大黄疾病年鉴。2006年4月；65(4): 545–548.
肿瘤坏死因子α在亚急性皮肤红斑狼疮患者难治性皮肤病变中的表达
萨姆皮埃里,拉卡里诺,R Rondinone公司,吉拉德罗,多莉亚意大利帕多瓦大学临床和实验医学系风湿科
M Alaibac先生,佩塞里科意大利帕多瓦大学皮肤科
P Sarzi‐普蒂尼意大利米兰大学L Sacco医院风湿病科
致：A Doria博士
Cattedra e U.O.di Reumatologia，Policlinico Universitario医学临床与实验室研究生院，意大利帕多瓦市Giustiniani大街2号，邮编：35128；adoria@unipd.it
版权所有©2006 BMJ出版集团有限公司和欧洲风湿病联盟
版权©2006 BMJ出版集团有限公司和欧洲风湿病联盟 摘要
目标
探讨肿瘤坏死因子α（TNFα）在亚急性皮肤红斑狼疮（SCLE）皮损中的表达。
方法
采用免疫组织化学方法分析SCLE患者难治性病变和非病变皮肤活检标本中TNFα的原位表达。活检时，这些患者正在接受系统药物治疗，如抗疟药、免疫抑制剂和沙利度胺。作为对照，还评估了TNFα在其他炎症性和肿瘤性皮肤病患者皮损中的表达。
结果
数据显示，SCLE患者的难治性病变皮肤组织显示出TNFα的强阳性分布，尤其是在表皮内。在同一组患者的非病变皮肤或对照组的皮肤病变中未发现明显染色。
结论
这些发现表明，TNFα是由SCLE皮损内的表皮细胞定位和产生的，并支持其在SCLE发病机制中的潜在作用。TNFα的组织定位可能是一个潜在的治疗靶点，为SCLE患者难治性皮肤病变的治疗提供了新的视角。
关键词：肿瘤坏死因子、亚急性皮肤红斑狼疮、难治性皮肤病变、免疫组织化学、表皮
许多细胞因子，包括肿瘤坏死因子α（TNFα），似乎在炎症过程中以及在系统性红斑狼疮（SLE）自身免疫反应的调节中起着重要作用。
SLE患者血清中检测到高水平的这种细胞因子和受体（sTNFRI和sTNFRII）与疾病活动性相关，1,2甚至在怀孕期间。三
值得注意的是，SLE血清中增加的TNFα具有生物活性，4支持TNFα参与某些狼疮表现的发病机制的假设。4此外，在SLE和肾小球肾炎患者的肾脏切片中，TNFα已被特异性免疫定位5与组织学活性相关。
TNFα由多种细胞产生，包括表皮细胞；尤其是角质形成细胞是细胞因子的有效来源。6
亚急性皮肤红斑狼疮（SCLE）是一种LE特异性皮肤病变，由非瘢痕性丘疹鳞状或环状皮肤病变组成，发生在特征性光分布中。7约75%的SCLE可以通过常规的局部和全身治疗进行治疗；在剩下的25%的病例中，皮肤损伤可能特别严重，对常规治疗难以治愈。
我们的研究旨在调查SCLE患者皮肤病变中TNFα的原位表达。
患者和方法
患者和皮肤活检
在知情同意的情况下，根据Gilliam和Sontheimer的分类，从4名SLE（美国风湿病协会标准）患者身上获取病变和非病变防晒皮肤的切除活检标本，这些患者具有SCLE的特定和诊断性皮肤表现。7
检测自身抗体
通过间接免疫荧光技术检测HEp‐2细胞上的抗核抗体和抗双链DNA抗体绿盲蝽分别是。
采用免疫印迹技术，在Raji培养细胞的细胞质和核细胞提取物上检测抗可提取核抗原的抗体。
针对SSA/Ro和SSB/La抗原的抗体也按照制造商的说明通过酶联免疫吸附试验（ELISA）（INOVA Diagnostics，Inc）进行测试。
血清TNFα水平
使用自动分析仪（Immulite，DPC）和抗肿瘤坏死因子α单克隆抗体（DPC，Biermann GmbH）通过化学发光免疫分析法测定SCLE患者血清中的肿瘤坏死因子（TNF）α。
直接免疫荧光
将病变和非病变皮肤活检标本的4μm厚冷冻切片安装在Polysine玻璃载玻片上，并风干30分钟。然后使用异硫氰酸荧光素标记的兔抗人IgG、IgA、IgM、C3、C1q和C4抗体，在室温下的潮湿室内对切片进行30分钟的染色（丹麦格洛斯特鲁普达科）。在pH 7.3的0.01 M磷酸盐缓冲盐水（PBS）中进行共轭稀释，并添加1%牛血清白蛋白。在PBS中洗涤30分钟后，将切片在新鲜PBS/甘油（50%vol/vol）下盖上。
免疫组织化学
对4例SCLE活动性病变、4例同一患者防晒区正常皮肤、3例蕈样肉芽肿、3例皮肤T细胞假淋巴瘤和2例副银屑病的冰冻切片进行TNFα检测。
样品用以下单克隆抗体（mAbs）染色：抗肿瘤坏死因子α（克隆68B6A3L1；BioSource Europe，Nivelles，Belgium），8抗-CD3（克隆UCHT1；Dako）、抗-CD1a（克隆NA1/34；Dako.）和抗-CD19（克隆HD37；Dako:）。
将风干、丙酮固定、冷冻切片与单克隆抗体孵育过夜，洗涤后，使用标准碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶（APAAP）技术进行处理。应用兔抗鼠免疫球蛋白（Dako）30分钟，清洗后，将切片与APAAP复合物（达科）孵育30分钟。萘酚-AS‐MX磷酸盐与固红TR盐一起用于碱性磷酸酶的开发。通过向底物中添加左旋咪唑阻断内源性碱性磷酸酶。切片用迈尔苏木精复染5分钟。阴性对照通过省略样品中的主要单克隆抗体或用另一个相同同型的无关单克隆抗体替换主要抗体来进行。
结果
表1总结活检时患者的人口统计学、临床和免疫学数据。
表1 SCLE患者活检时的显著特征
| 特点 | 患者1 | 患者2 | 患者3 | 患者4 |
|---|
| 性别/年龄（岁） | 28楼 | 传真：37 | 传真：33 | 第49页 |
| 病程（年） | 6 | 14 | 14 | 11 |
| 皮肤损伤持续时间（月） | 60 | 170 | 12 | 134 |
| 皮肤损伤类型 | 丘脑鳞状的 | 丘脑鳞状的 | 环形/多环 | 环形/多环 |
| 活检部位： | | | | |
| 病变皮肤 | 后退 | 肩部 | 后退 | 胸部 |
| 非病变皮肤 | 谷蛋白属 | 臀肌 | 臀肌 | 臀肌 |
| TNFα染色 | 中等 | 中等 | 中等 | 强大 |
| 血清TNFα水平（ng/l）* | 18.6 | 13 | 7.3 | 9.9 |
| ECLAM公司 | 6 | 4 | 1 | 2 |
| 临床表现： | | | | |
| 关节炎 | + | – | – | – |
| 心包炎 | – | – | – | – |
| 紫菜属 | – | – | – | – |
| 肾脏疾病 | – | – | – | – |
| 血液病 | + | + | – | – |
| 神经系统疾病 | – | + | – | – |
| 自身抗体： | | | | |
| 安娜 | + | + | + | + |
| 抗dsDNA | – | + | – | – |
| 抗La/SSB | – | – | + | – |
| 抗Ro/SSA 60 kDa | – | – | + | + |
| 反Ro/SSA 52 kDa | – | – | + | – |
| 抗核糖体P蛋白 | + | + | – | – |
| 反Sm | – | + | – | – |
| 泼尼松（mg/天） | 25 | 10 | 5 | 5 |
| 其他处理 | 毫米英尺 | MMF、HCQ | HCQ、AZA | HCQ公司 |
| 沙利度胺（mg/天） | – | – | – | 25 |
所有患者最初均接受局部皮质类固醇治疗。由于局部治疗不能充分改善皮肤损伤，患者接受常规全身治疗，其中三名患者也接受沙利度胺治疗。活检时，只有一名患者仍在接受沙利度胺治疗，因为其他两名患者因发生周围神经病变而停止治疗。此外，在活检时，有一名患者没有服用抗疟药物，因为这些药物因副作用（瘙痒）而停用。
两名独立的观察者，在四个SCLE样本的病变表皮中盲目地确定了中度至重度TNFα染色（表1,图1和图2). 表皮室各层角质形成细胞均呈阳性染色。特别是，在任何患者中，TNFα组织定位与皮肤损伤或全身治疗的持续时间之间都没有相关性（表1). SCLE患者的正常防晒皮肤样品和所调查的病理皮肤条件的TNFα免疫染色均为阴性。
图1 1例SCLE患者（4号患者）TNFα强免疫组化染色的代表性图像。TNFα在病变皮肤（A和B）的表皮细胞室中明确表达，而在同一患者的非阳光照射皮肤（C）的表皮中不表达。阳性表皮区域的高倍放大图如图（B）所示。
图2 SCLE患者（1号患者）TNFα中度染色的代表性图像。在病变皮肤中，TNFα在表皮中表达（A），并且可以确定真皮淋巴细胞浸润阳性（A）。同一患者的防晒正常皮肤为阴性（B）。副银屑病对照病例TNFα染色阴性的代表性图像（C）。
1号和2号患者的TNFα血清水平高于参考水平，4号患者的血清水平高于临界水平（表1)TNFα水平似乎与ECLAM得分平行。血清TNFα水平与皮损组织中TNFα的表达无相关性。
所有SCLE患者的病变皮肤均可见轻度（例1和例2）至中度（例3和例4）真皮淋巴细胞浸润。真皮-表皮界面的主要细胞被鉴定为CD3+T淋巴细胞，而CD19+B细胞通常不存在。与同一患者的正常防晒皮肤相比，SCLE受累皮肤的表皮细胞中CD1a的表达普遍降低。
病变皮肤的直接免疫荧光显示，病例1和2的IgG、IgM、C3、C1q、病例3的IgM，病例4的IgG-IgM和C3沿着真皮-表皮交界处沉积。
讨论
已经证明，与HLA‐DR3相关联的TNFα-308A启动子多态性与SCLE密切相关。9最近，在患有皮肤新生狼疮（一种类似SCLE的皮肤病变）的儿童中也有类似的发现。10此外，在同一研究中，发现TNFα在受影响儿童的病变皮肤活检标本的表皮内表达。10这些发现支持了这种促炎细胞因子在皮肤新生儿狼疮发病机制中的致病作用的假说。
在我们的研究中，我们观察到，与来自同一患者的正常皮肤以及少数炎症和肿瘤性皮肤状况相比，SCLE患者的病变皮肤的TNFα表达增加。TNFα免疫染色主要定位于表皮小室，表明角质形成细胞是皮肤炎症过程中该细胞因子的主要来源。
在所研究的病变皮肤活检中，通常检测到中度真皮淋巴细胞浸润，细胞浸润特征显示存在CD3+细胞，而CD19+B细胞几乎不存在。TNFα免疫染色或CD3+皮肤浸润与皮肤损伤或全身治疗时间无相关性。
此外，与同一患者的非病变皮肤相比，病变皮肤活检标本中的CD1a+细胞减少。CD1a在分化的抗原呈递细胞和单核细胞中表达，并被用作皮肤中郎格汉斯细胞存在的标志物。11皮肤抗原呈递细胞（朗格汉斯细胞）是树突状细胞的一个亚群，在引发皮肤T细胞介导的免疫反应的始发事件中起着重要作用。我们的研究结果表明，这些细胞在SCLE皮损发生的免疫病理机制中可能没有关键作用。
我们发现血清TNFα水平与疾病活动性相关，但我们没有发现血清中TNFα的水平与皮肤组织的免疫染色强度之间的关系。这些发现支持了这样一种假设，即TNFα是由角质形成细胞局部产生的，并且不可能从患者的循环中泄漏到炎症损伤中，与TNF受体局部结合。
有强有力的证据表明，沙利度胺是一种TNFα阻断剂，可以非常有效地治疗一些难治性SCLE。然而，必须仔细考虑这种药物的相关副作用。事实上，沙利度胺具有高度致畸性，可导致不可逆的周围神经病变。12
最近，一项针对使用嵌合抗肿瘤坏死因子α抗体和常规治疗的患者的开放标签研究显示，尽管有报道称这些患者体内出现了自身抗体，但该疾病的炎症表现得到了临床改善。13抗肿瘤坏死因子α治疗期间诱发皮肤LE的可能性必须被视为可能的副作用。14
我们的研究结果表明，SCLE活动性病变的表皮小室中存在TNFα，这与TNFα对皮肤病发病机制的局部和部位特异性贡献的假设一致。
肿瘤坏死因子α阻断剂成功治疗一例小细胞肺癌患者15我们的研究结果表明，抗肿瘤坏死因子α可能有助于治疗某些顽固性SCLE病例。
鸣谢
这项工作得到了“Ministro dell’Instruzione，dell’Universityáe della Ricerca”项目2004062238‐004的支持。
缩写
APAAP-碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶
单克隆抗体
PBS-磷酸盐缓冲液
SCLE-亚急性皮肤红斑狼疮
系统性红斑狼疮
TNFα-肿瘤坏死因子α
脚注
竞争性利益：无。
道德审批：本研究得到了当地伦理委员会的批准。
工具书类
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