鲜血。2007年2月15日；109(4): 1433–1441.
造血
巨核细胞系起源于成血管细胞前体，是原始造血和最终造血的组成部分
,1 ,1 ,1,2 ,三 ,1 ,4 ,三和1,2
凯伦·凯伦·德·梅西·本特利
4纽约罗切斯特大学医学中心病理学和实验医学系
1儿童生物医学研究中心，
2儿科，
三生物医学工程系
4纽约罗切斯特大学医学中心病理学和实验医学系
收稿日期：2006年6月28日；2006年10月3日接受。
- 补充资料
【补充表】
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摘要
在成人中，血小板来源于单潜能巨核细胞集落形成细胞（Meg CFCs），该细胞来源于双潜能巨核细胞/红系祖细胞（MEP）。为了更好地确定巨核细胞谱系的发育起源，在小鼠胚胎中检测了巨核细胞生成的几个方面，包括祖细胞、成熟的巨核细胞和循环血小板。我们发现，原肠胚形成早期的大多数血管母细胞前体都含有巨核细胞潜能。结合祖细胞分析和免疫组织化学分析，我们在卵黄囊中发现了2波MEP，与原始和明确的红系血统相关。原始MEP在E7.25出现，同时出现巨核细胞和原始红系祖细胞，表明原始造血本质上是胆道性的。随后，明确的MEP随着Meg-CFC和明确的红系祖细胞在卵黄囊中扩张。胚胎中的第一个GP1bβ阳性细胞在E9.5的卵黄囊中被发现，而在E10.5开始的胚胎血流中检测到大的高度网状血小板。此时，卵黄囊中巨核细胞祖细胞的数量开始减少，而胎儿肝脏中的巨核细胞原细胞数量开始增加。我们得出的结论是，巨核细胞谱系最初起源于原肠胚形成早期的成血管细胞前体，在造血向胚胎内转移之前，与卵黄囊中的原始和最终红系谱系密切相关。
介绍
在胚胎外卵黄囊的血岛中，原肠胚形成开始后不久，小鼠胚胎中的造血开始。1这里，第一个造血前体和内皮前体的紧密空间和时间排列长期以来表明，这两种细胞类型都起源于一个共同的血管母细胞祖细胞。2这一假设得到了体外培养胚胎干细胞研究的支持三–7最近，在小鼠胚胎中鉴定出具有内皮细胞、原始红系细胞、明确红系细胞和多髓系细胞潜能的原始克隆形成细胞（BL-CFCs），证实了这一点。8原始红系祖细胞（EryP-CFCs）在胚胎期7.25至9.0天（E7.25-E9.0）出现一个短暂的池，并产生大的、有核的βH1-珠蛋白表达的红系细胞，在成熟时最终去核。9–11随后，第二波重叠的明确的红系祖细胞（爆裂形成单位-红系[BFU-Es]）出现在卵黄囊中，与后来在胎儿肝脏和成人骨髓中发现的类似，伴随着肥大细胞、粒细胞、巨噬细胞、，和多潜能高增殖潜能集落形成细胞（HPP-CFCs）。9,10,12,13这些发现表明，卵黄囊造血祖细胞的最终波是多系的，而最初的原始波是单系的，特别局限于原始红系。14
在成人骨髓中，巨核祖细胞（Meg-CFCs）产生大的多核前体细胞，产生盘状无核血小板，这是止血的关键组成部分。血小板何时开始在小鼠胚胎中循环尚不清楚。在E7.5和E10.5之间的卵黄囊中发现了巨核细胞祖细胞，15,16然而，它们与原始或最终造血的关系尚未明确确立。早在E7.5蛋黄囊中就存在Meg-CFC，这增加了巨核细胞命运可能与原始红系血统有关的可能性15和其他卵黄囊衍生的谱系一样，在成血管细胞水平上被指定为造血的原始和决定性波。
成人巨核细胞系与红系血统密切相关。这些谱系共享几个生长因子受体，包括促红细胞生成素和血小板生成素受体，17–19以及各种转录因子，包括GATA-1、FOG-1、GATA-2和NF-E2。20–25重要的是，巨核细胞和红系血统共享一个共同的巨核细胞/红系祖细胞（MEP）。这种双潜能祖细胞的初步证据来自体外培养的造血集落，该集落由巨核细胞和红细胞组成26,27并且是从单个细胞中衍生出来的。28从成年骨髓、贫血小鼠脾脏和只产生巨核细胞和红细胞的胎肝中分离出祖细胞，进一步证明了双能MEP的存在。29–33
考虑到巨核细胞和红细胞系在胎儿和成人中的密切关系，我们研究了巨核细胞系的早期个体发育及其与小鼠胚胎中原始和最终红细胞生成的特殊联系。在这里，我们表明巨核细胞潜能在原肠胚形成期间从血管母细胞前体开始，并且在原肠胎形成早期出现独特的双潜能“原始”MEP，与单潜能原始红细胞和巨核细胞前体一致。随后，在胎儿肝脏形成之前，第二波“明确的”MEP在卵黄囊中出现。早在E10.5时，血液中就出现了大的高度网状的胚胎血小板，这表明它们起源于这些卵黄囊衍生的巨核细胞祖细胞。
材料和方法
纸巾收集
CO杀死定时怀孕的ICR小鼠（Taconic，Germantown，NY）2吸入。如前所述，从分期胚胎中分离卵黄囊和胚胎固有组织10并在PBS/EDTA中的胰蛋白酶（0.25%；Worthington，Lakewood，NJ）的1:30稀释液中解离2-5分钟，或用胶原酶/分散酶（Roche，Indianapolis，in）处理，如所述，34用于超过45个体节对（sp）的卵黄囊和胚胎本身。外周血和胎肝也分别在11sp和35sp后分离。将细胞重新悬浮在IMDM（Invitrogen，Carlsbad，CA）的10%血浆衍生血清（PDS；Animal Technologies，Tyler，TX）中，然后通过排除台盼蓝（CellGro，Herndon，VA）检查细胞的生存能力。如前所述，通过联苯胺染色（西格玛-阿尔德里奇，圣路易斯，密苏里州）计算每个组织超过4 sp的红细胞（RBC）数量。35所有动物实验均由罗切斯特大学动物资源委员会批准。
成血管细胞分析
血管母细胞分析如前所述进行。8通过35μm尼龙网（BD Biosciences，San Jose，CA）过滤来自分期胚胎的分离细胞，并将其接种到IMDM中的65%甲基纤维素（Invitrogen）中，362 mM谷氨酰胺（马里兰州盖瑟斯堡Gibco-Brl），4×10−4单硫甘油（MTG；Sigma-Aldrich）、10%PDS、300μg/mL转铁蛋白（Sigma-Aldrich），1 ng/mL LIF（Chemicon International，Temecula，CA）、5 ng/mL VEGF、50 ng/mL胰岛素样生长因子、5 ng/mL IL-6、10 ng/mL TPO6（均购自新泽西州洛基山Peprotech）和25%的D4T条件培养基（来自D4T细胞）培养4天。单个成血管细胞集落在液体扩张培养基中重新植入37（10%PDS，10%马血清[Invitrogen]，2 U/mL EPO[Amgen，West Greenwich，RI]，5 ng/mL VEGF，10 ng/mL IGF-1，10 ng/mL bFGF，100 ng/mL SCF，1 ng/mL IL-3[均购自Peprotech]，2 mM谷氨酰胺，4.5×10−4M MTG）并延长2至3天。在胶原培养物中检测非粘附细胞的造血祖细胞活性（如“胶原培养物”所述）。剩余的贴壁细胞群在膨胀培养基中再培养7天，然后固定在4%多聚甲醛中。所有培养物均保持在37°C的5%CO中2.
逆转录聚合酶链反应
cDNA是根据制造商的说明（SuperScript III First-Strand[Invitrogen]；RNase-Free DNase Set[Qiagen，Valencia，CA]；PicoPure RNA Isolation Kit[Arcturus Bioscience，Mountain View，CA]），从单个原始红细胞集落中提取的DNA酶处理RNA制备而成的。根据制造商的说明，使用Advantage PCR Kit&polymerase mix（Clontech，Mountain View，CA），使用为βH1-珠蛋白、β1-珠蛋白、乙酰胆碱酯酶、血管性血友病因子和粒细胞集落刺激因子受体（G-CSFR）设计的引物，进行逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）。引物序列见表S1，可从血液网站；请参阅在线文章顶部的补充表格链接。
胶原蛋白培养
将分离的细胞悬浮在Megacult替代品和30%胶原蛋白中（StemCell Technologies，加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华），36加入10 ng/mL IL-3、20 ng/mL IL-6、100 ng/mL SCF、3 ng/mL GM-CSF（均来自Peprotech）和2 U/mL EPO，或加入10 ng/mL IL-3，20 ng/mL IL-6，50 ng/mL TPO和50 ng/mL IL-11（Peprotecch），并将其镀在装有隔间的玻璃载玻片上（Nalge Nunc，Rochester，NY）。培养物保持在37°C的5%CO中27或10天，然后用聚丙烯垫片（P/N 66548；纽约州东山市鲍尔生命科学公司）吸干多余液体，并在冷丙酮中固定5至10分钟。如前所述进行乙酰胆碱酯酶染色。36
组织切片
胚胎被植入Tissue-Tek Cryomolds和OCT包埋介质（荷兰佐特沃德Sakura）中，进行snap冷冻，并在−10°C下在Microm HM 550 OMVP低温恒温器（密歇根州卡拉马祖市理查德·艾伦科学公司）上切取10-μm厚的切片。
免疫组织化学
除非另有规定，否则抗体在封闭缓冲液（1.5%山羊血清/PBS；加利福尼亚州伯林盖姆Vector Laboratories）中稀释。所有血清、次级抗体、ABC试剂盒、Vector Red、Nickel DAB和Vectashield均购自Vector Laboratories。使用碱性磷酸酶修饰抗原的双抗原标记方案对培养物进行染色（ABC试剂盒；Vector Laboratories38). 简言之，将固定胶原蛋白培养物在3%Triton-X100（Sigma-Aldrich）中渗透1小时或直接封闭。首先，用βH1-珠蛋白（1:250）标记红细胞11)以及山羊抗兔生物素（1:250）或Ter119（1:200；BD Pharmingen，Franklin Lakes，NJ）和山羊抗鼠生物素（1:1500），并根据制造商的说明在ABC扩增后在硝基蓝四氮唑/BCIP（NBT/BCIP；罗氏）中开发（Vector Laboratories）。其次，用GP1bβ（1:600；Emfret Analytics，Würzburg，Germany）或CD41（1:200；BD Pharmingen）标记巨核细胞细胞，并用ABC修饰的山羊抗鼠生物素在载体红中开发。所有抗体在室温下孵育30分钟。培养物在95%乙醇中固定，并在ddH中再水合2O、 然后安装。将切片置于室温下，在冷丙酮中固定，在1x Tris缓冲盐水中再水化，并在乙酸中封闭，然后是10%的山羊和2.5%的小鼠血清。GP1bβ和山羊抗鼠碱性磷酸酶抗体（1:500）在5%山羊血清中稀释，分别孵育60分钟和30分钟，并在BCIP/NBT中培养。用Triton-X中0.1%的Fraction V BSA（Sigma-Aldrich）封闭来自成血管细胞培养物的对甲醛固定细胞，分别与抗PECAM（1:10，BD Pharmingen）和山羊抗鼠HRP（1:500）孵育1小时，用Nickel DAB显影，然后固定在4%的多聚甲醛中。在去除所有抗体、第一和第二初级抗体以及第一和第二二次级抗体后，进行对照实验。
循环血小板的尺寸测量
在含有12.5μg/mL肝素的PB-1中收集E10.5至E15.5胎儿的外周血，并在700℃下离心克持续5分钟以产生富含血小板的上清液。血小板在PBS中的5%胎牛血清（Sigma-Aldrich）中稀释10倍，用抗-GPV-FITC（1:200；Emfret Analytics）染色20分钟，清洗，悬浮在丙酮中的1%Pierce Surfasil Silconizing Fluid（Pierce Chemical，Rockford，IL）中，安装在带有60倍物镜的尼康隔膜倒置显微镜（NA 0.85；尼康，梅尔维尔，纽约）台上的硅涂层细胞室中，并记录在MTI CCD72S摄像机（索尼，纽约）上。使用公共领域NIH Image程序测量血小板直径(http://rsb.info.nih.gov/nih-image/).
透射电子显微镜
富含血小板的部分在4°C下在0.1 M磷酸盐缓冲的2%戊二醛中固定过夜，在缓冲液中洗涤，在0.1 M磷酸缓冲的1%四氧化锇中后固定30分钟，洗涤，并在2%琼脂糖中捕获。通过分级系列的乙醇将颗粒脱水至100%，转化为环氧丙烷，并用epon/araldite环氧树脂混合物渗透，嵌入并在70°C下聚合2天。将薄片（70 nm）放置在200目铜/铑网格上，并用含水乙酸铀酰和柠檬酸铅染色。使用日立7100透射电子显微镜（日本东京）在75 kv的加速电压下对格栅进行检查。使用MegaView III相机和AnalySIS软件（科罗拉多州莱克伍德Soft-Imaging System）拍摄数字图像。
循环血小板的流式细胞术分析
在对被杀小鼠心脏穿刺后，用1毫升肝素注射器收集成年血液。如前所述采集胎儿和新生儿外周血。11将血液稀释在2至3体积的Tyrode缓冲液和1体积的PBS加1μg/mL噻唑橙（Sigma-Aldrich）、2.5μg/mL Hoechst 33342（Molecular Probes，Eugene，OR）、1μL抗CD41-PE（BD Pharmingen）和抗Ter119-APC（eBioscience，San Diego，CA）中，并在37°C下培养20分钟。细胞在PBS中稀释2倍，并立即在BD-LSR-II流式细胞仪（BD Biosciences）上进行分析。对样品进行补偿，并与未染色对照品进行比较。如图所示和所述选择血小板门染色成人血液中的网织红细胞用于设置噻唑橙信号的阈值。使用FlowJo软件6.1.1版（加利福尼亚州斯坦福大学Tree Star）分析流式细胞术数据。
胎儿血小板高度网状。（A） 成人和胎儿血液的流式细胞术分析。通过正向和侧向散射参数（左侧面板）、Ter119和Hoechst染色缺失（中间面板）和CD41染色（右侧面板）来识别血小板部分。噻唑橙阳性血小板按“材料和方法”所述进行门控。（B）E11.5至E15.5胎儿（■）、母血（■），新生儿（■）和非妊娠成年小鼠（□）中网状血小板的平均百分比（+SEM）。分析了3个同窝婴儿（E11.5、E14.5和新生儿）、3个单独实验（E12.5）中的3个胎儿、2个单独实验中的4个胚胎（E13.5）或单个胎儿（E15.5）的胎儿血样。对妊娠第13.5至15.5天的一份样本、11.5至12.5天的三份样本以及5份独立的非妊娠成人样本的成人血液进行分析。（C） 未经处理的血小板和经10μg/mL RNase A处理的血小板中噻唑橙的平均荧光（±SEM）。
血小板核糖核酸酶治疗
如Matic等人所述，对血小板进行RNase治疗。39胎儿血液在80℃离心10分钟克富含血小板的上清液在1%多聚甲醛中以1:10稀释，并在室温下固定30分钟。离心后（在1200下离心10分钟克)，将细胞重悬于PBS中，并在渗透缓冲液（10mM Tris，pH 7.5，20mM NaCl，1mM EDTA，50%甘油，0.1%Triton-X；Sigma-Aldrich）中以1:10稀释，加入和不加入RNase（10μg/mL终浓度）。添加Ter119-APC和CD41-PE，培养血小板15分钟，然后用一体积的噻唑橙（最终浓度为1μg/mL）稀释，再培养15分钟。细胞在PBS中稀释2倍，并立即通过流式细胞仪进行分析。使用FlowJo软件测定Ter119-APC阴性、CD41-PE阳性血小板组分的平均噻唑橙信号。
摄影
分别用Eclipse TE 2000-S显微镜（尼康10×、20×或40×物镜，NA分别为0.30、0.40和0.60）和Optiphot显微镜（尼肯10×、20x或40×物镜，NA为0.5、0.75和0.85）观察免疫染色集落和组织切片，并使用SPOT RT-slider数码相机拍摄（诊断仪器，密歇根州斯特林高地）。使用Fovea Pro插件（Reindeer Graphics，北卡罗来纳州阿什维尔）在Photoshop（加利福尼亚州圣何塞市Adobe）中对图像进行透镜缺陷校正和亮度/对比度优化处理。
结果
巨核细胞谱系来源于成血管细胞前体
最近有研究表明，原始和明确的红系以及多髓系起源于原肠胚形成期间出现在小鼠原始条纹中的血管母细胞前体。8我们询问成血管细胞前体是否也含有巨核细胞潜能。将从中原始条纹到中神经板小鼠胚胎的细胞接种到半固体培养基中，共有66个具有BL-CFC形态的菌落(Ai）从49个胚胎移植到扩张培养基中。其中39个重新移植的菌落扩大形成圆形的非粘附细胞，覆盖在平坦的PECAM阳性粘附细胞上(Aii，C）。有趣的是，预板形成40,41在培养中扩增的39个菌落中，有29%的菌落被检测到，这表明巨核细胞在这些培养物中正在迅速成熟(B） ●●●●。扩张后，将非粘附细胞植入胶原蛋白中，以检测造血祖细胞潜能。用βH1-珠蛋白和GP1bβ抗体分别对产生的菌落进行染色，以鉴定原始红细胞和巨核细胞(D） ●●●●。GP1bβ标记细胞和前血小板延伸(Dii），与其在巨核细胞和血小板中的已知表达一致。42如前所述，8扩张的成血管细胞培养获得的祖细胞成分存在明显的异质性(E） ●●●●。在39个重新培养成胶原蛋白的扩张型CFC菌落中，64%检测到Meg-CFC，16%检测到EryP-CFC。86%的胶原培养物中也发现了单个GP1bβ阳性细胞。这些结果表明，原肠化小鼠胚胎中的大量血管母细胞前体含有巨核细胞潜能。
巨核细胞潜能来源于成血管细胞前体。（A） 来自E7.5小鼠胚胎的成血管细胞衍生集落（i）。在液体膨胀培养基中培养3天后，从血管母细胞衍生的集落中获得粘附细胞和非粘附细胞（ii）。（B） 在液体培养基中培养3天后，从成血管细胞衍生的集落分化出的细胞的前血小板形成（i-ii）。（C） 在液体膨胀培养基中培养10天后，粘附细胞群中的PECAM阳性细胞（箭头）。（D） 将扩增的非粘附细胞放入祖细胞分析中，形成原始红细胞和巨核细胞集落。EryP-CFC衍生菌落包含βH1-珠蛋白（i）阳性的细胞，Meg-CFC衍生的菌落包含GP1bβ（ii）阳性的胞和前血小板延伸（箭头）。（E） 10个单个成血管细胞集落在液体培养中的造血潜能扩大。显示了EryP-CFCs、Meg-CFCs和巨核细胞（Meg细胞）的数量。比例尺代表10μm。
巨核细胞祖细胞起源于卵黄囊
接下来，我们通过检查阶段小鼠胚胎中巨核细胞祖细胞的时间和空间出现，询问在成血管细胞中发现的巨核细胞潜力是否在胚胎中实现。通过乙酰胆碱酯酶染色鉴定源自小鼠Meg CFCs的结肠(A） ●●●●。43在原始条纹早期没有发现巨核祖细胞（E6.5；A） 与原肠胚形成开始时中胚层细胞对造血命运缺乏承诺一致。10在神经板早期至中期，检测到巨核祖细胞的数量较低但可重复。在接下来的48小时内，Meg-CFC仅在卵黄囊内增加。循环开始后，在胚胎本身和血流中发现少量Meg-CFC。到E10.5时，卵黄囊中巨核祖细胞的数量减少，而胎肝中巨核细胞的数量增加。
胚胎造血过程中出现Meg-CFC和2个新的双能MEP（A）分期从单个胚胎组织中生长的乙酰胆碱酯酶阳性（巨核细胞）菌落数量（+SEM）。插图（i）显示乙酰胆碱酯酶阳性菌落。（B） 红细胞和巨核细胞祖细胞衍生集落的免疫组织化学染色。（上图）用原始红细胞特异性βH1-球蛋白（蓝色）和巨核细胞特异性GP1bβ（粉红色）抗体染色的神经板期培养物中的原始红细胞（i）、巨核细胞（ii）和双能原始MEP（iii）集落。（底部）用泛红系Ter119（蓝色）和GP1bβ（粉红色）抗体染色的E9.5至E10.5卵黄囊中的红细胞（v）、巨核细胞（vi）和双潜能最终MEP（vii）集落。面板iii和vii中的方框区域突出显示了面板iv和viii中分别显示的100×处的前板形成。箭头表示面板ii和vi中的前板形成。比例尺表示10μm。（C） 用免疫组织化学法测定电镀全胚胎（PS-LNP）和卵黄囊（HF-46 sp）原始红细胞、巨核细胞和双能原始MEP集落的平均数（+SEM）。（D） 原始MEP源于神经板阶段胚胎的集落包含βH1-珠蛋白和CD41阳性细胞。（E） 来自4至5 sp卵黄囊稀释系列的βH1-球蛋白/GP1bβ-双阳性菌落数量（+SEM），一式三份。（F） 由每个组织的GP1bβ染色菌落确定的Meg-CFC的时空分布。（G） 最终MEP的时空分布，由每个组织的Ter119/GP1bβ双阳性菌落确定。sp表示体节对；PS，预模拟条纹；MS，中等原始条纹；LS，晚期原始条纹；ENP，早期神经板；MNP，中间神经板；LNP，晚期神经板；HF，头部折叠；和LHF，晚期头部折叠。发育阶段以下提供了大致的胚胎日数（E）。
Meg-CFCs在神经板期（E7.5）的出现及其在20至30 sp胚胎卵黄囊中的扩张（E9.5）表明巨核细胞谱系在时间和空间上与原始红细胞生成和最终红细胞生成重叠。10为了更好地了解早期胚胎发育期间巨核细胞和红系血统的关系，我们将胶原蛋白的祖细胞分析与免疫组织化学相结合，以确定含有红系（βH1-珠蛋白阳性或Ter119-阳性）和巨核细胞（GP1bβ-阳性）细胞的集落。抗βH1-珠蛋白抗体标记原始但不明确的红细胞。11来自小鼠胚胎的红系和巨核细胞集落示例如所示Bi-ii，v-vi。
Meg-CFCs和EryP-CFCs首次在原始条纹期中晚期胚胎（E7.25）中检测到。Meg CFCs和EryP CFCs在卵黄囊中的数量均增加，并在7至8个sp阶段达到峰值（E8.25；C） ●●●●。随后原始红系祖细胞的急剧下降与Meg CFCs在10至14sp之间几乎翻倍有关(C） ●●●●。蛋黄囊中的Meg-CFCs持续增加，在22至24 sp之间达到峰值（E9.5），下降到46 sp的低水平。蛋黄囊内的Meg-FCs峰值与蛋黄囊的BFU-Es、Mac-CFCs、GM-CFCs和Mast-CFCs峰值在时间上一致。10乙酰胆碱酯酶染色和GP1bβ免疫组织化学产生的数据相似(A、 并表明卵黄囊中的巨核细胞生成在时间和空间上与红细胞生成的原始和最终波相一致。这些结果增加了早期胚胎中巨核细胞和红系血统共享一个共同祖细胞的可能性。
双潜能巨核细胞/红系祖细胞（MEP）与原始造血相关
在巨核细胞和红细胞集落的免疫组织化学分析中，我们发现集落包含原始红细胞（βH1-珠蛋白阳性）和巨核细胞（GP1bβ阳性）细胞(Biii）。这些菌落的细胞组成与它们来自巨核细胞/原始红细胞祖细胞（原始MEP）的起源一致，之前在小鼠胚胎中未描述的双潜能祖细胞。原始MEP产生的集落大小在10到50个细胞之间，通常包含比巨核细胞多几倍的红系细胞。巨核细胞直径通常小于15μm，仅含1至2个细胞核。原始MEP衍生的菌落在培养9天后成熟，这与原始MEP比单能Meg-CFCs和EryP-CFCs更不成熟的概念一致，后者在体外培养5至7天后成熟。巨核细胞在菌落内的成熟通过前血小板的产生而明显(比夫）。为了确定原始MEP是否表现为克隆细胞，我们对连续稀释细胞中的βH1-globin/GP1bβ阳性集落数进行了评分，从4到6 sp(E） 和10至14茶匙蛋黄囊（未显示）。在这两个阶段，细胞板和双阳性集落评分之间存在线性关系，表明βH1-globin/GP1bβ阳性集落来自单个细胞。
与双电位pMEP的存在一致，我们在神经板期胚胎中检测到双重阳性βH1-珠蛋白/CD41集落(D） 频率与βH1-globin/Gp1bβ阳性集落相似。此外，对单个原始红细胞集落的基因表达研究表明，48个集落中的37个集落不仅包含预期的βH1-和β1-珠蛋白转录物，还包含与巨核细胞生成相关的转录物（乙酰胆碱酯酶和/或血管性血友病因子）。没有一个菌落含有粒细胞标记物G-CSFR的可检测转录物（数据未显示）。这些数据进一步证明，原始MEP在小鼠胚胎卵黄囊原肠胚形成期间出现。
我们研究了小鼠个体发育过程中原始MEP的时空动力学，发现它们首先出现在中原始条纹胚胎中，以及单潜能巨核细胞和原始红系祖细胞(C） ●●●●。原始MEP数量随着Meg-CFC和EryP-CFC的增加而增加，并在4-6个阶段达到峰值。与EryP-CFCs一样，原始MEPs也下降了15至19 sp(C） 并且总是在空间上局限于卵黄囊（数据未显示）。我们的数据表明，原始造血并不局限于原始红系血统，而是胆道性的。
双能MEP与卵黄囊向胎肝过渡期间的最终造血相关
原始MEP与原始红系祖细胞瞬态波的关联促使我们探索巨核细胞与红系谱系的关系，因为BFU-Es随后出现在E8.25和E10.5之间的卵黄囊中。10与胚胎珠蛋白在原始红细胞中的限制表达不同，目前还没有已知的基因在最终红细胞中特异表达。因此，我们使用泛红系Ter119抗体在发育后期继续追踪红系祖细胞(Bv，vii）。我们分析了原始红系祖细胞在15-19 sp（E9.0）后降至低水平的时间框架。在此阶段，Ter119/GP1bβ阳性的患者增加了13倍(Bvii）卵黄囊中βH1-globin/GP1bβ阳性菌落（比较MEPC带G） 。使用该分析系统，我们跟踪了15 sp（E9.0）和50 sp（E11.5）之间分期胚胎中Meg CFCs和“确定”MEP的空间和时间动力学，如图所示F和G、 分别是。
最初（15-17 sp），Meg-CFC和MEP均位于卵黄囊内。随着发育的进行，这两种祖细胞在卵黄囊中的数量都在增加，在循环中的数量也在增加。在31至35 sp时，Meg-CFCs和明确的MEPs在卵黄囊中达到峰值。在此发育阶段，肝脏中也检测到少量Meg-CFC和明确的MEP(F-G）。到E11.5时，随着卵黄囊中Meg-CFC和最终MEP数量的减少，肝脏已成为巨核细胞祖细胞扩增的主要部位。这些数据表明，卵黄囊衍生的巨核细胞祖细胞是植入新形成的肝脏雏形的首批造血元件之一。为了确定明确的MEP和Meg-CFC是否优先与卵黄囊或胚胎内部位相关，或者，如果它们在整个血液中自由循环，我们比较了胚胎内和胚胎外区域的祖细胞数量与循环（联苯胺阳性）红细胞数量。如果胚胎内祖细胞/红细胞与胚胎外祖细胞/RBC在组织间自由循环，则两者的比率将等于1。35如所示巨核祖细胞优先与卵黄囊结合，直至31sp，之后才优先与胚胎本身结合。这一转变的时间与肝脏作为造血器官的发育相一致44并提示卵黄囊衍生的巨核细胞祖细胞为新生胎肝播种。随后，Meg-CFCs在胎儿肝脏中的扩张可能反映了来自AGM-衍生造血干细胞的Meg-CFC的贡献，这在E11开始的肝脏中很明显。10,45,46我们发现，肝脏中含有大多数Meg-CFC和胚胎内区域的明确MEP(F-G）。
胚胎外（卵黄囊）与胚胎内区域的祖细胞富集。与卵黄囊相比，所有胚胎内组织中原始MEP、明确MEP或单潜能Meg-CFC造血祖细胞（通过免疫组织化学测定）和成红细胞的数量。折叠富集计算为胚胎内祖细胞与成红细胞的比率除以卵黄囊祖细胞与红细胞的比例。35对单个实验的组织进行分组，并按阶段平均（±SEM）。。
巨核细胞首先在卵黄囊中被检测到
众所周知，在E7.25开始的卵黄囊中发现的原始红系祖细胞迅速生成E8.5形态上可识别的红系前体。11由于巨核细胞祖细胞与EryP-CFCs首次在同一时间和地点被检测到，我们询问巨核细胞前体是何时何地首次在小鼠胚胎中发现的。而不是使用形态学标准，47我们依靠GP1bβ的表达来鉴定巨核细胞。42E8.5时，小鼠胚胎中没有明显的GP1bβ阳性细胞（数据未显示）。首次在E9.5中仅在卵黄囊中检测到罕见的GP1bβ阳性细胞(; E9.5卵黄囊）。胚胎本身不含阳性细胞，而周围的母亲蜕膜组织含有大量GP1bβ阳性血小板(; E9.5胚胎本身和蜕膜）。通过E10.5，GP1bβ阳性细胞经常在2-6细胞簇的卵黄囊中被识别(; E10.5卵黄囊）。在胚胎内血管和发育中心脏的腔室中也发现了巨核细胞。E10.5时，肝脏中检测到少量GP1bβ阳性细胞，这与Matsumura和Sasaki的发现一致。48通过E11.5，在胎儿肝脏中经常检测到不同大小的GP1bβ阳性细胞(; 胎儿肝脏）。随着发育的进行，肝脏中GP1bβ阳性细胞的频率较低，但体积较大。总的来说，这些发现表明，巨核细胞前体在Meg CFCs首次出现约48小时后首次出现在卵黄囊中，随后在循环和胎儿肝脏中都发现了。
巨核细胞（GP1bβ阳性细胞）在小鼠胚胎中的定位。首先在E9.5胚胎的卵黄囊中鉴定出单个巨核细胞（箭头，顶行，左面板）。E9.5胚胎本身（顶行，中间面板）未检测到GP1bβ阳性细胞。在E9.5蜕膜周围（右上图）检测到来自母亲的GP1bβ阳性血小板。在E10.5（中排），卵黄囊中可见成簇的GP1bβ阳性细胞，在循环（箭头）、主动脉壁（箭头）和胎肝（箭头）中可见胚胎内巨核细胞。GP1bβ抗体标记E11.5至E12.5胎肝中的小细胞（开放箭头）和大细胞，主要标记E13.5至E14.5胎肝中的大细胞（下排）。血小板可见于E11.5至14.5肝脏（箭头所示）。比例尺代表50μm。
早在E10.5，血小板就在胚胎血管系统中循环
E9.5卵黄囊中巨核细胞的存在表明血小板的生成可能很快开始。早在E12.5，就在小鼠胎儿的血液中发现了血小板，49–51然而，血小板何时开始在小鼠体内循环尚不清楚。为了确定血小板生成的开始，我们分析了E10.5至E15.5胎儿的外周血中是否存在血小板(A） ●●●●。首次在5胎中的2胎E10.5胚胎的混合血液中检测到少量GPV阳性的大血小板。到E11.5时，所有单个胎儿都含有循环血小板，这表明血小板在E10.5和E11.5之间释放到血液中。与成人血小板一样，胎儿血小板也是无核、盘状和双凸的(A-C）。胎儿血小板非常大，直径是成人血小板的1.6倍(A-B）。胚胎发育过程中血小板平均直径下降，血小板直径与出生时的成人血小板直径相似(B） ●●●●。通过透射电镜对E11.5、E15.5和成人血小板的超微结构进行比较，发现胎儿和成人血小板中存在α颗粒和致密颗粒，尽管E11.5血小板的α颗粒小于E15.5和成年人血小板中的α颗粒(E） ●●●●。E11.5血小板最显著的特征是开放的泪小管系统大于成人血小板。
大血小板在胚胎和胎儿血管系统中循环（A）用抗GPV-FITC抗体对富含血小板的血液进行染色（图中为E11.5，左图），该抗体专门标记血小板，但不标记红细胞。右边显示的是E11.5、E15.5和成人外周血中的血小板示例，描绘了宽脸（顶部）和窄脸（底部）。无论细胞直径如何，所有血小板都是窄而双凸的。比例尺等于5μm。（B） E11.5至E15.5胎儿、新生儿和成年小鼠的平均血小板直径（±SEM）。每个外周血样至少检测100个血小板，除E10.5外，至少研究3个独立样本，其中2个采集的血样被检测，共检测11个血小板。（C） E11.5、E15.5和成人血小板的透射电镜图像。所有图像均在10 000倍下拍摄。泪小管开放系统（箭头）、致密颗粒（箭头）和α颗粒（α）清晰可见。
与红系中的网织红细胞类似，新形成的血小板含有RNA，可以使用核苷酸染料噻唑橙进行鉴定。52–54大约10%至15%的母亲血小板呈网状(A-B）。相反，E11.5处90%以上的血小板是网状的，这与胎儿血小板生成开始时巨核细胞前体释放的血小板相一致。这些胎儿血小板被噻唑橙染色比成人血小板高很多(A） ●●●●。用核糖核酸酶治疗胎儿血小板使噻唑橙信号降低81%(C） ，表明噻唑橙信号的大部分是由RNA引起的。55在E14.5至E15.5，网状血小板的百分比保持在约50%的升高。这可能反映了血小板生成的增加，而血小板的生成需要与不断扩大的血管体积保持一致。然而，到妊娠末期，网状血小板水平接近成人(B） ●●●●。
讨论
小鼠胚胎中的造血潜能来源于血管母细胞前体，在体外检测时可产生原始红系、明确红系和多髓系。在这里，我们发现大多数血管母细胞前体也含有巨核细胞潜能，这表明该谱系也是胚胎造血的组成部分。此外，我们发现卵黄囊中巨核祖细胞的出现在时间和空间上与原始和明确的红系血统的出现重叠。9,10通过鉴定双潜能巨核细胞/原始红系祖细胞，巨核细胞和原始红系血统的特异性联系表明，卵黄囊中的原始造血在性质上至少是胆道性的。巨噬细胞祖细胞和原始红系祖细胞的早期出现10提示原始造血也可能包含有限的髓系成分，这一点在斑马鱼胚胎中已被假定。56随后，卵黄囊中巨核祖细胞数量的增加与通过一个共同的双潜能祖细胞形成的明确的红系血统有关，这与成人的情况相同。因此，巨核细胞谱系的早期个体发育的特点不仅在于其在原肠胚形成过程中早期快速出现，而且还在于其与卵黄囊中的原始红细胞生成和最终红细胞生成密切相关。
患有唐氏综合征的儿童在新生儿时罹患短暂性骨髓增生性疾病（TMD）的风险增加，在幼儿时罹患急性巨核细胞白血病的风险增加（Gurbuxani等人57和Massey等人58). 最近研究表明，这些疾病与GATA-1转录因子（GATA-1s）的截短形式有关。59,60截断的强制表达式Gata1公司在小鼠胚胎中诱导巨核细胞大量增殖。61有趣的是，这主要发生在E9.5卵黄囊和早期（E12.5）胎肝中，表明GATA-1作用的靶细胞是这里描述的卵黄囊衍生巨核细胞祖细胞。
我们描述了小鼠胚胎中血小板生成的开始。E10.5处循环血小板的出现表明，在AGM区域首次出现成年造血干细胞时，血小板已经开始生成。46这一发现，再加上巨核祖细胞和巨核细胞分别在E7.5和E9.5的卵黄囊中首次出现，支持了这一概念，即这些第一代胚胎血小板最终来自卵黄囊。与成人血小板相比，胚胎血小板以其大尺寸、巨大的小管系统和小α颗粒而区别。有趣的是，在人类卵黄囊中发现了粒下大血小板62,63在与我们首次在小鼠胚胎中检测到血小板时相似的发育时期。
胚胎血小板的大直径可能与它们从年轻巨核细胞前体释放有关。Xu等人64研究表明，与来自成人骨髓的巨核细胞相比，来自未老化E8.5小鼠胚胎的体外培养巨核细胞具有较低的倍性。这些数据与我们的观察结果一致，即早期胎肝中存在较小的GP1bβ阳性巨核细胞，但晚期胎肝中不存在(). 在患有免疫性血小板减少性紫癜的成年人中，血小板较大与骨髓中倍性较低的未成熟巨核细胞比例增加呈正相关。65这表明胚胎巨核细胞生成和成人应激-巨核细胞形成具有一些共同特征。与红细胞一样，新释放的血小板也含有RNA，可以通过噻唑橙染色进行鉴定。52–54E11.5处的几乎所有循环血小板都是网状的，这与其最近的合成一致，而血小板的非RNA成分也可以被噻唑橙染色。55我们发现，RNase治疗后，胎儿血小板中的大多数噻唑橙信号丢失。因此，通过E15.5的网状血小板的持续高百分比表明，发育中的胎儿继续存在活跃的血小板生成素。同样，在人类中，早产儿的网状血小板水平高于足月儿。66个体发育过程中血小板大小的减少可能部分与血小板在循环中随着年龄增长而减小有关。67为了支持这一点，我们发现，与共循环非调节血小板相比，任何特定胎龄的网状血小板显示出更高的正向和侧向散射（数据未显示）。
在小鼠中，原始红系细胞比胎儿决定性红细胞大3倍，胎儿决定性红细胞是成年红细胞的两倍。11,68推测E10.5和E12.5之间的大血小板是很有趣的(A） 可能来源于原始的Meg-CFC，而E13.5至E15.5中的中等大小血小板可能来源于最终的胎儿Meg-CFCs。然而，与红细胞生成中不同的是，68由于缺乏鉴别标记，目前无法区分原始巨核细胞生成和最终巨核细胞形成的产物。胚胎干细胞体外分化时出现两次血小板生成波，表明原始和最终的梅格CFC都能生成血小板。69
E10.5和E11.5之间的血小板生成素快速启动表明妊娠期间可能需要血小板。缺乏功能性Runx1的小鼠缺乏可识别的血小板，并在妊娠中期死亡。49,50 NF-E2型–无效小鼠产生低水平的异常血小板，并在出生前保持存活，大多数动物在阴道分娩后死于出血，而非剖宫产。25,70此外，血小板生成素或其受体的基因消融会导致严重的血小板减少，但小鼠仍能存活，71,72表明低血小板数量足以维持妊娠和出生期间的生存。这些数据表明，血小板在胚胎发生过程中是必需的，可能是为了满足发育中的血管系统的需求，并在出生过程中存活下来。有趣的是，成人血小板含有血管生成因子，如VEGF73,74在体外可促进内皮细胞迁移和导管形成。75,76血小板在发育过程中是否发挥这种作用尚待确定。
致谢
这项工作得到了国家卫生研究院的资助。
我们感谢戈登·凯勒（Gordon Keller）为我们提供了D4T细胞，感谢克里斯汀·戈曼·赞吉（Christine Gorman-Zanghi）帮助我们建立了胶原蛋白巨核细胞集落分析，感谢盖尔·卡利斯（Gayle Callis）对切片组织处理的建议，感谢蒂莫西·布什内尔（Timothy Bushnell）对流式细胞术的培训和专业知识，感谢杰夫·马利克（Jeff Malik，Paul Kingsley负责采血技术协助，Ric Bauserman负责血小板显微镜检查指导。
脚注
本文的在线版本包含数据补充。
内部血液本文的分析出现在这个问题的前面。
这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，仅为了表明这一事实，根据《美国法典》第18卷第1734节的规定，本文特此标记为“广告”。
作者身份
贡献：J.T.进行了实验和智能设计、畜牧业、体外试验、组织采集、流式细胞术、RT-PCR和数据分析，并为纸张和图形的制备做出了贡献；A.K.进行了实验和智能设计、乙酰胆碱酯酶分析、数据分析和体外培养条件的技术开发；K.E.M.进行流式细胞术、数据分析、智能设计和论文准备；R.E.负责组织切片的技术开发、处理和免疫染色；R.V.对胎儿血小板直径进行数据收集和分析；K.K.L.M.-B对血小板进行了透射电镜观察；R.W.设计的血小板直径测量分析工具；J.P.是实施实验和智能设计的主要研究者，负责组织收集，并为论文准备做出贡献。
利益冲突披露：作者声明没有相互竞争的财务利益。
通讯员：詹姆斯·巴利斯，罗切斯特大学医学中心儿科系，纽约州罗切斯特埃尔姆伍德大道601号703信箱，邮编14642；电子邮件：ude.retsehcor.cmru@silap_semaj.
工具书类
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