-六月^+/+单元格已添加到c-六月^−/−细胞。c的条件培养基-六月^+/+细胞拯救了c的迁移特性-六月^−/−包括细胞迁移速度和PMD的细胞（图。​（图6A）。6A级). 来自c的介质-六月^+/+细胞恢复了c的缺陷PMD-六月^−/−细胞，表明分泌因子在c细胞迁移缺陷中的关键作用-六月^−/−电池（图。​（图6）。6). IL-1和肿瘤坏死因子-α都不能挽救细胞的PMD缺陷-六月^−/−单元格（未显示数据）。

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图6。

来自c的条件培养基-六月^+/+细胞拯救c细胞有缺陷的迁移反应-六月^−/−细胞。（A） 对未经处理的（A）、Ad-Null（b）、Ad-Cre（c）和Ad-Cre c进行的PMD分析的路径追踪-六月^{飞行/飞行}用来自c的条件培养基（d）处理细胞-六月^+/+细胞。用来自野生型细胞的条件化组织培养基（CM）处理Ad-Cre-infected细胞，挽救了其有缺陷的细胞迁移（细胞速度）（B）和方向持续性（C）(D类/T型比率）。EB，误差栏；SEM，平均值的标准误差。

鉴于c的条件培养基的能力-六月^+/+细胞拯救c的缺陷迁移-六月^−/−细胞，进行无偏见的蛋白质组分析以筛选其他候选细胞因子和有助于细胞迁移的生长因子。采用细胞因子和生长因子阵列方法，对c-六月^+/+和c-六月^−/−细胞。增殖定量研究表明，c-Jun缺失不会改变大多数蛋白质的丰度（图。​（图7A；第7章; 参见补充材料中的图S1）。然而，SCF的丰度减少了35%（图。​（图7A）。第7章). 为了确定c-Jun调节SCF丰度的机制，对条件培养基中分泌的SCF进行了ELISA（图。​（图7B）。7亿). c-六月缺失使SCF蛋白丰度从500 pg/ml降低到200 pg/ml（图。​（图7B）。7亿). 分泌的mRNA水平(KL-1型)和膜结合(KL-2型)通过实时定量RT-PCR从-六月^{飞行/飞行}用Ad-Null和Ad-Cre处理的细胞（图。​（图7C）。7摄氏度). 实时定量RT-PCR获得的相对定量数据如图所示。​图7C7摄氏度使用ABI SDS 2.1软件将其归一化为看家基因18S rRNA的表达。在c组SCF mRNA水平降低了80%以上-六月^−/−细胞与野生型对照（图。​（图7C）。7摄氏度). 其他几个已知的c-Jun靶基因被评估为阳性对照，也显示在c-六月^−/−单元格，包括扭曲同系物1,扭曲同系物2、和扭曲邻居（图。​（图7D第7天)。

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图7。

c-六月诱导SCF分泌和表达。（A） c的上清液-六月^+/+和c-六月^−/−细胞通过细胞因子和生长因子阵列进行分析。来自c的上清液-六月^+/+拯救c细胞的细胞-六月^−/−评估细胞迁移缺陷。给出了三个独立实验的代表性数据。显示了SCF丰度的平均数据（关于阵列中分析的蛋白质名称，请参见补充材料中的图S1）。（B） 酶联免疫吸附法测定c源条件培养基中SCF的丰度-六月^{飞行/飞行}未经病毒、Ad-Null和Ad-Cre处理的细胞。（C） C的实时RT-PCR定量-六月、SCF(KL-1型，可溶性；KL-2型，膜结合形式）的转录本吉隆坡SCF基因。（D） 已知c的实时RT-PCR定量-六月靶基因(扭转1,扭转2、和扭曲邻居). 在所有实时定量RT-PCR测定中，将感兴趣基因的数据标准化为18S rRNA管家控制基因的转录物的表达。

为了确定c中SCF丰度的减少-六月^−/−导致细胞迁移缺陷的细胞，c-六月^−/−用SCF处理细胞。添加0.5 ng/ml SCF完全扭转了细胞迁移的缺陷（图。​（图8A）8安)速度和方向性（图。​（图88B和C，第7条对第8条）。用抗SCF的免疫中和抗体检测其抑制c细胞迁移的能力-六月^+/+细胞。SCF免疫中和将细胞速度和迁移方向的持续性降低40%（图。8B和C第4条对第6条）。总的来说，这些研究表明-六月^−/−导致了细胞迁移速度和方向性的缺陷。确定在c-六月^−/−电池（图。​（图2）2)是SCF分泌缺陷的一种功能，进行了粘附试验。添加SCF可降低c的细胞粘附-六月^−/−细胞，尤其是当细胞被层粘连蛋白或玻璃体凝集素包裹时（图。​（图8D第8天)。

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图8。

SCF拯救了c的迁移缺陷-六月^−/−细胞。（A） c的路径跟踪-六月^{飞行/飞行}用Ad-Cre和SCF免疫中和抗体（IN-αSCF）（1μg/ml）或添加SCF（0.5 ng/ml）处理的细胞。显示了三个以上实验的数据。显示了定量细胞迁移参数的数据，包括迁移速度（B）和D/T比率，以评估迁移方向性的持续性（C）。（D） 如图图例所示，进行细胞粘附试验。​图2，2在各种基质（I型胶原、层粘连蛋白和玻璃体凝集素）上添加SCF（0.5 ng/ml）。基板附着力显示为4小时和30分钟之间的差值EB，误差棒；SEM，平均值标准误差。

接下来使用Boyden室评估跨细胞膜的迁移。c-六月^−/−与c细胞相比，细胞在迁移中有缺陷-六月^+/+电池（图。​（图9A）。9安). 添加SCF（0.5 ng/ml）促进了c的迁移-六月^−/−SCF的免疫中和抗体减少了c的迁移-六月^+/+细胞减少40%（图。​（图9B）。9亿). c的恢复-六月^−/−SCF引起的细胞迁移与SCF生成减少导致迁移缺陷的作用一致。为了确定c的作用-六月在细胞侵袭中，评估了细胞在三维空间侵袭胶原基质的能力(44). 细胞通过三维细胞外基质屏障显示的侵袭表型是一种更复杂的细胞行为形式，可能与c-Jun的体内功能更为相似。5天后通过检测细胞边缘远端的不可折射细胞来评估胶原蛋白的侵袭。删除c-六月实际上消除了细胞侵入三维基质中胶原蛋白的能力（图。10亿). 添加SCF（0.5 ng/ml）挽救了c-六月-缺乏细胞。针对SCF的免疫中和抗体将侵入胶原蛋白的细胞数量减少了23%（图。10E（东经）与F）。

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图9：。

SCF拯救了c的跨井细胞迁移缺陷-六月^−/−细胞。c-六月^{飞行/飞行}用Ad-Cre处理细胞并分析其跨阱迁移。穿过细胞膜的细胞被结晶紫染成蓝色，在图像中显得更亮。针对SCF的免疫中和抗体或添加SCF（0.5 ng/ml）对跨阱迁移的影响在五个以上的单独实验中进行了量化。（B） 数据显示为平均值±标准偏差（SD）。*，P（P）< 0.05. IgG、免疫球蛋白G；IN-αSCF，抗SCF的免疫中和抗体；EB，误差条。

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图10。

SCF修复三维胶原浸润性缺损-六月^−/−细胞。c-六月^{飞行/飞行}用Ad-Null或Ad-Cre处理细胞，并在含有或不含SCF（0.5 ng/ml）、免疫球蛋白G（IgG）或抗SCF免疫中和抗体（IN-αSCF）的三维胶原凝胶中分析其侵袭性。嵌入的成纤维细胞岛的边缘在每个面板上用虚线标记。在存在SCF或添加针对SCF的免疫中和抗体后5天，在三维胶原凝胶中定量侵袭。EB，误差栏；SD，标准偏差。

我们感谢M.Karin提供的质粒和有用的建议。图第11页由王晨光设计。

这项工作得到了R01CA70896、R01CA75503、R01CAS86072、R01CA 86071（R.G.P.）的部分支持。Kimmel癌症中心得到了NIH癌症中心核心拨款P30CA56036（R.G.P）的支持。该项目的部分资金来自Ralph and Marian C.Falk Medical Research Trust以及宾夕法尼亚州卫生部（R.G.P.）的拨款。

宾夕法尼亚州卫生部明确否认对分析、解释或结论负责。