美国国家科学院院刊。2007年2月6日；104(6): 1835–1840.
肌肉抑制素缺乏会导致肌肉过度生长，但会削弱力量的产生
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海尔赫·阿姆索尔
*埃森大学医院儿科，德国埃森45122；
†英国伦敦NW1 OTU皇家兽医学院兽医基础科学系；
雷蒙德·马查里亚
†英国伦敦NW1 OTU皇家兽医学院兽医基础科学系；
罗伯托·纳瓦雷特
§英国伦敦帝国理工学院细胞和分子神经科学系神经科学和心理医学部，伦敦W6 8RF；
马库斯·舒尔克
¶德国柏林查里特大学医院神经儿科，13353；
苏珊·C·布朗
‖英国伦敦W12 ONN皇家学院哈默史密斯医院儿科Dubowitz神经肌肉科；
安东尼·奥托
†英国伦敦NW1 OTU皇家兽医学院兽医基础科学系；
托马斯·沃伊特
*德国埃森大学医院儿科，45122埃森；
弗朗西斯科·蒙托尼
‖英国伦敦W12 ONN皇家学院哈默史密斯医院儿科Dubowitz神经肌肉科；
Gerta Vrbóva公司
**英国伦敦WC1E 6BT伦敦大学学院解剖与发育生物学系；
特伦斯鹧鸪
††华盛顿特区西北密歇根大道111号儿童国家医疗中心遗传医学研究中心，邮编：20010；
彼得·扎米特
‡‡英国伦敦SE1 1UL伦敦国王学院细胞和分子生物物理学Randall分部；和
卢兹·邦格
§§苏格兰农业学院，可持续畜牧系统集团，英国苏格兰米德洛提安EH26 0PH Penicuik Bush Estate
凯坦·帕特尔
†英国伦敦NW1 OTU皇家兽医学院兽医基础科学系；
*埃森大学医院儿科，德国埃森45122；
†英国伦敦NW1 OTU皇家兽医学院兽医基础科学系；
§英国伦敦帝国理工学院细胞和分子神经科学系神经科学和心理医学部，伦敦W6 8RF；
¶德国柏林查里特大学医院神经儿科，13353；
‖英国伦敦W12 ONN皇家学院哈默史密斯医院儿科Dubowitz神经肌肉科；
**英国伦敦WC1E 6BT伦敦大学学院解剖与发育生物学系；
††华盛顿特区西北密歇根大道111号儿童国家医疗中心遗传医学研究中心，邮编：20010；
‡‡英国伦敦SE1 1UL伦敦国王学院细胞和分子生物物理学Randall分部；和
§§苏格兰农业学院，可持续畜牧系统集团，英国苏格兰米德洛提安EH26 0PH Penicuik Bush Estate
乔治·扬科普洛斯（George D.Yancopoulos）编辑，Regeneron Pharmaceuticals，Inc.，Tarrytown，NY，2006年12月5日批准
作者贡献：H.A.、R.M.、R.N.、M.S.、S.C.B.、T.P.、P.Z.、L.B.和K.P.设计研究；H.A.、R.M.、R.N.、M.S.、S.C.B.、A.O.、P.Z.和L.B.进行研究；H.A.、R.M.、R.N.、M.S.、S.C.B.、A.O.、G.V.、T.P.、P.Z.、L.B.和K.P.分析数据；H.A.、R.M.、R.N.、M.S.、S.C.B.、T.V.、F.M.、G.V.、T.P.、P.Z.、L.B.和K.P.撰写了论文。
- 补充资料
支持信息
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摘要
肌肉生长抑制素的缺乏促进骨骼肌的生长，阻断其活性被认为是治疗各种肌肉铸型疾病的一种方法。在这里，我们检测了两个独立的鼠系，它们在肌抑制素基因中含有突变，构成性缺失(Mstn公司−/−)和紧凑型（Berlin High Line，BEH公司信用证). 我们报告称，尽管与年龄匹配的野生型相比，肌肉质量较大，但最大强直力的产生没有增加，但当表达为肌肉大小（比力）的函数时，肌抑制素缺乏小鼠的肌肉比野生型肌肉弱。此外，Mstn公司−/−肌肉在单次抽搐期间收缩和放松更快，IIb型纤维的数量相对于野生型对照组显著增加。这种变化还伴随着含有管状聚集体的IIB型纤维的显著增加。此外，肌抑制素缺乏的肌肉中线粒体DNA与核DNA的比率和线粒体数量下降，表明线粒体耗竭。总的来说，我们的结果表明，肌肉生长抑制素的缺乏会影响与骨骼肌氧化特性丧失相关的力的产生。
关键词：营养不良，组织学，线粒体，生理学
肌肉生长抑制素功能的缺乏导致骨骼肌过度生长，这表明存在一种强有力的机制来控制正常人的肌肉大小(1). 肌肉生长抑制素基因编码TGF-β信号分子家族的一个成员，在脊椎动物进化过程中高度保守(2). 这一发现，加上基因内极少数自发突变的发生率(三,4)，指出了这一途径对肌肉大小的生物优势和相关进化约束。在某些方面，这是自相矛盾的，因为肌肉发达与活力和生殖健康正相关。这种观点可能忽视了对肌肉生长抑制素缺乏引起的肌肉肥大功能方面的关键评估。肌肉质量的增加并没有伴随着肌肉力量的成比例增加，这一观察间接支持了这类怀疑(5,6). 此外，患有遗传性肌肉肥大的牛（双肌牛），其中许多已被证明含有肌抑制素突变(Mstn公司)基因，实际上在轻度运动后容易导致肌肉损伤(7——10). 然而，据报道，肌肉抑制素缺乏的小鼠在短时间运动后不会出现肌纤维损伤(11).
肌营养不良蛋白缺乏患者的肌抑制素靶向灭活或抗体阻断中密度纤维板杜氏肌营养不良模型小鼠证明，营养不良的肌肉确实可以被刺激生长(5,12,13). 在这些动物模型中，对力量发展的影响因肌抑制素阻断方法而异。而单位力输出中密度纤维板用抗肌生成抑制素抗体治疗后，小鼠的肌力仍然下降，用稳定的肌生成抑素前肽治疗后，比力输出增加(5,12,13). 不一致的是，肌肉生长抑制素的靶向灭活第y天w个/第y天w个小鼠是缺汞型先天性肌营养不良症的动物模型，显示肌肉病理学没有改善，实际上增加了出生后的死亡率(14).
尽管存在这些不确定性，但使用特异性抗体阻断肌肉生长抑制素现已被提议作为刺激肌肉生长的新治疗策略，一项针对肌营养不良患者的多中心临床试验正在进行中。在本报告中，我们分析了肌抑制素缺失小鼠肌肉的功能和结构特征。重要的是，我们的研究主体是在最初用于描述肌生成抑制素敲除表型的同一行上进行的，并赋予了肌生成抑素功能阻断在肌肉生成障碍中的有益价值(1,5).
结果
肌肉生长抑制素敲除小鼠的比力生成减少。
检查肌肉大小和功能改善之间的关系Mstn公司−/−我们首先对小鼠进行了一系列力产生试验。最大等长收缩力(P（P）t吨)和破伤风(P（P）o（o）)7个月龄男性趾长伸肌（EDL）Mstn公司−/−和年龄匹配的C57BL/6野生型小鼠出现在和.最大值P（P）o（o）在两种情况下均达到100 HzMstn公司−/−和C57BL/6野生型肌肉，在较高频率的刺激下没有增加。因此，我们比较了在100 Hz时从野生型和Mstn公司−/−老鼠( 一和b条). 尽管肌抑制素缺乏动物的肌肉体积增加P（P）o（o）与具有相同遗传背景的野生型小鼠相似(P（P）= 0.189;; c（c）和e（电子）). 此外，当最大P（P）o（o）对肌肉重量（比力）进行了标准化，我们发现Mstn公司−/−雄性小鼠产生的力仅为野生型动物产生力的53%(P（P）< 0.001;;d日). 类似地P（P）o（o）横截面积也显示了比力产生的减少(P（P）= 0.010;).
成年男性EDL肌肉的生理特性和大小Mstn公司−/−与年龄匹配的C57BL/6野生型小鼠进行比较。(一和b条)显示了野生型EDL肌肉在1、10、20、50、100和200 Hz的直接肌肉刺激下的叠加等长收缩记录(一)和Mstn公司−/−(b条)老鼠。(c（c）)最大值P（P）o（o）EDL肌肉Mstn公司−/−小鼠（蓝色列）与野生型（黄色列）的比较(P（P）= 0.189). (d日)最大值P（P）o（o）表示为EDL肌肉重量的函数Mstn公司−/−小鼠（蓝色列）与野生型（黄色列）的比较(P（P）< 0.001). (e（电子）)力量测试后测量的EDL肌肉湿重Mstn公司−/−小鼠（蓝色列）与野生型（黄色列）的比较(P（P）< 0.001). (（f）)EDL肌肉等长收缩的记录Mstn公司−/−老鼠（蓝色痕迹）和野生型老鼠（黑色痕迹）。(克)EDL肌肉单次抽搐刺激后的收缩时间Mstn公司−/−小鼠（蓝色列）与野生型（黄色列）的比较(P（P）< 0.001). (小时)EDL肌肉单次抽搐刺激后的放松时间Mstn公司−/−小鼠（蓝色列）与野生型（黄色列）的比较(P（P）< 0.001).
表1。
的生理和形态特征Mstn公司−/−和C57BL/6野生型EDL肌肉
| 性别（年龄、月数） | Mstn公司−/−老挝国家电力公司 | C57BL/6野生型EDL | P（P）* |
|---|
| 最大强直张力，mN | 男(7) | 242 ± 22 (14) | 278 ± 14 (12) | 0.189 |
| 男(2) | 164 ± 4 (三) | 166 ± 1 (4) | 0.5 |
| 女性(10) | 251 ± 18 (6) | 297 ± 12 (4) | 0.106 |
| 比强直张力，N/g | 男(7) | 9.4 ± 0.99 (13) | 17.8 ± 0.92 (9) | <0.001 |
| 男(2) | 8.9 ± 0.63 (三) | 17.2 ± 0.99 (4) | 0.001 |
| 女性(10) | 11.0 ± 0.92 (6) | 27.2 ± 1.45 (4) | <0.001 |
| 比强直张力，N/mm2 | 男(7) | 80.4 ± 14.5 (5) | 135.2 ± 7.8 (5) | 0.010 |
| 最大收缩力，mN | 男(7) | 65.6 ± 5.46 (14) | 57.5 ± 2.81 (12) | 0.204 |
| 抽搐/破伤风比率 | 男(7) | 0.275 ± 0.035 (14) | 0.21 ± 0.03 (12) | <0.001 |
| 收缩时间，ms | 男(7) | 19.4 ± 0.33 (14) | 23.7 ± 0.56 (12) | <0.001 |
| 松弛时间，ms | 男(7) | 17.8 ± 1.10 (14) | 24.8 ± 1.40 (12) | 0.001 |
| 湿重，mg | 男(7) | 26.4 ± 0.40 (13) | 15.9 ± 0.68 (9) | <0.001 |
| 男(2) | 18.6 ± 0.90 (三) | 9.7 ± 0.48 (4) | 0.003 |
| 女性(10) | 23.1 ± 0.79 (6) | 10.9 ± 0.21 (6) | <0.001 |
| CSA，毫米2 | 男(7) | 3.17 ± 0.35 (5) | 2.07 ± 0.06 (5) | 0.035 |
| 单位面积线粒体数 | 男(2) | 30.3 ± 0.55 (4) | 41.3±0.69(4) | <0.001 |
7个月大雄性的体重Mstn公司−/−EDL肌肉比野生型值增加66%(P（P）< 0.001;;e（电子）)，以及Mstn公司−/−EDL超过控制值53%(P（P）= 0.035;).
我们还对10个月大的女性EDL肌肉进行了收缩测量Mstn公司−/−小鼠发现了类似的最大值P（P）o（o）(P（P）=0.106），并且比力显著降低(P（P）<0.001），尽管肌肉质量增加了2倍以上(P（P）<0.001）比年龄匹配的雌性野生型(). 男性和女性的最大强直力和比强直力相似Mstn公司−/−老鼠。
对来自年轻动物（2个月大）的EDL肌肉进行力测量，并再次给出类似的最大值P（P）o（o）对于这两种基因型(P（P）= 0.5;). 与野生型相比，纯合EDL肌肉的湿重增加到191%(P（P）= 0.003;)从而降低纯合子肌肉的比力(P（P）= 0.001;)，证实了从老年小鼠获得的数据。2个月大的婴儿比力降低52%，7个月大婴儿比力减少53%Mstn公司−/−雄性小鼠与年龄匹配的雄性野生型小鼠进行比较。
此外Mstn公司−/−在100和200 Hz强直刺激期间，EDL表现出张力衰减，而在野生型EDL中，在刺激期间张力增加( 一和b条). 此外，最大抽搐力在Mstn公司−/−比野生型EDL(P（P）=0.204），但最大破伤风力略低于野生型EDL(;（f）)导致抽搐/破伤风比率显著改变，为0.27Mstn公司−/−与野生型EDL的0.21相比().
男性Mstn公司−/−EDL肌肉达到峰值张力的时间（收缩时间）也显著缩短(P（P）<0.001），半放松时间比野生型肌肉更短(P（P）= 0.001;; f–h). 在女性中也观察到类似的结果Mstn公司−/−与野生型肌肉相比（数据未显示）。
在契约鼠标。
从骨骼肌上的力测量中获得了基本相似的结果契约（柏林高线，BEH公司（信用证）)显示肌肉发达但不同于Mstn公司−/−在其遗传背景和肌生成抑制素基因突变的性质方面。我们发现最大值稍高P（P）o（o）在2个月大的纯合子EDL肌肉中契约女性(贝赫（信用证）)，尽管在统计上不显著(P（P）=0.64），转化为比力的显著降低(P（P）<0.025），允许肌肉质量增加2倍(P（P）<0.05）与来自野生型对照的EDL肌肉相比[和支持信息（SI）图5]. 因此，两者Mstn公司−/−和契约与野生型同窝小鼠相比，小鼠的比力值明显较小。
表2。
2个月龄雌性纯合子致密体（BEH）EDL肌肉的生理特性信用证)和野生型（BEH+/+)老鼠
| 信用证 | +/+ | P（P）* |
|---|
| 最大强直张力，mN | 254 ± 32 (三) | 216 ± 8.6 (三) | 0.64 |
| 比强直张力，N/g | 11.9 ± 2.1 (三) | 19.5 ± 1.0 (三) | 0.025 |
| 湿重，mg | 21.7 ± 1.0 (三) | 11.2 ± 1.0 (三) | <0.005 |
肌肉生长抑制素缺乏易分化为IIB型纤维。
功能研究显示Mstn公司−/−肌肉。因此，我们研究了EDL肌肉的纤维类型分布()在两种纤维中都发现很少I型纤维（慢纤维）Mstn公司−/−或C57BL/6野生型肌肉（数据未显示）。中腹部IIa纤维的总数比Mstn公司−/−EDL比野生型小鼠(P（P）< 0.001;e（电子）). IIa纤维通常在肌肉的深层分离。因此，我们确定了该站点的光纤类型分布( a–d). 我们统计了该区域的IIa、IIb和非IIa/非IIb纤维，并将分布表示为相对频率的百分比。两种亚型均阴性的纤维被视为非杂交IIx纤维。我们发现IIa和IIx纤维减少，同时IIb纤维增加Mstn公司−/−EDL肌肉(（f）). 肌抑制素缺乏的EDL肌肉中纤维类型分布的改变与收缩和松弛时间的缩短一致。
男性EDL肌肉的肌纤维类型Mstn公司−/−-和C57BL/6野生型小鼠。(一和b条)整个EDL的横截面（5×物镜）。绿色荧光一显示MHC IIa仅在少数纤维中表达Mstn公司−/−EDL与C57BL/6野生型EDL的比较b条IIa纤维主要分布在肌肉的深层肌肉区域，如图左侧所示。白色框架显示了分析纤维类型分布的深层肌肉区域。中概述的区域一和b条放大显示在c（c）和d日用×20物镜显示MHC IIa（绿色）和MHC IIb（红色）的染色重叠。星号表示非IIa/非IIb光纤。(e（电子）)整个EDL肌段的IIa纤维总数Mstn公司−/−小鼠（蓝色列）与野生型（黄色列）的比较(P（P）< 0.001). (（f）)显示EDL肌肉深层区域纤维类型分布的直方图。对表达MHC IIa和IIb的纤维以及IIa/IIb阴性的纤维进行计数。非IIa/非IIb纤维被视为IIx纤维，因为几乎没有纤维表达慢MHC。
氧化酶减少Mstn公司−/−肌肉。
鉴于纤维类型偏向于快速糖酵解IIb型纤维，这表明线粒体活性随之降低，我们对EDL肌肉切片上的线粒体酶琥珀酸脱氢酶（SDH）、细胞色素氧化酶（COX）和NADH还原酶进行染色。SDH活性染色显示，在Mstn公司−/−比野生型小鼠(). 同样，来自Mstn公司−/−EDL肌肉的COX和NADH活性低于SDH（数据未显示）。
7月龄男性成年EDL肌肉的氧化特性Mstn公司−/−与年龄匹配的C57BL/6野生型小鼠相关。SDH染色Mstn公司−/−老挝国家电力公司(一和c（c）)和控制EDL(b条和d日)在深处(一和b条）和表面(c（c）和d日）区域。深染纤维含有高SDH活性，浅染纤维含有低SDH活性。
然而，肌肉中的SDH活性Mstn公司−/−与对照组相比，小鼠的肌肉似乎普遍较低，很难仅用快速糖酵解纤维的纤维类型转换来解释().
线粒体DNA耗竭和线粒体数量减少Mstn公司−/−肌肉。
上述结果表明肌抑制素缺乏的肌肉中线粒体数量减少。因此，我们确定了线粒体DNA数量的比率(MT-CO1型)每个单拷贝核基因的拷贝数(Ndufv1型)用基因特异性探针进行实时定量PCR(SI图6). 该检测已在缺乏mtDNA的rho0-细胞上进行了控制，并且未产生信号MT-CO1型探针（数据未显示），因此排除了核假基因扩增的可能性。因此，核常染色体单拷贝基因的拷贝数的一半可以与肌细胞核的数量相等。在野生型肌肉中，尽管EDL（快肌）和比目鱼肌（慢肌）的纤维类型组成不同，但这两块肌肉的线粒体DNA/肌核比率相似（分别为209.8和200.2；P（P）=0.754），这表明不同纤维类型的每个肌核含有大约相同数量的线粒体。有趣的是，我们发现Mstn公司−/−小鼠与野生型肌肉的比较（从205.0到104.8；P（P）=0.007，如果EDL和比目鱼肌结合在一起）。EDL肌肉的下降更为明显（从平均209.8降至75.2P（P）=0.014）与比目鱼肌相比（从200.2到134.4，P（P）=0.027），因此表明肌肉中的线粒体耗竭Mstn公司−/−小鼠不依赖于纤维类型组成。
我们还测定了2个月大的雄性大鼠EDL肌肉纤维中线粒体的数量Mstn公司−/−小鼠和雄性C57BL/6野生型小鼠。我们发现男性的肌纤维Mstn公司−/−小鼠平均每单位面积有30.3个线粒体，而野生型小鼠只有41.3个线粒体(P（P）< 0.001; 来自四块EDL肌肉的455根纤维Mstn公司−/−老鼠；来自C57BL/6野生型小鼠的四块EDL肌肉的401根纤维；)从而证实肌肉中线粒体的缺失Mstn公司−/−老鼠。
肌肉来自Mstn公司−/−小鼠积聚管状聚集物。
H&E和Gomori’s三色染色组织学检查显示，两名男性（7个月大；一和b条)和雌性（10个月大）Mstn公司−/−老鼠。这在年龄匹配的C57BL/6野生型雄性中很少见，在野生型雌性中从未检测到(SI图7). 我们还在胫骨前肌和腓肠肌中发现了类似的包涵体，这两块肌肉都含有高比例的IIb型纤维，但比目鱼肌中没有（数据未显示）。细胞质内含物主要存在于这些肌肉的浅表区域，其中主要含有IIb纤维。电子显微镜显示，它们是小管和囊状扩张的膜状堆积物，这将它们定义为管状聚集体(c（c）).
成人EDL肌管状集合体的组织学分析Mstn公司−/−老鼠。(一)一名7个月大男性EDL肌肉的横切面Mstn公司−/−H&E染色后的小鼠显示，许多肌肉纤维中存在大量细胞质内含物（箭头）。(b条)一名7个月大男性EDL的横截面Mstn公司−/−Gomori三色染色后的小鼠显示紫色的细胞质内含物（箭头）。(c（c）)一只7个月大的雄性EDL的电子显微照片Mstn公司−/−小鼠显示可收缩装置之间的管状和囊状结构堆叠（*），这些结构定义了管状聚集体。
2个月大的EDL肌肉中不存在细胞质内含物Mstn公司−/−老鼠，表明它们随着时间的推移而积累。此外，2月龄紧凑型小鼠EDL肌肉中没有细胞质内含物(BEH公司信用证)在本研究中进行了检查（数据未显示）。
免疫标记显示，这些内含物积累了SERCA1，即快速肌纤维肌浆网的钙释放通道(SI图7). 然而，当用检测所有形式MHC的抗体染色时，它们基本上缺乏横小管结蛋白或肌球蛋白重链的二羟基吡啶受体（DHPR）（数据未显示）。MHC IIb型、SERCA 1和层粘连蛋白-γ1的三重染色证实了IIb纤维中仅存在细胞质内含物(SI图7和数据未显示）。其他异常，如纤维坏死或位于中央的细胞核，在Mstn公司−/−或野生型小鼠。
管状聚集体的频率与Mstn公司−/−小鼠（数据未显示）。
讨论
在这项研究中，我们研究了肌肉生长抑制素基因突变的小鼠骨骼肌肥大的功能和细胞特征(Mstn公司−/−和BEH公司信用证). 与其他报告一致，我们发现肌肉抑制素缺乏导致肌肉质量增加(1,6,15——18)但这一增长并没有伴随着部队生成的成比例增长。因此，当肌肉尺寸标准化时，特定强直张力显著降低，这在两种小鼠系中都观察到。这些发现清楚地表明，与野生型对照组相比，肌肉生长抑制素突变动物的肌肉质量增加并没有带来力量优势。
尽管之前的研究Mstn公司−/−小鼠品系和用抗肌生成抑制素抗体治疗的野生型小鼠的握力增加(5,6,11)，与肌肉质量的增加相比，力的增加不成比例地低，表明比力产生减少。根据我们的研究结果，令人惊讶的是，在中密度纤维板小鼠，杜氏肌营养不良动物模型实际上增加了总输出力以及比输出力(5,12,13).
可以与另一种形式的肌肉生长抑制素信号通路的抑制进行相关比较，从而产生与肌肉生长抑制素突变体相似的生理表型。在MSVski转基因小鼠中ski的过度表达导致IIb型纤维肥大，同时比力产生减少30%(19). Ski负调节Smad磷酸化(20——22)从而抑制TGF-β样因子的信号传导，如肌抑制素。这些发现与肌肉特异性胰岛素样生长因子1的过度表达形成对比，在肌肉特异性胰岛素样生长因子1的过度表达中，纤维肥大伴随着最大力的产生增加并维持特定的力水平(23). 有人可能认为，大面积肥大只会改变肌肉纤维在收缩过程中的拉伸角度，从而降低产生更大力量输出的能力。然而，IGF-1过度表达后肥大增加了力输出，而不是在肌抑制素基因敲除后，这表明了在缺乏肌抑制蛋白的情况下导致力问题的其他因素。
与之前关于Mstn公司−/−鼠标线(24)，我们发现EDL肌肉中IIb型纤维的优势来自Mstn公司−/−小鼠的IIa和IIx型纤维显著减少，初步证据表明胫骨前肌和腓肠肌的IIb纤维优势相似。我们还注意到，肌抑制素缺乏的EDL肌肉中氧化酶活性严重不足，这与快速糖酵解纤维所占比例较高一致，而这些纤维通常含有较少的线粒体。然而，氧化酶活性丧失的程度很难仅用快速糖酵解纤维的纤维类型转变来解释。我们发现肌肉中每个肌核的线粒体DNA拷贝数Mstn公司−/−小鼠的水平甚至低于野生型肌肉中快速糖酵解纤维的水平，我们发现Mstn公司−/−老鼠。我们的结论是，这些发现确实反映了线粒体的耗竭，而这不能用简单的纤维类型转换来解释，我们的数据表明每单位体积细胞质中的线粒体明显减少。
这一发现以及之前关于肌抑制素缺乏肌肉毛细血管密度降低的报道(18)，提示肌抑制素可能起到优化骨骼肌有氧代谢的作用。据报道，骨骼肌线粒体呼吸受阻导致强直力产生减少(25,26)线粒体耗竭综合征患者的主要临床特征之一是肌肉无力(26,27). 因此，肥大肌肉由于缺乏肌抑制素而产生的低比力可能归因于相关的线粒体耗竭。
我们的结果并没有说明肌肉中纤维类型组成的改变是否Mstn公司−/−小鼠是在发育过程中出现的，或者是在以后的生活中纤维是否会转化。它们是否对肌肉产生直接影响，或是否与支配运动神经元的放电模式有关，也不清楚(28)，这是一个需要进一步研究的主题。有趣的是，在与肌抑制素基因突变相关的遗传性肌肉肥大牛中也发现了类似的糖酵解肌纤维表型偏向(29). 快速糖酵解纤维的这种优势可能很好地解释了肌抑制素缺乏肌肉收缩速度的增加和松弛时间的缩短，但鉴于IIb纤维与高力量产生的正常联系，令人惊讶的是，最大刺激几乎没有改变力量产生。因此，Mstn公司−/−肌肉似乎没有从糖酵解纤维预期的高强直力产生中受益，线粒体耗竭将表明疲劳性和运动不耐受性增加，这是分化过程中紊乱而非有序变化的标志。
观察到由肌浆网成分组成的管状聚集体随着年龄的增长而积累，并且仅位于Ⅱb型纤维中，这一观点得到了支持Mstn公司−/−肌肉。此功能尚未报告(1,5,6,11). 尽管它们的存在可能与生理问题的根源有关，但我们的数据并不表明管状聚集体是产生力减少的主要原因。因此Mstn公司−/−和契约老鼠(BEH公司信用证)基因型在形成管状聚集体之前表现出较低的比力产生，而雌性Mstn公司−/−小鼠产生的管状聚集体远远少于雄性，但表现出与雄性非常相似的低比力输出。此外，在男性组中，含有细胞质内含物的肌纤维数量与比力输出之间没有相关性。再次，与MSVski转基因小鼠纤维肥大模型进行比较，该模型也显示出比力产生减少，同时肌浆网增加和聚集(30). 肌浆网状组织的生理功能异常似乎可能都是由于与失调性纤维肥大相关的生理应激引起的，可能是独立的。脑海中浮现的一种解释是，这些干扰可能反映了钙处理问题的不同方面。强直刺激过程中张力的衰减以及最大同分异构收缩力的增加(P（P）t吨)/P（P）o（o）肌浆网的比例和增殖可能与肌抑制素缺乏肌肉中钙稳态的改变有关。这个假设也很符合线粒体的缺乏，线粒体可以充当骨骼肌中快速钙吸收的角色(31)以及为钙摄取到肌浆网中提供ATP；他们缺乏Mstn公司−/−很可能刺激肌浆网的代偿性形成。有趣的是，在此处使用的参考野生型年长雄性野生型小鼠和各种近交和远交实验室小鼠品系的肌肉中发现了少量管状聚集体(32,33)但野生型女性没有，这与野生型女性肌肉中肌肉抑制素水平高于男性有关(34).
我们的扭体试验显示，肌抑制素缺乏的肌肉收缩速度加快，松弛时间缩短，这可以通过肌抑制蛋白缺乏的肌肉中观察到的向快速糖酵解纤维的纤维类型转换来充分解释。或者Mstn公司−/−野生型小鼠可能会更快地摄取系列弹性成分，并可能作为另一个促成因素，诱导更快的抽搐动力学。此外，扩张的肌浆网在形态上以管状集合体的形式变得明显，这可能是导致钙更快释放和重新摄取的原因，从而解释了抽搐动力学的差异。然而，其确切作用尚待确定。
目前对肌肉生长抑制素的兴趣集中在对这种细胞因子进行治疗性阻断以增加肌肉的大小和强度，从而抵消与肌肉减少和肌营养不良相关的肌肉无力。尽管许多研究表明，这种策略对携带中密度纤维板肌营养不良症的临床改善基础尚不清楚，实验方案也很短。尽管如此，目前正在进行肌肉抑制素阻断剂的人体试验。我们关于非肌病小鼠的数据，虽然与之前关于中密度纤维板小鼠，确实对肌肉生长抑制素阻断剂的确切生物学效应提出了疑问，并建议迫切需要进一步阐明受此类治疗影响的肌肉生长和分化机制。
材料和方法
动物。
Mstn公司−/+C57BL/6背景下的创始人繁殖对是Se-Jin Lee（马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学）的一份礼物(1). Myostatin基因敲除小鼠和野生型小鼠（C57BL/6）在皇家兽医学院的动物设施中繁殖。菌落建立后，对小鼠进行筛选，结果表明小鼠没有常见的啮齿动物传染病。对2个月和7个月大的雄性进行了研究Mstn公司−/−雄性C57BL/6小鼠和10个月大的雌性Mstn公司−/−和雌性C57BL/6小鼠，除非另有说明。本研究中对动物进行的所有调查都事先获得了机构伦理批准委员会（皇家兽医学院）的批准。动物的饲养遵循英国内政部制定的指南。动物按照PPL/70/5218（英国内政部）许可证进行饲养。
此外，还使用了BEH亚系小鼠(35). BEH系是纯合子契约突变(36)并编码为Mstn公司Compt−dl1ABC公司(37,38). 来自BEH系的小鼠与来自Berlin Low系（BEL）的小鼠杂交，将野生型引入BEH小鼠，以分离野生型和契约该亚系中的等位基因，编码BEH公司C类/+(35). 杂合小鼠贝赫C类/+从BEH品系中反复回交到小鼠，以重建该品系的高生长背景，该品系已被长期选择用于高生长(35). 这里使用的小鼠是在完成五代回交（包括F1)平均98.44%的BEH系遗传背景得到重建。这一代的杂合子小鼠交配相互之间为本研究生产实验动物[三种基因型：纯合子紧密型(BEH公司信用证)，杂合子(BEH公司C类/+)，野生型纯合子(BEH公司+/+)].
生理学研究。
进行了所有功能研究在体外EDL肌肉。达到峰值张力的时间（收缩时间）和半松弛时间（抽搐松弛阶段最大力和半最大力之间的时间），t吨½第页)已确定。最大值P（P）o（o）由频率-力关系的平台确定。有关详细信息，请参阅SI表3.
组织学。
对每一块EDL肌肉进行称重，然后安装在OCT（VWR，Poole，U.K.）中，并在液氮中冷却的融化异戊烷中冷冻。在低温恒温器上切下中腹部的肌腱测微计横截面。对连续切片进行H&E、改良Gomori三色、SDH、NADH–四氮唑和细胞色素氧化酶染色。
免疫组织化学。
使用的抗体和浓度列表在SI文本进行双重染色以描述肌球蛋白重链（MHC）IIa和IIb的表达。采用三重染色法检测MHC-IIb、层粘连蛋白-γ1、SERCA1或DHPR的表达。有关详细的免疫组织化学协议，请参见SI表3.
电子显微镜。
样品（1 mm三)首先在4%戊二醛中的0.1 M二羧酸缓冲液（pH 7.2）中固定1.5–2 h，然后在缓冲液中洗涤30 min，在1%四氧化锇中的0.1 M二羧酸缓冲器中固定1 h。然后将样品脱水并用环氧丙烷渗透，然后将其包埋在araldite中。使用徕卡Ultracut（德国本谢姆徕卡）切割半薄（1μm）和超薄（70nm）切片。切片用醋酸铀酰染色，并根据标准方案与柠檬酸铅进行对比，并在Jeol JEM-1011上查看（日本东京Jeol）。线粒体数量是根据先前公布的方法，在放大×3000倍的显微照片上使用点计数法测定的(39,40).
图像分析。
使用成像软件（Leica QWin）从EDL肌肉中腹区域的H&E染色横截面确定总横截面积。
致谢
我们感谢Elaine Shervill、Helen Smith、Lucy Feng和Angelika Zwirner提供的出色技术援助。我们感谢李世进教授为我们的Mstn公司−/−并向西蒙·休斯博士（伦敦国王学院）提供抗体。这项工作由MDA USA（MDA3870拨款给H.A.）、Wellcome信托基金（066195和078649拨款给R.M.和K.P.）以及法国Monégasque Contre les Myopathies和Duchenne Parent Project（M.S.）协会资助。
缩写
| 老挝国家电力公司 | 指长伸肌 |
| P（P）o（o） | 最大强直张力 |
| SDH公司 | 琥珀酸脱氢酶。 |
工具书类
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